形態(tài)學(xué)和SNP標記分析馬氏珠母貝雜交子代及其親本群體的遺傳結(jié)構(gòu)

黃景, 潘肖蘭, 許濛, 劉文廣, 張華, 何毛賢

海洋生物學(xué)

形態(tài)學(xué)和SNP標記分析馬氏珠母貝雜交子代及其親本群體的遺傳結(jié)構(gòu)

黃景1,2,3, 潘肖蘭1,2,3, 許濛1,2,3, 劉文廣1,3, 張華1,3, 何毛賢1,3

1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室, 廣東 廣州 510301; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點實驗室, 廣東 廣州 510301

馬氏珠母貝是重要的海水養(yǎng)殖貝類, 為了探究繁育親本及其子代的遺傳結(jié)構(gòu)和關(guān)系, 本研究運用多元性形態(tài)學(xué)和SNP標記對馬氏珠母貝母本深圳群體、父本海南群體和其雜交子代F1的外部形態(tài)和分子遺傳結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 3個群體的綜合判別率為72%, F1和母本群體的形態(tài)差異最小, 父本群體與母本、F1的形態(tài)差異較大。采用HRM法(high resolution melting) 應(yīng)用4個SNP位點對這3個群體進行分型, 3個群體的平均觀測雜合度o和期望雜合度e分別為0.2110~0.2879和0.3317~0.4685, F1的雜合度高于兩個親本; 平均多態(tài)信息含量PIC值為0.2643~0.3556, 呈現(xiàn)中等程度遺傳多樣性。F1與母本之間的基因流N最大(7.7701), 遺傳距離最小(0.0546), 親緣關(guān)系最近; 兩個親本之間的N最小(1.9662), 遺傳距離最大(0.1759)。rs8位點可以判別兩個親本群體, 可作為特異性的標記。該結(jié)果可以為馬氏珠母貝群體遺傳結(jié)構(gòu)鑒別、育種群體管理提供指導(dǎo)。

馬氏珠母貝; 遺傳學(xué); 遺傳結(jié)構(gòu); 形態(tài)學(xué); SNP

馬氏珠母貝 () 又稱合浦珠母貝, 是中國海水珍珠產(chǎn)業(yè)主要養(yǎng)殖貝類, 具有極高的經(jīng)濟價值, 在中國廣東、廣西和海南省沿海分布廣泛。然而, 近年來馬氏珠母貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)面臨著疾病暴發(fā)(Miyazaki et al, 1999)、環(huán)境污染(Liu et al, 2012)、高死亡率(張莉, 2007)、近親繁殖(Wada et al, 1994)等一系列問題, 海水珍珠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受阻, 造成極大的損失(Hine et al, 2000)。上述問題的有效解決有助于實施種質(zhì)創(chuàng)制和良種培育, 而對群體遺傳結(jié)構(gòu)的監(jiān)測、鑒別則是育種過程的重要環(huán)節(jié)。

在馬氏珠母貝傳統(tǒng)育種中, 常常通過外部形態(tài)差異對群體進行判別并指導(dǎo)育種, 杜曉東等(2002)發(fā)現(xiàn)北部灣種群和大亞灣種群在殼長、殼寬、殼寬系數(shù)上差異顯著; 顧志峰等(2009)通過殼寬系數(shù)和殼色對三亞野生種群和印度養(yǎng)殖種群進行鑒別。谷龍春等(2010)利用殼長、殼高、殼寬對不同群體(海南三亞群體、廣西北海群體和廣東徐聞群體)雙列雜交子代家系進行判別, 篩選出優(yōu)良親本。而僅僅通過形態(tài)區(qū)分群體指導(dǎo)育種時常常受到多基因調(diào)控和環(huán)境影響, 因此有必要引入分子標記輔助育種。

近年來, 越來越多的分子標記被用來分析馬氏珠母貝的種質(zhì)資源和遺傳結(jié)構(gòu), 例如內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列(internal transcriptional spacing sequence, ITS) (喻達輝等, 2005)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP) (Yu et al, 2006)、隨機擴增多態(tài)性DNA (randomly amplified polymorphic DNA, RAPD) (蘇天鳳等, 2002; Miyake et al, 2016)、單序列間重復(fù)(inter-simple sequence repeat, ISSR) (姜因萍等, 2007)、微衛(wèi)星 (simple sequence repeats, SSR) (沈恩健, 2010) 和單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism, SNP) (李耀國等, 2016)。在各類分子標記中, SNP因其在基因組中分布泛、多樣性高、易于分型等特點, 成為基因分型最理想的分子標記 (Ganal et al, 2009)。目前, SNP分型主要通過以下方法: 低等通量分型方法, 包括等位基因特異 PCR (Newton et al, 1989)和限制性內(nèi)切酶酶切法 (Neff et al, 1998); 中通量分型方法, 包括變性高效液相色譜技術(shù) (Nickerson et al, 2000)、質(zhì)譜法 (Hong et al, 2008)、SNaPshot技術(shù) (Sobrino et al, 2005)和高分辨溶解曲線法(high resolution melting, HRM) (Montgomery et al, 2007); 高通量分型方法, 如SNP芯片技術(shù)(趙杰等, 2018)。HRM方法不需要任何特異性探針, 而且靈敏度高, 操作簡便(趙瓊一等, 2010)。基于HRM方法的SNP標記常常用于品種鑒定(王家豐, 2013)、基因分型(王艷等, 2015)、分子診斷(胡笑蓉等, 2012)、疾病相關(guān)基因突變掃描(李梅等, 2012)和動物育種(陳亮等, 2014)。在海洋經(jīng)濟貝類中, HRM方法已被用于SNP標記開發(fā)、遺傳結(jié)構(gòu)分析和親緣關(guān)系鑒定(童曉飛等, 2012; 金玉琳, 2014), 而在馬氏珠母貝中, 利用HRM對SNP進行分型并進行遺傳結(jié)構(gòu)分析的研究較少。

本研究利用HRM技術(shù)對馬氏珠母貝2個親本群體及其雜交子代進行SNP分型, 同時結(jié)合形態(tài)學(xué)分析它們的遺傳結(jié)構(gòu), 探究群體親緣關(guān)系并判別群體。研究結(jié)果可為馬氏珠母貝育種群體的管理和育種實踐提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料構(gòu)建和樣品采集

繁育用親本分別來源于2齡深圳群體和海南群體, 二者都為深圳大鵬澳海區(qū)的養(yǎng)殖群體。以雙列雜交的方式構(gòu)建群體, 群體內(nèi)自繁作為親本群體; 雜交一代(F1)以深圳群體為母本, 海南群體為父本; 反交群體因數(shù)量太少而放棄。親本群體和F1在相同的條件下進行管理和養(yǎng)殖。12月齡貝時, 分別從每個群體 (2個親本群體和 F1)中隨機抽樣50只貝, 測量每只貝的殼長、殼寬、殼高、鉸合線長、軟體部重、殼重和總重, 并計算出殼寬指數(shù)、殼重指數(shù)、肥滿度指數(shù)、殼高/殼長、殼寬/殼長、鉸合線/殼長, 共計 13個形態(tài)性狀參數(shù)。長度精確到 0.01mm; 重量精確到 0.01g。每個群體從中挑取30只貝的閉殼肌組織于90%乙醇中固定, 放置于–20℃保存, 用于后續(xù)SNP分型實驗。殼寬指數(shù)(Wada et al, 1991)、殼重指數(shù)(杜曉東等, 2002)和肥滿度指數(shù)(Yokogawa, 1998)計算公式如下:

殼寬指數(shù) = 殼寬/(殼長+殼高+殼寬) (1)

殼重指數(shù) = [殼重/(殼長×殼高×殼寬)]×105(2)

肥滿度指數(shù) = [軟體部重/(殼長×殼高×殼寬)]×105(3)

1.2 DNA提取

采用 HiPure Universal DNA Kit (Magen, China) 試劑盒對每個樣本的閉殼肌基因組DNA進行提取, 相關(guān)操作步驟參照試劑盒說明書。使用微量分光光度計(Quawell Q5000, San Jose, CA, USA) 測量DNA的濃度, 并用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA質(zhì)量, 于–20℃儲存。

1.3 SNP分型

從前期的研究中篩選出在深圳群體和海南群體中基因型頻率差異顯著的4個SNP位點(rs8、rs33、rs35、rs44)。結(jié)合文獻并采用Primer premier 6.0 軟件進行引物設(shè)計(表1), 并送由華大公司(中國)合成。對引物進行驗證后, 利用羅氏LC-480定量PCR儀(Roche, 瑞士), 使用高分辨率溶解曲線法(high resolution melting, HRM)對親本群體和 F1 中的4個位點進行SNP分型。10μL HRM反應(yīng): 384孔板的每個加樣孔中加入 5μL 2× Fast Super EvaGreen Master Mix(US EVERBRIGHT INC), 0.5μL上游引物(5μmol·L–l), 0.5μL下游引物(5μmol·L–l), 0.5μL DNA (25ng·μL–1), 3.5μL ddH2O混勻。HRM擴增反應(yīng)程序為: 94℃預(yù)變性10min, 94℃變性20s, 退火60℃至52℃(降落PCR: 每個循環(huán)降低0.5℃)10s, 72℃延伸10s, 擴增45個循環(huán)。擴增程序結(jié)束后運行高分辨率溶解曲線程序: 95℃變性1min, 40℃1min, 65~95℃, 每秒上升 0.02℃(每上升 1℃收集25次熒光信號)。利用LightCycler ? 480 Gene Scanning Soft-ware 分析軟件, 分析各個群體的HRM曲線。

表1 HRM法基因分型引物

注: F為正向引物, R為反向引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 24.0.0.0軟件(http://www.spss.com.cn) 對3個群體的13個形態(tài)參數(shù)進行單因素方差分析、主成分分析、判別分析和聚類分析。單因素方差分析采用Duncan方法進行多重比較。主成分分析通過因子分析處理13個形態(tài)參數(shù), 獲得主成分貢獻率以及累計貢獻率。判別分析通過逐步判別法建立判別函數(shù), 在此基礎(chǔ)上利用典則判別函數(shù)對每個個體進行預(yù)測分類。聚類分析通過系統(tǒng)聚類法, 計算平方歐式距離進行聚類。利用 POPGENE version1.32軟件(Yeh et al, 1999)計算每個群體SNP位點的基因型頻率、觀測雜合度(observed heterozygosity,o)、期望雜合度(expected heterozygosity,e)、香農(nóng)多樣性指數(shù)()、基因流(N)、遺傳分化系數(shù)(st)和遺傳距離, 并進行哈迪-溫伯格平衡檢驗(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)。4個位點的多態(tài)信息含量(polymorphism information content, PIC)利用 PIC- Cale(Shao et al, 2013)軟件計算。根據(jù)每個群體間的Nei’s遺傳距離, 使用MEGA 5(Tamura et al, 2011)軟件, 利用NJ法繪制3個群體的群體聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 馬氏珠母貝3個群體形態(tài)學(xué)分析

3個群體形態(tài)參數(shù)見表2, 父本群體的殼高、總重、殼重和軟體部重顯著高于母本群體, 母本群體的鉸合線/殼長顯著高于父本群體; F1的殼寬、殼高、軟體部重等多個形態(tài)參數(shù)與母本相似, 與父本形態(tài)差異較大; F1在殼重指數(shù)顯著高于兩個親本群體。

通過因子分析, 選擇主成分貢獻率較大的3個主成分進行負荷值計算(表3)。結(jié)果顯示前3個主成分的貢獻率分別為43.2%、27.6%和12.8%, 累計貢獻率為83.6%。其中主成分1主要受總重、軟體部重、殼高、殼重、鉸合線長和殼長的影響, 主成分2主要受殼寬指數(shù)、殼寬和殼寬/殼長的影響, 結(jié)果表明這9個獨立性狀參數(shù)最能反映親本群體和 F1間的外部形態(tài)差異。

表2 馬氏珠母貝3個群體主要形態(tài)參數(shù)的平均值

注: 上標不同字母之間表示存在顯著性差異(<0.05)

表3 馬氏珠母貝3個群體形態(tài)參數(shù)主成分分析

注: *表示負荷值大于0.6(表示該因素可以有效的代表其主成分, 主成分貢獻率越大表示該主成分越能反映群體之間的形態(tài)差異)

13個性狀參數(shù)通過逐步判別分析經(jīng)F檢驗, 結(jié)果表明除了殼寬/殼長, 其余12個形態(tài)形狀可對群體進行判別。從馬氏珠母貝3個群體的判別分析結(jié)果(表4)可知父本、F1、母本群體的判別準確率分別為72%、64%、80%, 綜合判別率為72%, 3個群體的綜合判別率不高。

表4 判別函數(shù)對馬氏珠母貝3個群體觀測樣本的預(yù)測分類及準確率

馬氏珠母貝3個群體的形態(tài)聚類分析結(jié)果見圖1。由圖可知, 母本群體和F1最先聚為一類, 而父本群體單獨聚為一支。該結(jié)果說明母本群體和F1的個體形態(tài)差異較小, 而父本群體與其他兩群體之間形態(tài)差異較大。

圖1 馬氏珠母貝3個群體形態(tài)聚類圖

2.2 SNP標記的遺傳多樣性參數(shù)分析

將獲得的rs8、rs33、rs35、rs44標記的基因分型數(shù)據(jù)用軟件分析后, 3個群體的e、o、a、e、、PIC和哈迪-溫伯格平衡檢驗(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)值等遺傳多樣性參數(shù)見表5。結(jié)果顯示, 這4個SNP標記的在3個群體中的香農(nóng)多樣性指數(shù)()為0.3111~0.6881, 多態(tài)信息含量(PIC)為 0.1555~0.3747, 表現(xiàn)為中度多態(tài)性(除了父本群體的rs8和rs35標記表現(xiàn)為低度多態(tài)性)。4個SNP標記在3個群體中平均雜合度o和e分別為0.2110~0.2879 和 0.3317~0.4685。3個群體總體呈現(xiàn)中等程度遺傳多樣性。

表5 馬氏珠母貝3個群體遺傳多樣性參數(shù)

注:為香農(nóng)多樣性指數(shù),o為觀測雜合度,e為期望雜合度, PIC為多態(tài)信息含量, HWE為哈迪-溫伯格平衡檢驗; *表示經(jīng)過校正后仍顯著偏離哈迪-溫伯格平衡的位點(<0.01)

2.3 SNP標記的遺傳結(jié)構(gòu)分析

3個群體4個SNP位點(rs8、rs33、rs35、rs44)利用HRM方法成功分型, 分型結(jié)果見圖2。計算出各個群體的基因型頻率(表6)。從計算結(jié)果可知, 父本在rs8位點中基因型CC的基因型頻率為0, 父本在該位點主要表現(xiàn)為純合子TT(0.75), 而母本在該位點存在純合子CC(0.33), 子代在該位點中基因型C來源于母本。母本群體在rs35位點的基因型CA的基因型頻率(0.03)最小, 而父本在該位點的基因型CA、AA的基因型頻率也較小(均為0.06)。

馬氏珠母貝3個群體之間的遺傳距離、遺傳相似系數(shù)和基因流(m)、遺傳分化系數(shù)(st)的分析數(shù)據(jù)見表7, 分析結(jié)果表明親本群體之間的遺傳距離最大(0.1759), 遺傳相似系數(shù)最小(0.8387); F1和母本群體之間的遺傳距離最小(0.0546), 遺傳相似系數(shù)最大(0.9947)。3個群體之間的基因流N值均大于1, 說明3個群體之間存在基因流動; 親本群體之間的基因流m值最小(1.9662), 表明親本之間基因流動較小, 遺傳分化較大; 而F1和母本群體之間的基因流m值最大(7.7701), 表明該兩群體之間基因流動較大, 遺傳分化較小。3個群體之間的遺傳分化系數(shù)(st)在0.0166~0.1128之間, 表明1.66%~11.28%的遺傳變異存在于群體之間, 88.72%~98.34%的遺傳變異存在于群體內(nèi)。

圖2 馬氏珠母貝3個群體4個位點分型結(jié)果圖

a、b、c、d分別為rs8、rs33、rs35、rs44的HRM分型結(jié)果圖, 不同顏色代表不同基因型

Fig. 2 The results of four loci typing in tree populations ofa, b, c and d are the results of HRM typing for rs8, rs33, rs35, and rs44, respectively, different colours represent different genotypes

表6 馬氏珠母貝3個群體SNP的基因型和頻率

表7 馬氏珠母貝3個群體遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)

注: 遺傳距離和遺傳相似系數(shù)中, ****下方數(shù)據(jù)為Nei's遺傳距離, ****上方數(shù)據(jù)為遺傳相似系數(shù); 基因流和遺傳分化系數(shù)中, ****下方數(shù)據(jù)為基因流N值, ****上方數(shù)據(jù)為遺傳分化系數(shù)?；蛄?i>N值 = 0.25(1–st) /st,st為遺傳分化系數(shù)

將獲得的rs8、rs33、rs35、rs44標記的基因分型數(shù)據(jù), 利用軟件進行聚類分析, 繪制NJ進化樹(圖3)。母本群體最先與F1聚為一類, 父本群體單獨聚為一支, 表明F1與母本群體之間親緣關(guān)系最近, 而親本群體之間親緣關(guān)系最遠。

圖3 馬氏珠母貝3個群體基于分子標記的群體聚類圖(NJ樹)

3 討論

3.1 親本間遺傳結(jié)構(gòu)差異

一般來說, 表型性狀常常用來對馬氏珠母貝的不同群體和家系進行區(qū)分和判別, 例如殼長、殼寬、殼高、總重等(顧志峰等, 2009), 但對形態(tài)相似的群體進行分類難度較大。本研究通過測定的13個形態(tài)性狀進行多元形態(tài)分析, 反映了3個群體形態(tài)上的差異和相似性。從外部形態(tài)數(shù)據(jù)可知, 親本群體在殼高、總重、殼重和軟體部重差異顯著。從主成分分析可以看出親本群體間的外部形態(tài)差異主要受總重、軟體部重、殼高、殼重、鉸合線長和殼長的影響, 這6個性狀是區(qū)分2親本外部形態(tài)的主要依據(jù), 這一結(jié)果與外部形態(tài)分析較為一致。從判別分析結(jié)果可以看出母本群體的判別率(80%)要高于父本群體的判別率(72%), 判別效果較好, 說明母本群體內(nèi)個體差異較小。而綜合判別率為72%, 判別效果不高, 這可能與養(yǎng)殖過程中環(huán)境因素和人為主觀選擇因素有關(guān)(劉澤浩等, 2010)。羅會等(2013)曾對馬氏珠母貝不同地理群體的形態(tài)差異進行研究, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣西、三亞、雷州和越南的4個地理群體綜合判別率為57%, 認為較低的判別率可能受到主觀選擇因素影響, 導(dǎo)致群體間差異較小。聚類分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)親本群體之間形態(tài)距離最遠, 結(jié)合親本群體間不高的判別率, 我們猜測親本群體可能存在一定的基因流動(陳蓉等, 2009)。親本群體的多元形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果基本上可以區(qū)分兩個群體, 但是進一步探究3親本群體的遺傳結(jié)構(gòu)還需結(jié)合分子標記進行研究。

本實驗室前期的研究中篩選出了在深圳群體和海南群體中基因型頻率差異顯著的位點: 海南群體rs8位點的基因型CC頻率為0, rs35位點的基因型AA頻率為0, rs44位點的基因型CA頻率為0, 而深圳群體在rs8、rs35、rs44位點均存在3種基因型; 深圳群體rs33位點的基因型AA頻率為0, 而海南群體存在3種基因型。本研究的SNP分型結(jié)果顯示父本群體在rs8位點的基因型CC頻率為0, 而母本群體存在3種基因型, 這一結(jié)果與前期工作的結(jié)果基本一致; 而父本群體在rs35位點出現(xiàn)了少量的AA基因型, 這可能是由于實驗室前期工作研究樣本量不足結(jié)果導(dǎo)致。分型結(jié)果表明rs8位點可以區(qū)分親本群體, 成為特異性標記。

st(Wright, 1978)、遺傳距離 (Weir et al, 1984) 和基因流是研究種群遺傳分化的重要參數(shù)。Wright (1978)認為, 當st< 0.05時, 種群間分化很小; 0.05≤st≤ 0.15, 遺傳分化程度中等。湯健等(2013)通過6個微衛(wèi)星位點分析了9個馬氏珠母貝養(yǎng)殖家系的遺傳結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)家系間st為0.0749, 處于中等遺傳分化。和上述研究相較, 本次研究中親本群體的st最大(0.1128), 說明親本群體存在中等程度遺傳分化,

當基因流(N) >1, 基因流可以阻止種群之間分化 (Wright, 1931)。本次研究結(jié)果中, 親本群體之間的N最小(1.9662), 遺傳距離最大(0.1759), 遺傳分化較大, 和聚類分析結(jié)果一致。本實驗室前期對海南群體和深圳群體遺傳結(jié)構(gòu)研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn), 海南群體和深圳群體的m為1.4114, 遺傳距離為0.1595 (另文發(fā)表), 與本次的研究結(jié)果相似。在馬氏珠母貝其他群體研究中, 侯戰(zhàn)輝等(2008)用17個 EST-SSR 位點得出印度種群和三亞種群的st值為0.486, 遺傳距離為1.119, 群體之間分化程度很高。王愛民等(2007), 利用6個SSR位點對印度群體和三亞群體雜交子代的遺傳結(jié)構(gòu)進行研究, 發(fā)現(xiàn)4組子代的st值為0.357, 存在較大的遺傳差異和遺傳分化。和上述結(jié)果相較, 本次研究的親本群體的st值和遺傳距離均偏小, 遺傳分化中等。結(jié)合形態(tài)分析結(jié)果, 我們猜測可能是由于親本群體之間存在基因交流導(dǎo)致種質(zhì)資源受到污染, 使遺傳距離偏小; 也可能本次研究SNP位點數(shù)目偏少, 導(dǎo)致遺傳信息偏少。

3.2 雜交對后代遺傳結(jié)構(gòu)影響

通過形態(tài)分析發(fā)現(xiàn), F1在多個形態(tài)參數(shù)上與父本差異顯著, 而與母本沒有顯著性差異。F1判別分析的判別率為64%, 比親本群體低。從個體分布來看, 50個個體中有10個個體錯判給母本, 略高于父本群體(8個)。綜合判別率不高的原因也與F1的低判別率有關(guān), 董志國等(2008)對三角帆蚌3個地理種群雜交進行判別分析, 綜合判別率為68.75%~ 79.78%, 認為該判別效果較為理想, 而且雜交群體的部分性狀還需經(jīng)過多代遺傳才能穩(wěn)定。形態(tài)聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)母本群體最開始與F1聚為一類, F1再與父本群體聚為一類, 結(jié)合判別分析結(jié)果可以得出F1在形態(tài)上與母本群體最相似, 也就是說表觀遺傳結(jié)構(gòu)上更接近母本群體。

遺傳多樣性分析結(jié)構(gòu)表明這4個位點呈現(xiàn)中度多態(tài)性(0.25

本次研究中F1和其他群體之間遺傳分化很小, 這一結(jié)果與3個群體的系譜關(guān)系一致。其中, F1與母本群體的st最小(0.0166),m最大(7.7701), 遺傳距離最小(0.0546)。因此相較于父本群體, F1與母本群體的基因流動更頻繁, 遺傳分化更小。利用NJ法對3個群體進行聚類分析, 結(jié)果顯示F1與母本群體最先聚為一類, 親緣關(guān)系最近, 而與父本群體親緣關(guān)系最遠, 這一結(jié)果和形態(tài)聚類結(jié)果較為一致。無論從形態(tài)還是分子遺傳結(jié)構(gòu)上, F1遺傳結(jié)構(gòu)上都更偏向母本群體。曲艷波等(2006) 用RAPD分析馬氏珠母貝以印度群體為父本、三亞群體為母本進行雜交, 發(fā)現(xiàn)雜交子代與親本之間的遺傳距離不等, 且偏向母本。在其他貝類中也出現(xiàn)這種雜交子代與親本遺傳結(jié)果有差異的現(xiàn)象(李太武等, 2002), 這可能與親本的遺傳結(jié)構(gòu)間的相互作用有關(guān)。

3.3 HRM方法優(yōu)化

本研究中發(fā)現(xiàn)HRM分型方法在3個群體4個位點上成功區(qū)分了3種基因型, 結(jié)果說明HRM方法可以用于馬氏珠母貝的SNP基因分型。傳統(tǒng)的基因分型技術(shù)存在各式各樣的缺點, 如AS-PCR的檢測通量較低、靈敏度差錯誤率高(楊潤婷等, 2013); SSCP檢測成功率低、假陽性高; DHPLC法無法確定堿基突變位置; 高通量的測序技術(shù)成本相對較高。相較而言, HRM方法通量較高, 靈敏度也更高, 操作便捷。對于HRM進行分型, 需注意PCR產(chǎn)物特異性及其大小、GC含量、SNP類型和反應(yīng)體系優(yōu)化(Wittwer, 2009)。本研究使用羅氏所用的HRM法也有需要注意的地方, 如為了增加靈敏度, 產(chǎn)物長度應(yīng)在80~100bp最優(yōu)(Reed et al, 2004); HRM對SNP類型(A/T、G/C)的分型靈敏度不高, 而對G/A進行區(qū)分最容易(李紀勤, 2012), 因此選取SNP位點應(yīng)嚴謹; 引物需提前進行PCR驗證, 應(yīng)無二聚體結(jié)構(gòu); 在擴增片段區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)多個SNP位點, 會干擾分型結(jié)果, 應(yīng)避開SNP密集區(qū)域(Liew et al, 2004); 分型的DNA模板要求純度較好, 進行反應(yīng)的模板初始濃度在20~30ng·μL–1最優(yōu), 模板濃度過高會造成非特異性擴增(白牡丹等, 2012); 使用不同飽和染料時, 根據(jù)燃料特性調(diào)整擴增循環(huán)數(shù), 例如SYBR Green I染料對DNA擴增存在一定抑制性, 應(yīng)適當延遲5個循環(huán)數(shù)。由于HRM法反應(yīng)靈敏, 對反應(yīng)條件和模板要求較高, 因此在利用HRM法對馬氏珠母貝的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系進行探究時, 可進一步優(yōu)化反應(yīng)體系, 探究反應(yīng)條件, 達到準確分型結(jié)果。

總的來說, 結(jié)合形態(tài)學(xué)和SNP標記可以對兩個親本群體(深圳群體和海南群體)進行判別和區(qū)分, F1在形態(tài)和遺傳結(jié)構(gòu)上與母本群體更相似。

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Morphological and SNP markers for analysis of genetic structure of hybrid progeny and their parental populations of

HUANG Jing1,2,3, PAN Xiaolan1,2,3, XU Meng1,2,3, LIU Wenguang1,3, ZHANG Hua1,3, HE Maoxian1,3

1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China;2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China

The pearl oyster,, is a primary marine bivalve species. To study the genetic structure and relationship of cultured parents and their hybrid generation, external morphology and genetic structure were assessed in the three populations offrom Shenzhen population (female), Hainan population (male) and their hybrid generation F1, based on morphological multivariate analysis and SNP markers. The results showed that the average discriminant accuracy was 72%, and the morphological characteristics of F1 and female were similar, while male was the most different from the other two populations. Four SNP markers of the three populations were genotyped by the HRM (high resolution melting) method. The results showed that the average observed (o) and expected (e) heterozygosity were 0.2110 to 0.2879 and 0.3317 to 0.4685, respectively; and the heterozygosity of F1 was higher than that of the parent populations. The average polymorphism information content (PIC) values of the three populations were in the range of 0.2643 to 0.3556, which showed moderate genetic diversity. Gene flow (N) between F1 and female was the largest (7.7701), with minimum genetic distance being 0.0546; thus, their genetic relationships were similar. Gene flow (N) between the parent populations was minimum (1.9662), with largest genetic distance being 0.1759. Finally, we found that rs8 marker can be used as a specific marker to discriminate parent populations. These results should assist the discriminate of genetic structure and management of selective breeding of.

; genetics; genetic structure; morphology; SNP

10.11978/2019012

http://www.jto.ac.cn

Q953; Q958.8

A

1009-5470(2019)06-0080-10

2019-01-21;

2019-02-27。

林強編輯

國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-49)

黃景(1993—), 男, 湖北省黃石市人, 碩士研究生, 研究方向為馬氏珠母貝分子遺傳育種。E-mail: 1152524871@qq.com

何毛賢。E-mail: hmx2@scsio.ac.cn, 電話: 020-89023144

2019-01-21;

2019-02-27.

Editor: LIN Qiang

Modern Agro-industry Technology Research System(CARS-49)

HE Maoxian. E-mail: hmx2@scsio.ac.cn, Tel: 020-89023144