超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測肉丸中諾氟沙星藥物殘留

摘 ?要：采用甲酸化的乙腈溶液提取肉丸中諾氟沙星藥物，并采用固相萃取凈化提取液，建立了肉丸中諾氟沙星的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)2%甲酸乙腈提取，提取液鹽析，取乙腈層過固相萃取柱凈化，在電噴霧離子源正離子模式下，多反應(yīng)離子監(jiān)測進行測定，內(nèi)標法定量。諾氟沙星藥物在2.0～50 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9997。在3個不同添加水平下的平均回收率為87.0～91.0%，相對標準偏差為6.2～7.1%（n=6），檢出限為0.5 μg/kg。該方法操作簡便、快速，凈化效果好，靈敏度高，適用于肉丸中諾氟沙星藥物殘留的快速分析檢測。

關(guān)鍵詞：固相萃取;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;諾氟沙星;肉丸

中圖分類號：TS251 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1671-2064（2019）16-0000-00

諾氟沙星是第三代喹諾酮類抗菌藥物中的一種，該藥物為廣譜抗菌抗菌藥，其見效快，且成本低，因此被廣泛的使用到動物的養(yǎng)殖中^[1]，為畜禽和水產(chǎn)專用抗菌藥物，但部分養(yǎng)殖戶過度使用該類藥物，或未注意休藥期，導(dǎo)致畜禽和水產(chǎn)產(chǎn)品中該類藥物殘留較多，同時當前對于肉丸類食品中該種殘留沒有限量指標，因此建立肉丸中諾氟沙星的檢測方法具有重要的實際意義。

目前，食品中諾氟沙星的檢測方法主要有液相色譜法^[2]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法^[3-6]。本文以市售的肉丸為研究對象，對其諾氟沙星藥物檢測的樣品前處理條件進行了選擇和優(yōu)化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測器檢測，對液相分離條件和質(zhì)譜檢測條件分別進行了優(yōu)化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測肉丸中諾氟沙星的檢測方法，并對市售的10批次實際樣品進行了檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WATERS TQD質(zhì)譜儀（美國WATERS公司）;XEVO超高效液相色譜儀（美國WATERS公司）;BEH Shield C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm，美國WATERS公司）;高速冷凍離心機（美國熱電公司）; Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）;氮吹儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）;渦旋混合儀（德國IKA公司）; Oasis HLB固相萃取柱（美國WATERS公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純（美國Fisher公司）;甲酸，色譜純（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）;氯化鈉、氨水均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;水為Milli-Q超純水儀制備的超純水。

標準品諾氟沙星購置于中國食品藥品檢定研究院，純度為99.5%。

1.2標準溶液的配制

精密稱取諾氟沙星標準品適量，加入0.2 mL甲酸，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度約是1.0 mg/mL標準儲備液，置于棕色瓶中，于冰箱-18℃中保存。用時根據(jù)需要，用0.1%甲酸-乙腈（95：5）溶液逐級稀釋為標準工作液，臨用現(xiàn)配。

1.3樣品處理

試樣經(jīng)均質(zhì)器均質(zhì)后，稱取約5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入15 mL2%甲酸乙腈溶液，渦旋混合30 s;8000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，殘留物再用10 mL1%甲酸乙腈溶液提取兩次，合并三次提取液;加入10 mL乙腈飽和的正己烷，渦旋30 s，取乙腈層于氮氣流下吹至近干，加入5 mL水，渦旋混合，10000 r/min的速度離心5 min待凈化。

將樣品溶液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中（固相萃取柱依次用6 mL甲醇、6 mL水活化），以6 mL水洗滌小柱，抽干后，用乙腈-1 mol/L氨水（95：5）溶液6 mL洗脫，收集洗脫液于氮氣流下吹至近干，用初始比例流動相1.00 mL復(fù)溶，渦旋混合，過0.22 μm有機濾膜供UPLC-MS/MS分析測定。

1.4基質(zhì)標準溶液配制

取空白基質(zhì)麻辣燙樣品，按1.3方法處理至濃縮至近干，用標準工作液1.0 mL復(fù)溶，渦旋混合30 s，過0.22 μm濾膜，即得。

1.5 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：BEH Shield C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）;柱溫：30 ℃;進樣量：5 μL。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈溶液;流速：0.35 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

電噴霧離子源（ESI）;正離子掃描;多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）;噴霧電壓：2 kV;霧化氣溫度：400 ℃;霧化氣流速：0.8 L/min;質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究中先后考察了乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相時，諾氟沙星的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相時，諾氟沙星的離子化效率有所提高，且峰形較好，因此乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相;后又考察了不同濃度的甲酸水溶液對諾氟沙星的響應(yīng)影響情況，發(fā)現(xiàn)變化不大，因此最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

采用選定的流動相和色譜柱，對標準工作液進行檢測，優(yōu)化梯度洗脫程序，使諾氟沙星具有較好的峰形和靈敏度。圖1為10ng/mL諾氟沙星標準工作液的總離子流色譜圖。

2.2質(zhì)譜條件優(yōu)化

通過質(zhì)譜端直接進樣的方式將500 ng/mL的諾氟沙星標準工作液引入質(zhì)譜檢測器，分別進行正離子和負離子全掃描分析，發(fā)現(xiàn)諾氟沙星的最佳準分子離子峰在正離子掃描模式下獲得。以其準分子離子為母離子，不斷改變錐孔電壓，選擇準分子離子響應(yīng)最高的電壓作為錐孔電壓;再通過改變碰撞電壓，將準分子離子打碎，并檢測子離子，選擇穩(wěn)定且響應(yīng)最好的兩個子離子作為特征子離子，其中豐度相對較強的為定量離子，另一個作為定性離子，再對兩個特征子離子的碰撞能量進行分別優(yōu)化，使定量離子和定性離子的響應(yīng)均達最優(yōu)。優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3樣品前處理條件的優(yōu)化

肉丸樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，含有較高的蛋白、脂肪，同時還有不同含量的調(diào)味品等，因此對樣品中的諾氟沙星提取后，要采用一定的凈化手段去除大量的雜質(zhì)，以期得到較為干凈的待測液和較好的檢測靈敏度。對于提取溶劑，我們選擇了現(xiàn)有研究中常用的酸化乙腈溶液，并考察了添加不同體積分數(shù)的甲酸乙腈溶液的提取效果，實驗表明2%甲酸乙腈溶液作為提取液即可達提取效率最優(yōu)。肉丸樣品中含有一定量的油脂，提取時也一并提取到提取液中，對后續(xù)的凈化和檢測均有影響，因此選擇乙腈飽和的正己烷對提取液進行除油操作。

2.4 線性方程、檢出限

按照1.4項的方法配制5個水平的基質(zhì)標準溶液，并采用優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件進行檢測。以諾氟沙星定量離子的峰面積（y）作為縱坐標、質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標繪制標準曲線，線性范圍為2.0～50 μg/L，相關(guān)系數(shù)r為0.9997，線性關(guān)系良好，檢出限為0.5 μg/kg。

2.5回收率和精密度

在空白肉丸樣品中添加諾氟沙星標準溶液，制備含量分別為1.0、2.0和5.0 μg/kg的加標樣品，按照前處理方法及優(yōu)化的檢測條件進行試驗，每個添加水平平行測定6份，結(jié)果見表3，平均回收率為87.0～91.0%，相對標準偏差為6.2～7.1%。

2.6 實際樣品檢測

采用本文建立的方法，對10批次市售肉丸食品進行檢測，9批次均未檢出，1批次檢出含有諾氟沙星，含量為7.6 μg/kg。

3結(jié)語

本文采用酸化乙腈溶液對肉丸食品中的諾氟沙星進行提取，并使用HLB固相萃取柱凈化提取溶液，分別優(yōu)化了諾氟沙星檢測的液相色譜分離和質(zhì)譜檢測條件，建立了UPLC-MS/MS檢測肉丸中諾氟沙星藥物的分析方法，并將該方法用于市售肉丸食品的檢測中。該方法操作簡便、快速，其靈敏度較高，回收率和精密度均符合檢測技術(shù)的要求，可用于肉丸食品中諾氟沙星的檢測。

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收稿日期：2019-07-05

作者簡介：程海霞（1988—），女，漢族，湖北武漢人，碩士，實驗工程師，助理實驗師，研究方向：食品化妝品農(nóng)獸藥殘留檢測。

Determination of Norfloxacin in Meat balls using Ultra?Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometric

CHEN Hai-xia

（Wuhan Customs Technology Center，Wuhan Hubei 430050）

Abstract：An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric （UPLC-MS/MS） method was established to determination of the norfloxacin in meat balls. Samples were extracted with acidified acetonitrile and separated on SPE column， and analyzed by UPLC-MS/MS under the positive mode using multiple?reaction monitoring（MRM）. The method showed good linearities over the range of 2.0～50 ng/mL with good linear correlation coefficients （r=0.9997）. The method detection limit of the norfloxacin was 0.5 μg/kg， and the recovery of norfloxacin in meat balls ranged from 87.0～91.0?% with the relative standard deviations （RSD） of 6.2～7.1% （n=6）. The results indicated that this method is simple， fast and clean， and suitable for the simultaneous determination?for the norfloxacin in the meat balls.

Key words：SPE; Ultra Performance?Lquid Chromatography-tandem Mass spectrometric （UPLC-MS/MS）; Norfloxacin; Meat balls