生物硫醇熒光探針的設(shè)計、合成及應(yīng)用研究

牛衛(wèi)芬　張潮　賈娟　贠克明　雙少敏　董川　黃文成

摘 要 以4-（4-羥基苯乙烯基）-1-甲基吡啶鹽（MCY）為熒光團、4-硝基苯并惡二唑（NBD）為硫醇的反應(yīng)基團，合成熒光探針（MCY-NBD），用于高靈敏、選擇性檢測細胞中的生物硫醇。探針與硫醇反應(yīng)后，呈現(xiàn)顯著的綠色熒光增強，熒光增強程度與硫醇濃度在0.1～4.0 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.03 μmol/L; 此探針具有反應(yīng)速度快、選擇性高、光學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點。激光共聚焦掃描顯微成像結(jié)果表明，MCY-NBD具有優(yōu)良的生物相容性、細胞膜通透性及低毒性，可用于快速檢測細胞內(nèi)生物硫醇的濃度。

關(guān)鍵詞 生物硫醇; 熒光探針; 細胞成像

1 引 言

生物硫醇是生物體內(nèi)普遍存在的一類含硫活性物質(zhì)（RSS），主要包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH），在人體的生理過程中具有關(guān)鍵作用，維持人體的氧化還原平衡[1～4]，作為抗氧化劑維持生物體內(nèi)過氧自由基的正常水平，協(xié)助抑制細胞凋亡，參與復(fù)雜的多維蛋白結(jié)構(gòu)的構(gòu)建[5，6]。生物體內(nèi)硫醇濃度異常會引起一系列疾病，包括癌癥、阿爾茨海默氏癥、骨質(zhì)疏松癥、肝損傷、心臟病、腸道炎癥及心血管疾病等[7～10]。谷胱甘肽是細胞內(nèi)含量最豐富的非蛋白硫醇（1～10 mmol/L）[11]，參與維持細胞的氧化還原活性、易生物質(zhì)代謝、細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)及基因調(diào)節(jié)等[12]。谷胱甘肽有還原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）兩種形式，生理條件下以還原型谷胱甘肽占絕大多數(shù); 還原型谷胱甘肽通過控制氧化應(yīng)激維持細胞的氧化還原平衡，對細胞的生長和維持正常功能方面起著至關(guān)重要的作用[12，13]，還原型谷胱甘肽水平異常是氧化應(yīng)激的潛在指標之一[14～16]。因此，生物體， 尤其是細胞中生物硫醇的高靈敏、選擇性檢測方法備受關(guān)注。

在文獻報道的生物硫醇的檢測方法中，光學(xué)技術(shù)， 尤其是熒光探針結(jié)合激光共聚焦掃描顯微成像技術(shù)，具有高靈敏度、高選擇性、對生物樣品的非破壞性以及高時空分辨率，能夠?qū)毎麅?nèi)目標物進行實時監(jiān)控[17～21]，因此，高選擇性的硫醇熒光探針在近十幾年發(fā)展迅速。目前，用于硫醇檢測的熒光探針原理主要是基于巰基的強親核性和對金屬離子的高絡(luò)合能力[22～41]。2016年，本研究組首先報道了基于線粒體靶向的比率發(fā)射雙光子熒光探針，用于高選擇性檢測細胞和組織中的半胱氨酸[27]。2018年，Yang等[28]利用分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移-共振能量轉(zhuǎn)移共同作用，設(shè)計合成了比率型雙光子熒光探針，可選擇性測定細胞和肝組織中的半胱氨酸，但探針和半胱氨酸的響應(yīng)時間需30 min。2019年，Xu等[29]合成了一個近紅外熒光探針，可同時靶向溶酶體和線粒體，用于活體內(nèi)谷胱甘肽成像研究，但響應(yīng)時間較長，約需90 min反應(yīng)才能達到平衡。以上探針均是基于硫醇巰基的親核性而設(shè)計。金屬配合物自1890年首次被報道以來，被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。 Wang等[30]報道了一種銅絡(luò)合物近紅外熒光探針，利用半胱氨酸和銅的絡(luò)合能力， 選擇性測定人血漿中的半胱氨酸含量，但探針結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。綜上，用于硫醇檢測的熒光探針的研究仍然面臨許多挑戰(zhàn)。因此，設(shè)計合適的識別基團有效區(qū)分3種硫醇（Cys、HCY 和GSH），提高探針的生物相容性，發(fā)展低生理毒性的體內(nèi)光學(xué)成像的方法，消除細胞內(nèi)固有生物物質(zhì)自發(fā)熒光的干擾，實現(xiàn)探針和硫醇快速響應(yīng)，是未來的研究重點。

為了合成具有優(yōu)良的生物相容性、高靈敏度以及快速響應(yīng)的生物硫醇熒光探針，設(shè)計方面應(yīng)具備以下特點：探針的熒光團應(yīng)有較大的摩爾吸收系數(shù)（ε）和高的熒光量子產(chǎn)率（F）; 傳感單元應(yīng)快速與硫醇響應(yīng)，并且不受細胞內(nèi)高濃度物種的干擾; 探針應(yīng)具有低的細胞毒性和優(yōu)良的細胞膜通透性?；谝陨峡紤]，本研究選用一個部花菁4-（4-羥基苯乙烯基）-1-甲基吡啶鹽（MCY，化合物1）作為熒光團，它不僅具有好的生物相容性，且羥基基團很容易修飾特定的靶向識別位點。然后，通過Williamson醚合成反應(yīng)將硫醇的特異性識別基團4-硝基苯并惡二唑（NBD）偶聯(lián)到熒光團中，得到了增強型熒光探針MCY-NBD。由于熒光團的羥基被硝基苯并惡二唑包裹， 降低了羥基氧原子的供電子能力，MCY-NBD發(fā)出較弱的熒光信號; 與硫醇反應(yīng)后，探針的醚鍵斷裂，釋放出4號位的羥基，體系熒光增強。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

BrukerⅢ 400核磁共振儀（瑞士Bruker BioSpin公司）; 6550 iFunnel Q-TOF 液相色譜-質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）; Varian Cary 300紫外-可見分光光度計（美國瓦里安技術(shù)有限公司）; 穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（美國PTI公司）; FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）; Milli-Q去離子水純化儀（美國Millipore公司）; pH計（上海雷磁設(shè)備有限公司）。

4-甲基吡啶和4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑（NBD-Cl，阿拉丁試劑有限公司）; 碘甲烷（西亞試劑有限公司）; 4-羥基苯甲醛（先進技術(shù)和工業(yè)有限公司）; 哌啶（美國Sigma-Aldrich公司）; 其它試劑均購于北京化學(xué)試劑公司。所用試劑均為分析純，使用前未作進一步純化。

2.2 熒光探針的合成和表征

探針的合成路線如圖1所示。

2.2.1 1，4-二甲基吡啶碘化物（2）的合成[27] 將1.96 mL 4-甲基吡啶（20 mmol）和1.56 mL碘甲烷（25 mmol） 溶于20 mL乙腈中，加熱回流12 h。冷卻到室溫，抽濾得到淡黃色固體2 （4.14 g，產(chǎn)率 88%）。1H NMR （DMSO-d6， 400 MHz） δ （ppm）： 2.60 （s， 3H）， 4.28 （s， 3H）， 7.95～7.97 （d， 2H）， 8.83～8.84 （d， 2H）。13C NMR （DMSO-d6， 100 MHz）， δ （ppm）： 21.29， 47.14， 127.90， 144.44， 158.16。

2.2.24-（4-羥基苯乙烯基）-1-甲基吡啶碘化物（1）的合成[27] 將2.35 g（10 mmol）化合物2和1.83 g（15 mmol）4-羥基苯甲醛溶于30 mL無水乙醇中，加入0.5 mL哌啶，攪拌回流10 h。冷卻，過濾得到紅色固體（化合物1），產(chǎn)率81%。1H NMR （DMSO-d6， 400 MHz）， δ （ppm）： 4.13 （s， 3H）， 6.65～6.67 （d， 2H）， 7.03～7.07 （d， 1H）， 7.50～7.52 （d， 2H）， 7.84～7.88 （d， 1H）， 7.96～7.97 （d， 2H）， 8.60～8.601（d， 2H）。 13C NMR （DMSO-d6， 100 MHz）， δ （ppm）： 46.15， 116.14， 117.65， 121.65， 131.01， 142.19， 144.02， 153.21. ESI-MS m/z： [M+] calcd for C14H14NO， 212.1075; found， 212.1137。

2.2.3 （E）-甲基-4-（4-（7-硝基苯并[1，2，5]惡二唑-4-氧基）苯乙烯基吡啶碘化物（MCY-NBD）的合成[21] 將0.678 g（2 m mol）化合物1和0.4 g（2 m mol）NBD-Cl溶解在30 mL乙醇中，加入0.83 mL（6 mmol）三乙胺，室溫攪拌，過夜。沉淀過濾，乙醇洗滌。以二氯甲烷-甲醇（5∶1，V/V）為洗脫劑，經(jīng)硅膠柱分離，得到棕色固體，收率70%。

1H NMR （DMSO-d6， 400 MHz）， δ （ppm）： 4.26（s， 3H）， 6.85～6.87 （d， 1H）， 7.52～7.59 （m， 3H）， 7.95～7.97 （d， 2H）， 8.05～8.09 （d， 1H）， 8.22～8.24 （d， 2H）， 8.66～8.68 （d， 1H）， 8.85～8.87 （d， 2H）. 13C NMR （DMSO-d6， 100 MHz）， δ （ppm）： 47.00， 110.70， 121.36， 123.64， 124.01， 130.42， 130.71， 133.70， 135.36， 139.13， 144.43， 145.22， 145.42， 152.22， 152.42， 154.36。 ESI-MS m/z： [M+] calcd for C20H15N4O+4， 375.1093; found， 375.1098。

2.3 紫外-可見吸收光譜和熒光光譜測量

準確稱取MCY-NBD溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配成濃度為0.01 mol/L的儲備液。將生物硫醇、Na2S、各種氨基酸和陰陽離子溶于蒸餾水，配制成0.1 mol/L的溶液，備用。光譜測量時，用二甲基亞砜-磷酸鹽緩沖溶液（DMSO-PBS，1∶1， V/V， pH 7.4）將MCY-NBD儲備液稀釋到10 μmol/L，然后測量熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。在測定探針和硫醇的響應(yīng)時，將MCY-NBD儲備液用DMSO-PBS （1∶1， V/V， pH 7.4）稀釋到10 μmol/L，分別加入100 μmol/L不同硫醇，室溫下進行熒光光譜的測量。在用相同方法稀釋的MCY-NBD（10 μmol/L）中加入不同濃度的各種硫醇溶液，室溫下反應(yīng)5 min后，測量熒光響應(yīng)。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬帶均為2.0 nm。

2.4 量子產(chǎn)率的測定

MCY-NBD和化合物1在不同溶劑中的熒光量子產(chǎn)率按照公式（1）測定[42]，結(jié)果見表1。

Φ_x=Φ_st（D_x/D_st）（A_st/A_x）（η²_x/η²_st） （1）

式中， Φst為基準物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，D為熒光發(fā)射光譜的面積，A為吸光度值， η為所用溶劑的折光率，x代表被測樣品，st代表基準物質(zhì)。選擇硫酸奎寧作為基準物，其在0.1 mol/L H2SO4中的熒光量子

2.5 細胞毒性實驗

以HeLa細胞為模型，采用MTT實驗考察MCY-NBD和MCY-NBD與GSH反應(yīng)后的產(chǎn)物的細胞毒性。將HeLa細胞接種在96-孔板上，每孔加入200 μL DMEM細胞培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清FBS），5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育15 h后，實驗組分別加入不同濃度的溶解在DMSO中的MCY-NBD溶液及MCY-NBD與GSH的混合溶液（[MCY-NBD]=0、1、5、10、15和20 μmol/L; [GSH]=20 μmol/L）; 同時設(shè)置對照組（細胞、200 μL DMEM培養(yǎng)基）和無細胞組（直接加200 μL DMEM培養(yǎng)基）作為調(diào)零組，96孔板邊緣孔用無菌PBS填充，置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中。孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移除培養(yǎng)基，在每個孔中加入150 μL DMSO，恒溫振蕩10 min，用酶標儀測定490 nm處各孔的吸光值（OD值）。通過公式（2）計算細胞存活率[43，44]：

Cell viability （%）=[OD_490（E）-OD_490（Z）]/[OD_490（C）-OD_490（Z）] × 100%（2）

其中， E代表實驗組， Z代表調(diào)零組， C代表對照組。

2.6 細胞成像

將HeLa細胞置于DMEM培養(yǎng)基中（含10% FBS）培養(yǎng)，隨后將細胞接種在培養(yǎng)皿中，于5% CO2、37℃條件下中培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，細胞用PBS緩沖溶液洗滌，分別進行如下4個實驗：（1）HeLa細胞與MCY-NBD （10 μmol/L）共孵育30 min; （2）HeLa細胞與NEM （1.0 mmol/L） 共孵育30 min，然后加入MCY-NBD （10 μmol/L）共孵育30 min; （3）HeLa細胞與NEM （1.0 mmol/L） 共孵育30 min然后加入GSH （100SymbolmA@mol/L）共儲備1 h， 最后加入MCY-NBD （10 μmol/L）共孵育30 min; （4）HeLa細胞與H2O2 （200 μmol/L）反應(yīng)30 min，接著加入MCY-NBD （10 μmol/L）共孵育30 min。孵育好的細胞用PBS洗滌3次，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細胞成像。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針與硫醇響應(yīng)的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜

考察了探針MCY-NBD與硫醇反應(yīng)前后的熒光強度隨溶液pH值的變化情況。如圖2所示， 當pH<6時，探針本身的熒光強度（526 nm處）不受pH值變化的影響; 隨著pH值逐漸增大，探針的熒光強度略有增強; 當pH>8，探針熒光強度增強顯著。探針溶液中加入GSH后，在pH 3.9～10.2范圍內(nèi)，反應(yīng)體系于526 nm處的熒光強度先增強后減弱，在pH=6～7時，體系的熒光強度達到最大，接近生理pH范圍。因此，為了最終應(yīng)用于細胞成像研究，在后續(xù)的光譜實驗中，選用DMSO-PBS緩沖溶液（pH 7.4， 1∶1， V/V）作為反應(yīng)介質(zhì)。

在硫醇存在下，分別采用紫外-可見吸收光譜和熒光光譜考察探針的響應(yīng)情況。如圖3所示，MCY-NBD在343 nm處有最大吸收，摩爾吸收系數(shù)（εmax）為4.81 × 104 L/（mol·cm）; 加入硫醇后，其最大吸收波長發(fā)生明顯紅移（λmax =388 nm，εmax =4.96 × 104 L （mol·cm）。

圖4A為探針MCY-NBD的激發(fā)和發(fā)射光譜，其最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為455 nm和526 nm;

圖4B為化合物1的激發(fā)和發(fā)射光譜，最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為390 nm和526 nm。推測的反應(yīng)機理如圖1所示，探針與硫醇反應(yīng)后生成化合物1; 結(jié)合圖3的吸收光譜，

加入硫醇后反應(yīng)體系的最大吸收峰位于388 nm，因此后續(xù)實驗中，探針與硫醇反應(yīng)體系的熒光光譜選擇激發(fā)波長為390 nm。MCY-NBD本身的熒光量子產(chǎn)率很低（表1），這是由于NBD對羥基的影響降低了氧原子的供電子能力（圖1）; 加入不同的硫醇（GSH、Cys和Hcy）后，熒光強度迅速增加，在2 min內(nèi)達到最大值。如圖5A所示，加入GSH后，體系熒光最大發(fā)射波長有約3 nm的藍移; 而加入Cys和Hcy后，體系的最大熒光發(fā)射波長紅移了2 nm，～526 nm處的熒光強度增加約8～9倍，推測是由于硫醇的SH誘導(dǎo)MCY-NBD的醚鍵斷裂，釋放出4號位的羥基，從而引起探針熒光信號增強。Na2S的加入使其熒光強度增加較為緩慢（圖5B），因此可通過反應(yīng)速率的差異區(qū)分硫醇和Na2S。

3.2 硫醇的定量測定

如圖6所示，探針的熒光強度隨硫醇（GSH（圖6A）、Cys（圖6B）和Hcy（圖6C））濃度的增加而增強，熒光增強程度與硫醇濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢測濃度均為0.1 μmol/L。圖6D 為MCY-NBD與GSH反應(yīng)的熒光強度隨時間的變化，探針與硫醇反應(yīng)在2 min內(nèi)熒光信號達到最大值，且在2 h測定時間內(nèi)其熒光強度值基本保持不變，說明此探針能快速地與硫醇反應(yīng)，且熒光信號穩(wěn)定性良好。

3.3 探針對硫醇響應(yīng)的選擇性

考察了其它的含硫物質(zhì)以及生命體系中可能存在的小分子與MCY-NBD的響應(yīng)情況。如電子版文后支持信息圖S1所示，當GSH、Cys、Hcy、Na2S、氨基酸（Gly、Ala、Glu、Arg、Lys、Trp、Pro、Ser、His、Leu、Thr、Val、Phe）、常見陰離子（Cl^-、Br^-、NO^3-、NO^2-、AcO^-、SCN^-、CO₂^-3、SO^2-₄、SO^2-₃）以及金屬離子（K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Al3+、Fe3+）與MCY-NBD反應(yīng)5 min后，GSH、Cys、Hcy使探針的熒光強度顯著增加，Na2S也有明顯的增加，而其它物質(zhì)未引起熒光強度明顯改變。這進一步證明，MCY-NBD對硫醇具有選擇性響應(yīng)，可應(yīng)用于細胞內(nèi)硫醇的選擇性檢測， 且不受其它物質(zhì)的干擾。

3.4 探針對硫醇傳感的機理研究

為了研究MCY-NBD的傳感機理，以GSH為代表物，采用高分辨質(zhì)譜分析了MCY-NBD和GSH以及二者反應(yīng)后的產(chǎn)物。如電子版文后支持信息圖S2所示，MCY-NBD和GSH的分子離子峰分別為m/z 375.1098和3080904; 在MCY-NBD和GSH反應(yīng)體系的質(zhì)譜圖上觀察到m/z 212.1114和3080942的峰，分別對應(yīng)化合物1和過量的GSH，說明GSH的加入誘導(dǎo)MCY-NBD的醚鍵斷裂，從而釋放出4號位的羥基，生成化合物1。同時，質(zhì)譜圖上還觀察到m/z 471.0923的峰，其為MCY-NBD和GSH反應(yīng)后生成的化合物3（如圖1所示），即NBD基團直接與GSH的S原子鏈接后的產(chǎn)物。這進一步證明了探針MCY-NBD熒光強度較弱，是由于NBD對羥基的影響降低了氧原子的供電子能力所致，當探針與硫醇反應(yīng)后，硫醇的SH誘導(dǎo)MCY-NBD的醚鍵斷裂，釋放出4號位的羥基，從而引起探針熒光信號增強。

3.5 MCY-NBD探針細胞成像

考察了MCY-NBD對細胞中硫醇的檢測和熒光成像能力。

如圖7所示，將HeLa細胞與MCY-NBD（10 μmol/L）共孵育30 min，細胞呈現(xiàn)明亮的綠色熒光（圖7A），這是由于細胞中內(nèi)生的硫醇與探針反應(yīng)的結(jié)果。為了證實探針在細胞環(huán)境中對硫醇的選擇性響應(yīng)，選用硫醇封阻劑N-乙基馬來酰亞胺[45]（1.0 mmol/L）對HeLa細胞進行預(yù)處理，30 min后與探針（10 μmol/L）共孵育，幾乎觀察不到細胞熒光（圖7B）。將NEM預(yù)處理過的細胞與GSH（100 μmol/L）孵育1 h，然后加入MCY-NBD（10 μmol/L），細胞發(fā)出強的綠色熒光（圖7C）。當HeLa細胞與H2O2（200 μmol/L）共孵育30 min，隨后加入MCY-NBD（10 μmol/L），細胞的綠色熒光強度明顯減弱（圖7D）。結(jié)果表明，H2O2的加入引起細胞內(nèi)硫醇濃度的降低，導(dǎo)致熒光強度減弱。因此，此探針能被用于檢測細胞內(nèi)硫醇濃度的改變。MTT實驗證實，MCY-NBD和MCY-NBD與GSH的反應(yīng)產(chǎn)物具有低的細胞毒性（圖8）。

以上實驗結(jié)果表明，此探針有良好的生物相容性、細胞膜通透性和低毒性，能靈敏地檢測細胞內(nèi)硫醇的濃度。

4 結(jié) 論

在接近生理pH值范圍（6.0～7.0）內(nèi)， 本研究合成的生物硫醇熒光探針MCY-NBD對硫醇具有高靈敏和快速響應(yīng)，熒光強度增加約8～9倍，并且具有好的光穩(wěn)定性和對生物硫醇的選擇性響應(yīng)。此探針具有低毒性和良好的生物相容性，可用于細胞內(nèi)硫醇的選擇性檢測和成像，以及監(jiān)測細胞內(nèi)硫醇濃度的改變。

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Synthesis and Properties of Fluorescent Probe for Detection

of Biothiols in Live Cells

NIU Wei-Fen1，2， ZHANG Chao1， JIA Juan1， YUN Ke-Ming1， SHUANG Shao-Min2，

DONG Chuan*2， WONG Man Shing*3

1（School of Forensic Medicine， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China）

2（Institute of Environmental Science， College of Chemistry and Chemical Engineering，

Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

3（Department of Chemistry and Institute of Molecular Functional Materials， Hong Kong Baptist University， Hong Kong， China）

Abstract A highly sensitive biothiols-selective fluorescent probe （MCY-NBD） was developed based on the merocyanine fluorophore of 4-（4-hydroxy styryl）-1-methyl pyridine iodide （MCY） and nitro benzo furazan （NBD） as the biothiols-specific recognition group. Upon reacting with biothiols， the probe showed a strong fluorescence enhancement more than 8-fold and very fast response. Moreover， the fluorescence intensity change of MCY-NBD at 526 nm was found to be linearly proportional to biothiols concentrations in the range of 0.1-4.0 μmol/L with a detection limit of 0.03 μmol/L， indicating that MCY-NBD was highly sensitive to biothiols. Confocal laser scanning microscopic imaging experiment proved that MCY-NBD had excellent biocompatibility and cell membrane permeability with low cytotoxicity， which was desirable for fast detection and visualization of both endogenous and exogenous biothiols in live cells.

Keywords Biothiols; Fluorescent probe; Cells imaging