多重巢式固相PCR-Array芯片用于高致病性病原微生物并行檢測

朱燦燦　崔俊生　胡安中　楊柯　趙俊　劉勇　鄧國慶　朱靈

摘 要 提出了一種多重巢式固相PCR的方法，以微流控芯片為載體，采用紫外交聯(lián)方式將寡核苷酸序列固定在芯片上，構建了陣列式固相PCR-陣列（PCR-Array）芯片，用于細菌和病毒類高致病性病原微生物的并行檢測。選擇新疆出血熱病毒、埃博拉病毒、炭疽桿菌和布魯氏菌4種代表性高致病性病原微生物為研究對象，通過基因工程手段構建了包含有炭疽桿菌和布魯氏菌特異性基因片段的重組質(zhì)粒載體，利用病毒包裝技術構建了包含有兩種病毒特異性基因片段的逆轉錄病毒顆粒，完成了4種高致病性病原微生物陽性標準品的制備，并以此作為實驗樣本，探究了多重巢式固相PCR-Array芯片的制備方法和擴增體系。結果表明，在優(yōu)化的實驗條件下，多重巢式固相PCR-Array芯片檢測4種高致病性病原微生物的檢出限達10 copy/μL以下量級。本方法靈敏度高，特異性好，同時，引物空間上的隔離避免了相互干擾，提高了檢測通量，在多種病原微生物快速并行檢測方面具有良好的應用前景。

關鍵詞 高致病性病原微生物; 多重; 巢式固相PCR-陣列芯片

1 引 言

根據(jù)物種來源不同，高致病性病原微生物可分為病毒類、細菌類、放線菌、真菌、衣原體、立克次體和螺旋體，其中以病毒和細菌類為主，如病毒類的埃博拉病毒（Ebola）、新疆出血熱病毒（克里米亞-剛果出血熱病毒， Crimea-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）和寨卡病毒等; 細菌類如炭疽桿菌（Bacillus anthracis）、布魯氏菌（Brucella）、鼻疽伯克菌和土拉熱弗朗西思菌等[1]。世界衛(wèi)生組織（WHO）的研究數(shù)據(jù)顯示，高致病性病原微生物引起的傳染性疾病是人類發(fā)病率和死亡率的重要組成部分，是威脅人類健康和造成社會恐慌的主要因素[2]。建立多種高致病性病原微生物的快速并行檢測方法，對提升疫情防控能力具有重要意義[3～5]。

傳統(tǒng)的病原微生物檢測方法主要有基于微生物培養(yǎng)的菌落鑒定法和基于特異性抗原抗體結合的免疫學方法[6，7]，這些方法操作復雜、耗時長，需3～4 d才能完成[8]，且靈敏度低，無法滿足高致病性病原微生物快速檢測的要求[9，10]。基于聚合酶鏈式反應（PCR）技術的核酸檢測方法具有特異性好、靈敏度高、速度快的優(yōu)勢[11～14]，已被廣泛應用于病原微生物快速檢測。但普通PCR主要針對多個樣品同一個靶點的檢測[15]，當面對未知感染源樣本時，常需同時對包括細菌和病毒在內(nèi)的多種病原微生物進行篩查，一次 PCR 反應需要完成多個靶點檢測[16～18]。傳統(tǒng)的管式多重 PCR由于引物間相互干擾和熒光檢測通道有限，一次最多只能同時擴增3～4個目的基因[19]。近年來出現(xiàn)的固相PCR（Solid phase PCR，SP-PCR）解決了不同引物間相互干擾的難題[20，21]; 它通過將特異性引物固定在玻璃基片上，使得擴增后生成的PCR產(chǎn)物錨定在芯片上，避免了多重PCR引物間的干擾，同時增大了通量且不受熒光檢測通道限制，可實現(xiàn)多達105個目標基因的并行檢測[22～24]。微流控芯片作為新型微納分析技術平臺，將生物和化學等領域所涉及的樣品制備、分離與檢測等基本操作單元集成在一塊數(shù)平方厘米的芯片上，具有多種單元技術在整體可控的微小平臺上靈活組合、規(guī)模集成的特征和優(yōu)勢[25～27]。微流控PCR芯片因其消耗樣本少、成本低、升降溫速率快等優(yōu)點[28]，已廣泛應用于病原微生物快速檢測中。

本研究將微流控芯片與固相PCR技術相結合，針對細菌類和病毒類高致病性病原微生物快速并行檢測的難題，建立了一種多重巢式固相PCR-Array芯片檢測新方法。對陣列式芯片制備方法和多重巢式固相PCR反應體系進行了優(yōu)化，提高了檢測的特異性和靈敏度。選用具有代表性的新疆出血熱病毒、埃博拉病毒、炭疽桿菌和布魯氏菌4種高致病性病原微生物作為研究對象，由于缺少真實樣品來源，采用人工合成方法制備了炭疽桿菌和布魯氏菌的DNA重組質(zhì)粒。同時，利用逆轉錄重組病毒技術構建了包含有新疆出血熱病毒和埃博拉病毒特異性基因序列的逆轉錄病毒顆粒，模擬了真實RNA類病毒在PCR擴增中的逆轉錄過程，建立了基于多重巢式固相PCR-Array芯片的4種高致病性病原微生物檢測方法。結果表明，本方法靈敏度達10 copy/μL以下量級，具有特異性好、靈敏度高、反應速度快等優(yōu)勢，在臨床診斷、環(huán)境污染監(jiān)測和防治生物突發(fā)事件等方面具有廣闊的應用前景。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CL-1000紫外交聯(lián)儀（德國Analytikjena公司）; Nanodrop-2000超微量紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）; 5804R高速離心機（德國Eppendorf公司）; 等離子體清洗機（美國Harrick Plasma 公司）; 生物安全柜（新加坡Esco公司）; ADV-I0006芯片點樣儀（博奧公司）; 微流控熒光PCR儀（自行研制）[29]; 實時熒光定量PCR儀LightCycle96（瑞士羅氏公司）; 純水機（摩爾公司）; CO2培養(yǎng)箱（博訊公司）。

聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）前體和固化劑（Sylgard 184， 美國DowCorning公司）; 檸檬酸鈉緩沖液（SSC）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、PUC57人工質(zhì)粒載體（上海生物生工有限公司）; Probe qPCR Mix、Bgl II/XhoI內(nèi)切酶（TaKaRa公司）; 逆轉錄病毒載體pDON-5、pGP和pE-ampho（TaKaRa（中國）公司）; 新疆出血熱病毒、埃博拉病毒、炭疽桿菌和布魯氏菌特異性基因片段及引物均由上海生物生工有限公司合成，引物序列見表1。

2.2 實驗方法

2.2.1 炭疽桿菌、布魯氏菌重組質(zhì)粒和新疆出血熱、埃博拉逆轉錄病毒顆粒的構建 在NCBI數(shù)據(jù)庫中，查找新疆出血熱病毒、埃博拉病毒、炭疽桿菌以及布魯氏菌4種病原微生物各分型的序列信息，通過序列比對，獲得各病原微生物的保守性序列，以該序列作為目的片段，用來篩查和檢測4種病原微生物。由上海生工生物工程有限公司合成以上4種特異性片段，并將其分別連接到PUC57克隆載體上，以此載體轉化大腸埃希菌DH5α，經(jīng)純化后制成重組DNA質(zhì)粒，依次命名為PUC57-CCHFV、PUC57-Ebola、PUC57-Bacillus anthracis、PUC57-Brucella。分別將PUC57-CCHFV、PUC57-Ebola質(zhì)粒和逆轉錄病毒載體pDON-5進行Bgl II/XhoI雙酶切，純后化回收進行連接，制備成重組逆轉錄病毒載體pDON-CCHFV和pDON-Ebola，經(jīng)培養(yǎng)鑒定后，與病毒包裝載體pGP和pE-ampho共轉染293T細胞（提前置于37℃、5% CO2條件下靜止培養(yǎng)24 h）， 48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)DNase酶消解后，提取RNA，通過實時熒光RT-PCR鑒定是否完成逆轉錄病毒顆粒的包裝，反應體系包括：上下游引物各1 μL、RT-PCR mix 10 μL， 模板2 μL、二次去離子水6 μL，共計20 μL。RT-PCR反應程序設置如下： 50℃運行15 min后， 以95℃運行15 s， 55℃運行30 s，72℃運行45 s為1個循環(huán)，運行40個循環(huán)。

2.2.2 固相PCR-Array芯片制作 利用三維設計軟件Solidworks設計出芯片模板的數(shù)字模型，采用機械精加工方式制作銅質(zhì)芯片模具。因聚二甲基硅氧烷（PDMS）具有優(yōu)良的光學特性、良好的生物兼容性、較高的熱穩(wěn)定性，是微流控芯片制備中使用較多的聚合物材料。將PDMS 前聚體與固化劑按質(zhì)量比10∶1混合，于真空箱中除去氣泡，澆注到模具表面，95℃固化3 h，脫模后形成PDMS基片。將玻璃片（25 mm×25 mm）浸泡在濃H2SO4-H2O2混合液（10∶1， V/V）中15 min，取出，用大量去離子水沖洗干凈，去除表面污漬。使用芯片點樣儀將固相引物以微陣列形式點至玻璃片表面，單個圓點直徑0.5 mm，點間距1.2 mm。自然晾干后，將玻璃片放置于波長為254 nm的紫外交聯(lián)儀中進行固化，取出玻璃片，使用0.1×SSC 和0.1% SDS混合液沖洗，再使用去離子水多次沖洗，除去未交聯(lián)上的引物序列。晾干后，將PDMS基片與固定有引物序列的玻璃片共同放置于氧等離子體清洗機中處理45 s后，立刻取出鍵合，完成固相PCR-Array芯片制作。

引物固定采用紫外交聯(lián)方式進行，由于引物序列上連接有一段TC寡聚核苷酸序列，在紫外光作用下可固定于玻璃片表面，且在高溫條件下，仍具有較高的穩(wěn)定性。固相引物交聯(lián)時間設置2～12 min，共11個梯度，濃度分別為50 μmol/L和100 μmol/L，探究兩種固定引物濃度下，固相PCR-Array芯片制作中引物的最佳固定時間。

2.2.3 多重巢式固相PCR體系優(yōu)化實驗 將濃度分別為25、50、75、100、125和150 μmol/L的固相引物序列固定于芯片上，同時，將上下游引物濃度比分別設置為4∶1和2∶1，探究不同引物濃度組合對多重巢式固相PCR-Array芯片擴增效率的影響。該部分優(yōu)化實驗，以5.62×104 copy/μL的埃博拉病毒陽性標準品RNA為模板，反應體系如下：游離上下游引物各1 μL、RNA 2 μL、RT-PCR Mix 10 μL、ddH2O 6 μL，共20 μL。在微流控熒光PCR儀上采用如下反應條件進行RT-PCR溫度設置如下： 42℃逆轉錄5 min， 95℃退火10 s; 巢式SP-PCR第一階段： 95℃ 10 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 25 cycles; 巢式SP-PCR第二階段： 95℃ 20 s， 62℃ 30 s， 72℃ 30 s，? 20 cycles。反應結束后，使用0.1×SSC 和0.1% SDS混合液沖洗反應腔。使用自行研制的微流控熒光PCR儀對芯片的檢測結果進行成像，通過Image J分析軟件對芯片上相應熒光點（每個點重復6次）的灰度值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，然后使用OrignPro8.0處理數(shù)據(jù)。

2.2.4 多重巢式固相PCR-Array芯片檢測4種病原微生物的特異性和靈敏度實驗 分別以濃度為104 copy/μL量級的4種病原微生物陽性樣本為模板，進行多重巢式固相PCR實驗，擴增程序設置如2.2.3節(jié)所述，驗證多重巢式固相 PCR-Array芯片檢測4種病原微生物的特異性。依次將4種病原微生物陽性樣本進行10倍梯度稀釋，使其終濃度為105～100 copy/μL量級，并以此為模板，進行巢式固相PCR反應，擴增條件設置和數(shù)據(jù)處理方法同2.2.3節(jié)，驗證多重巢式固相 PCR-Array芯片的檢測靈敏度。

3 結果與討論

3.1 檢測原理

由于固相PCR將擴增反應中的一條引物序列固定在玻璃基片上，使得固相引物利用率較低，因此，固相PCR相對于液相PCR，其檢測靈敏度低，且易出現(xiàn)因引物二聚體導致檢測結果的假陽性，因而限制了固相PCR的廣泛應用。本研究在傳統(tǒng)固相PCR基礎之上，結合微流控芯片，提出了多重巢式固相 PCR-Array芯片技術，檢測原理如圖1所示。連有一段poly（T）10-poly（C）10序列的固相引物通過紫外交聯(lián)方式固定在微流控芯片表面，在PCR擴增的第一階段，游離在反應體系中的上下游引物在低退火溫度下與DNA模板結合并擴增，生成帶有熒光標記的擴增產(chǎn)物; 在PCR擴增的第二階段，以第一階段的PCR產(chǎn)物為模板，同時，提高退火溫度，利用芯片上的固相引物進行擴增，使得新生成的產(chǎn)物固定在玻璃基片上。隨著PCR循環(huán)數(shù)增加，芯片上各固定點積累的產(chǎn)物量也隨之增多，待反應結束后，通過檢測各固定點熒光信號，實現(xiàn)待測病原微生物的檢測。巢式固相PCR擴增方法將PCR過程分成兩個階段進行，并在第一階段擴增反應中增加了一條引物，達到富集目標基因的目的; 再通過第二階段PCR擴增反應中固相引物的引入，使得擴增產(chǎn)物固定在芯片上 ，提高了檢測靈敏度及特異性。本研究僅選擇4種具有代表性的高致病性病原微生物作為檢測對象，但根據(jù)篩查范圍需要，可同時將幾十個甚至幾百個篩查位點固定在芯片上，在一張芯片上即可完成多種病原微生物的同時檢測，具有檢測速度快、通量高和節(jié)省試劑的優(yōu)勢。

3.2 固相PCR-Array芯片制備方法對擴增效率的影響

固相PCR-Array芯片是多重巢式固相PCR檢測方法的核心。大量研究表明，不同的引物固定方法是影響固相PCR擴增效率的關鍵因素之一[28]。本研究采用紫外交聯(lián)法將帶有poly（T）10-poly（C）10寡核苷酸序列的引物固定在芯片上，若交聯(lián)時間過短，引物不能完全固定在芯片上，固相引物量較少，影響巢式PCR第二階段的擴增效率; 若交聯(lián)時間過長，紫外線會對寡聚核苷酸序列造成損傷，堿基間磷酸二酯鍵斷裂，導致堿基缺失，使得擴增不能正常進行。 分別以濃度為50和100 μmol/L的固相引物為測試對象，以5.62×104 copy/μL埃博拉病毒陽性標準品的RNA為模板，探究兩種濃度下引物的最佳固定時間。 實驗結果如圖2A所示，隨著交聯(lián)時間的持續(xù)增長，固定在芯片上的引物量增多，多重巢式固相PCR產(chǎn)物累積量也越多，熒光強度也越高。通過計算各固定點的熒光數(shù)值，繪制曲線（圖2B）。結果表明，在一定紫外交聯(lián)時間范圍內(nèi)，多重巢式固相RT-PCR擴增效率可能受到固相引物不足的限制，增長紫外交聯(lián)時間，可以增大芯片上固定引物的數(shù)量，因此可以提高固相PCR擴增效率。然而，當紫外交聯(lián)時間高于一定限度時，芯片上固定的引物量達到飽和，再增長時間，并不會影響甚至會抑制巢式固相PCR擴增。為了保證多重巢式固相PCR反應充分及擴增效率，選擇9 min作為固相引物固定時間，用于制作固相PCR-Array芯片。

3.3 多重巢式固相PCR體系優(yōu)化

引物濃度也是影響固相PCR擴增效率及檢測限的主要因素之一[30]。在本研究建立的多重巢式固相PCR方法中，液相引物以一定比例存在于PCR反應體系中; 若液相上下游引物比值過高，說明上游引物過多，而帶有熒光標記的下游引物較少，在巢式固相PCR的第二階段中，上游引物會競爭抑制固相引物與模板的結合，因此影響第二階段的擴增效率; 若液相上下游引物比值過低，則直接影響第一階段液相PCR擴增效率，使得第一階段擴增產(chǎn)物量較少，影響巢式固相PCR終產(chǎn)物數(shù)量。另外，由于固相PCR是通過檢測固定點的熒光信號實現(xiàn)待測目標的判定，因此，固相引物濃度直接影響了巢式固相PCR方法的檢出限。 本研究將濃度為25～150 μmol/L的引物固定在芯片表面，以5.62×104 copy/μL埃博拉病毒陽性標準品的RNA為模板，在游離液相上下游引物濃度比值分別是1∶4和1∶2條件下， 經(jīng)巢式固相RT-PCR擴增后，比較不同引物濃度組合下，芯片上固定產(chǎn)物的熒光強度。

如圖3A所示，當液相上下游引物濃度比值為1∶4時，隨著固相引物濃度的持續(xù)升高時，經(jīng)固相RT-PCR擴增后，熒光強度持續(xù)增強，在固相引物濃度為100 μmol/L時達到最大值; 但隨著引物濃度持續(xù)增加（100～150 μmol/L），熒光強度呈下降趨勢，這表明持續(xù)增加固相引物濃度不能提高固相RT-PCR擴增效率及擴增產(chǎn)物數(shù)量。因此，本研究確定固相引物最適濃度為100 μmol/L。

同時，在游離液相上下游引物濃度比值分別是1∶4和1∶2條件下（圖3B），當固相引物濃度較低時（<100 μmol/L），液相上下游引物濃度比值為1∶2的反應體系擴增效率更高，固定點熒光強度較高; 但當固相引物濃度較高（≥100 μmol/L）時， 液相上下游引物濃度比值為1∶4的反應體系擴增效率更高，固定點熒光強度顯著增強。因此，本研究確定固相引物濃度為100 μmol/L，液相上下游引物濃度比值為1∶4， 此時巢式固相RT-PCR擴增效果最佳。

3.4 多重巢式固相PCR-Array芯片檢測4種高致病性病原微生物的特異性和靈敏度

通過優(yōu)化多重巢式固相PCR擴增體系及固相PCR-Array芯片的制備方法，建立了多重巢式固相PCR檢測4種高致病性病原微生物的方法。為了驗證本方法的特異性，使用制備好的4種陽性樣本DNA或RNA為實驗樣品，并將特異性引物以一定順序固定在芯片上，如圖4所示。只有加入相應核酸樣品時，對應位置的引物固定點才有熒光信號，而其它固定點無熒光信號。上述結果表明，本研究建立的多重巢式固相PCR-Array芯片檢測4種高致病性病原微生物具有較好的特異性。同時，此芯片通量可以根據(jù)篩查范圍需要進行擴展，一張芯片可實現(xiàn)數(shù)十種甚至上百種病原微生物的檢測。當面臨突發(fā)疫情爆發(fā)時，本研究為病原微生物篩查提供了一種新的檢測方法。

通過10倍梯度稀釋4種陽性樣本DNA或RNA確定多重巢式固相PCR-Array芯片檢測4種病原微生物的靈敏度。以埃博拉病毒陽性樣品為例，采用10倍梯度稀釋方法，制備了5.62×105 copy/μL～5.62 copy/μL的實驗樣品，在優(yōu)化條件下，進行巢式固相RT-PCR，檢測結果如圖5A所示。隨著模板濃度的增加，巢式固相PCR-Array芯片各固定點熒光信號增加，表明在較高濃度下，芯片表面發(fā)生更多擴增。以相同方法，對其它3種高致病性病原微生物的靈敏度進行測試，通過計算各濃度的熒光信號強度，繪制柱形圖，結果如圖5B所示，4種高致病性病原微生物的檢出限可達10 copy/μL以下。同時，由于固相PCR是通過檢測擴增產(chǎn)物的熒光強度實現(xiàn)待測樣品的陰陽性判斷，屬于定性檢測，因此，經(jīng)梯度稀釋后的陽性樣品，其終產(chǎn)物的熒光強度和初始樣品濃度無明顯的線性關系。

4 結 論

提出了一種多重巢式固相PCR-Array芯片檢測高致病性病原微生物的新方法，將微流控芯片與固相PCR技術相結合，引入巢式非對稱PCR擴增方法，通過探究多重巢式固相PCR-Array芯片的制備方法和擴增體系，提高了本方法的檢測靈敏度及特異性，實現(xiàn)了多種細菌和病毒的并行快速檢測，極大地促進了固相PCR擴增在病原微生物檢測領域的應用。構建了包含有炭疽桿菌、布魯氏菌特異性基因序列的DNA重組質(zhì)粒和包含有新疆出血熱病毒和埃博拉病毒特異序列的逆轉錄病毒顆粒，真實模擬了PCR過程中的逆轉錄過程，首次建立了用于4種高致病性病原微生物同時檢測的多重固巢式固相PCR檢測方法，在多種病原微生物高通量并行檢測方面具有較好的應用前景。

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Anhui Provincial Engineering Technology Research Center for Biomedical Optical Instrument，

Anhui Provincial Engineering Laboratory for Medical Optical Diagnosis & Treatment

Technology and Instrument， Hefei 230031， China）

2（University of Science and Technology of China， Hefei 230026， China）

Abstract To simultaneously detect bacteria and viruses in a single test， a PCR-array chip based on solid phase PCR（SP-PCR） was developed. Ultraviolet cross-linking method was used to fix oligonucleotide sequence on the grass to develop a PCR array chip for detection of Crimea-Congo hemorrhagic fever virus （CCHFV）， Ebola virus， Bacillus anthracis and Brucella multiplex. Owing to the lack of real sample and consideration of biological safety， the vectors of Bacillus anthracis and Brucella were constructed by genetic engineering. Meanwhile， to simulate the reverse transcription process of CCHFV virus and Ebola virus， virus-like particle （VLP） containing two specific viral fragments was constructed by virus packaging technique. The primer fixation efficiency and solid-phase RT-PCR reaction system were optimized with four positive samples. The results showed that the optimum time of cross-linking was 9 min， the optimum concentration was 100 μmol/L， and the minimum detection limit of the multiplex solid-phase RT-PCR was under 10 copy/μL. This method with high sensitivity and specificity avoided mutual interference among the primers by isolation them on space and improved the detection flux. This PCR-Array chip would be widely employed for the rapid parallel detection of bacteria and viruses.

Keywords Highly pathogenic microorganisms; Multiplex; Nested solid phase PCR-Array chip