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    質(zhì)譜技術(shù)在糖尿病血液非酶促糖化蛋白分析中的應(yīng)用進(jìn)展

    2019-12-02 11:58:05李衛(wèi)峰閻德文金宇李海燕馬民吳正治
    分析化學(xué) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:評(píng)述質(zhì)譜蛋白質(zhì)

    李衛(wèi)峰 閻德文 金宇 李海燕 馬民 吳正治

    摘 要 糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝紊亂性疾病,長(zhǎng)期的高血糖生理環(huán)境會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)非酶促糖化程度加重,進(jìn)而引發(fā)一系列病理變化。因此,蛋白質(zhì)非酶促糖化引起了研究者的關(guān)注。質(zhì)譜技術(shù)因具有超高靈敏度、低檢出限和多組分同時(shí)分析的優(yōu)勢(shì),成為蛋白質(zhì)定性和定量分析不可或缺的有力工具,已被應(yīng)用于非酶促蛋白翻譯后修飾信息的鑒定和定量分析。本文主要對(duì)蛋白質(zhì)非酶促糖化的產(chǎn)生原理及質(zhì)譜在血液中非酶促糖化蛋白的修飾鑒定分析的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述,并對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

    關(guān)鍵詞 質(zhì)譜; 非酶促糖化; 蛋白質(zhì); 糖尿病; 評(píng)述

    1 引 言

    蛋白質(zhì)非酶促糖化是指不經(jīng)酶催化,糖類分子與蛋白質(zhì)中氨基酸殘基ε側(cè)鏈或末端的α氨基的反應(yīng)過程。非酶促糖化最先會(huì)生成可逆的醛亞胺(Schiff堿的中間產(chǎn)物),而后經(jīng)分子重排形成穩(wěn)定的酮胺化合物(Amadori product),再經(jīng)過氧化、降解及交聯(lián)等反應(yīng), 最終形成多種異質(zhì)產(chǎn)物,即糖化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs),詳細(xì)過程如圖1所示[1]。AGEs會(huì)在細(xì)胞內(nèi)累積,并與其它受體作用,導(dǎo)致機(jī)體組織損傷,這些過程與糖尿病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。研究AGEs的分布、周期及其代謝規(guī)律,可在微觀水平研究糖尿病,助力尋找具有糖尿病診斷價(jià)值的標(biāo)志物,具有重要的臨床研究?jī)r(jià)值[2]。

    AGEs檢測(cè)方法多樣,利用光譜法可根據(jù)糖化基質(zhì)的顏色變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程,但無法識(shí)別糖化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)[3]。高效液相色譜法可用于糖化產(chǎn)物的精確檢測(cè),但方法的特異性弱[4]?;谔禺愋钥贵w的免疫檢測(cè)技術(shù)特異性強(qiáng),在蛋白質(zhì)的總體糖化水平檢測(cè)中起著重要作用,但存在操作要求高、抗體制備周期長(zhǎng)、復(fù)雜基體中易受干擾等缺點(diǎn),很難實(shí)現(xiàn)非酶促蛋白的大規(guī)模檢測(cè),尤其不能檢測(cè)未知的AGEs。近年來,基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)策略迅速發(fā)展并日漸成熟,是蛋白質(zhì)及翻譯后修飾定性與定量分析的強(qiáng)有力工具。AGEs在糖尿病人群中普遍存在,而II型糖尿病又占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%以上[5],因此,本文主要針對(duì)質(zhì)譜技術(shù)在II型糖尿病患者血液中非酶促糖化蛋白的定性與定量分析研究進(jìn)行評(píng)述,并對(duì)未來發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

    2 蛋白質(zhì)非酶促糖化生物學(xué)原理

    蛋白質(zhì)非酶促糖化不僅限于葡萄糖,核糖、半乳糖及糖代謝中間產(chǎn)物(如丙酮醛、乙二醛)均可進(jìn)行此反應(yīng)。因葡萄糖為人體主要營(yíng)養(yǎng)物, 所以糖化反應(yīng)以葡萄糖為主。研究表明,經(jīng)非酶促糖化后的蛋白結(jié)構(gòu)與性質(zhì)均會(huì)產(chǎn)生變化[6]。如非酶促糖化可改變肌紅蛋白(Myoglobin, Mb)的空間構(gòu)象,導(dǎo)致Mb的各種生物功能(如氧釋放、過氧化物酶以及水解酶活性等)均發(fā)生了改變[7]。此外,同一蛋白的不同糖化產(chǎn)物的空間結(jié)構(gòu)也有差異,如Khan等[8]研究發(fā)現(xiàn),與乙二醛、甘油醛相比,丙酮醛化后的人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)空間結(jié)構(gòu)變化最為明顯。已有的臨床研究表明,AGEs與包括糖尿病、腎病、阿爾茲海默癥等在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[8,9],因此,研究AGEs對(duì)深入了解諸多疾病至關(guān)重要。

    由于蛋白非酶促糖化涉及的反應(yīng)物種類復(fù)雜,AGEs最大的特點(diǎn)及研究難點(diǎn)在于其自身的空間結(jié)構(gòu)異質(zhì)性,即使單一的葡萄糖修飾仍會(huì)產(chǎn)生不同種空間結(jié)構(gòu),因?yàn)榈鞍踪|(zhì)本身含有多個(gè)可與糖類進(jìn)行結(jié)合的位點(diǎn)。通常認(rèn)為,酸度系數(shù)值越小的氨基酸因親和能力強(qiáng)會(huì)促進(jìn)其糖化,然而糖化程度還受氨基酸周圍環(huán)境的影響。當(dāng)氨基酸(如賴氨酸)臨近位置(序列臨近或空間臨近)存在帶有正電荷的氨基酸(如組氨酸、賴氨酸\,酸性氨基酸)時(shí),會(huì)促進(jìn)其糖化[10,11]。如糖化血紅蛋白(Glycated hemoglobin,GHb)的β鏈-N末端纈氨酸糖化程度高于α鏈-N末端纈氨酸的原因在于,前者鄰位氨基酸為組氨酸。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn),血紅蛋白的α鏈和β鏈中共有的HGKK肽段均因?yàn)榇嬖诮M氨酸和賴氨酸,同時(shí)擁有可為糖化反應(yīng)重排提供質(zhì)子轉(zhuǎn)移路徑的磷酸三角結(jié)構(gòu)(Phosphate triangle),詳見圖2。由圖2可知,α鏈和β鏈中HGKK可獲得相似的結(jié)構(gòu)。由質(zhì)譜結(jié)果得知,HGKK中僅臨近組氨酸的β-Lys-66, α-Lys-61被糖化。由此可見,蛋白質(zhì)非酶促糖化包含著豐富的生物學(xué)信息,闡明其糖化后的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-功能之間的關(guān)系及生物學(xué)意義,可為疾病發(fā)生及發(fā)展機(jī)制研究提供新的線索。

    3 質(zhì)譜用于非酶促糖化蛋白的分析

    由于蛋白非酶促糖化的異常變化可導(dǎo)致一系列病變,因此,蛋白非酶促糖化的研究顯得異常重要。質(zhì)譜因具有超高靈敏度、優(yōu)異檢出限和多組分同時(shí)分析等優(yōu)勢(shì),加之質(zhì)譜軟件和硬件的快速發(fā)展、各種色譜分離技術(shù)和涌現(xiàn)出的多種翻譯后修飾的富集方法,為蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ),其在非酶促糖化蛋白的定性和定量分析也獲得一定進(jìn)展,其中涉及的質(zhì)譜技術(shù)及其特點(diǎn)見表1。

    3.1 MALDI-TOF MS用于非酶促糖化蛋白分析

    基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)因其主要產(chǎn)生分子離子峰,具有質(zhì)譜圖簡(jiǎn)單、自動(dòng)化高和分析通量高等優(yōu)勢(shì),在化合物定性研究中發(fā)揮了重要的作用?;贛ALDI技術(shù)用于蛋白分析常規(guī)的流程如圖3所示。將目標(biāo)蛋白分子或酶解后的多肽配制成μmol/L濃度水平,并與芥子酸(Sinapic acid,SA)或α-氰-4-羥

    基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA)等基質(zhì)溶液以1∶1~1∶10的體積比混合,點(diǎn)樣于樣品板靶,待自然干燥形成結(jié)晶后,進(jìn)行質(zhì)譜分析。目前,MALDI-TOF MS已被用于血紅蛋白、血漿蛋白等多種蛋白糖化的分析,并展現(xiàn)了潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

    3.1.1 MALDI-TOF MS用于血漿中AGEs分析 首次將MALDI-TOF MS應(yīng)用于AGEs分析要追溯至20世紀(jì)90年代,Lapolla等[13,14]研究了牛血清白蛋白分子量與孵育時(shí)間和葡萄糖濃度的關(guān)系。在糖尿病人群中,高血糖濃度會(huì)顯著加快以HSA為代表的血漿蛋白的糖化過程。通過測(cè)定HSA的糖化水平,可反映2~3周前的血糖控制情況,有助于制定血糖濃度控制的短期方案。利用MALDI-TOF MS可視化地讀取HSA及其糖化的分子量,可簡(jiǎn)便、快速反映患者血糖控制情況。MALDI-TOF MS同樣可獲取不同人血液中免疫球蛋白(Immunoglobulins,Igs)糖化程度,結(jié)果表明,Igs結(jié)合的糖分子數(shù)分布如下:血糖控制較差組>血糖控制達(dá)標(biāo)組>健康組[15]。此外,MALDI-TOF MS可分析木瓜蛋白酶解產(chǎn)物中的抗原結(jié)合片段(Fragment of antigen binding,F(xiàn)ab)和可結(jié)晶段(Fragment crystallizable,F(xiàn)c)。MALDI-TOF MS的結(jié)果表明,糖類分子更傾向與Fab片段結(jié)合,從微觀水平上揭示了糖尿病患者免疫缺陷的原因[16]。

    MALDI-TOF MS是獲取整體血漿蛋白糖化程度的有效手段,但不能提供修飾位點(diǎn)的具體信息[17]。將蛋白分子酶解成多肽小分子,同時(shí)引入同位素標(biāo)記技術(shù),可有效解決以上問題。Hage研究組[18~21] 利用MALDI-TOF MS結(jié)合16O和18O標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)了糖化HSA修飾肽段的定量分析(圖4),但該方案只適合體外研究。利用同一肽段在NaBH4和NaBD4作用下質(zhì)量數(shù)差1 Da的特征, Liu等[22]實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)糖化肽段鑒定及定量分析。然而,1 Da的質(zhì)量數(shù)偏差易受肽段本身的同位素峰干擾,難以應(yīng)用于實(shí)際分析。Tong 等[23]將糖化蛋白分別經(jīng)NaBH3CN和NaBD3CN還原,并將酶解后的肽段產(chǎn)物分別利用CH2O和CD2O進(jìn)行二甲基化,使最后同一種肽段的質(zhì)量數(shù)相差變?yōu)?m+3n(其中m代表N-末端和賴氨酸殘基的數(shù)目,n代表糖化位點(diǎn)數(shù)目),該方案可有效進(jìn)行人血漿蛋白質(zhì)的非酶促糖化定量分析,具體實(shí)驗(yàn)原理見圖5。

    3.1.2 MALDI-TOF MS用于GHb分析 與糖化HSA相比,GHb半衰期周期長(zhǎng),其濃度只與紅細(xì)胞壽命和體內(nèi)血糖的平均濃度相關(guān),且不受運(yùn)動(dòng)或食物的影響,在臨床上代表了近2~3個(gè)月內(nèi)的血糖濃度平均值,是國(guó)際公認(rèn)的用于評(píng)估糖尿人病血糖狀況的金標(biāo)準(zhǔn)[24]。因GHb在臨床診斷中占有重要地位,所以MALDI-TOF MS對(duì)GHb以定量研究為主。雖然早期MALDI-TOF MS的結(jié)果與常規(guī)方法(液相法、免疫法等)有所區(qū)別,但證實(shí)了血紅蛋白α和β鏈均會(huì)發(fā)生非酶促糖化反應(yīng)[25~27]。

    MALDI-TOF MS的優(yōu)勢(shì)在于其獲得的譜圖簡(jiǎn)單易分析、定性分析能力強(qiáng),但激光本身能量的高斯分布及基質(zhì)樣品結(jié)晶不均勻等因素的存在,使其很難獲得理想的定量分析結(jié)果。為克服以上難點(diǎn),在優(yōu)化基質(zhì)結(jié)晶條件基礎(chǔ)上增加激光的采樣頻率可有效彌補(bǔ)樣品結(jié)晶不均勻帶來的信號(hào)波動(dòng)[28]。Biroccio等[29]優(yōu)化了SA與血紅蛋白樣品的結(jié)晶效果后通過確保每次采樣獲得的離子總數(shù)一致,可同時(shí)實(shí)現(xiàn)GHb和谷胱甘肽血紅蛋白的定量分析,其日間和日內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC)要求。受益于儀器靈敏度的不斷提高、優(yōu)異的采樣速度(激光頻率由10 Hz增加1 kHz)和數(shù)據(jù)分析速度,Hattan等[30]將MALDI-TOF MS技術(shù)應(yīng)用于糖化血紅蛋白的定量分析,性能極大提升,通過高頻率激光對(duì)同一樣品(僅需0.5 nL血樣)進(jìn)行全掃描采樣,并對(duì)所獲得譜圖進(jìn)行平均處理,可使結(jié)果的精度大大提高(RSD≤2.5%),獲得的β-Hb糖化結(jié)果與臨床驗(yàn)證的HPLC的結(jié)果一致。為了充分發(fā)揮MALDI-TOF MS高通量、快速分析的本領(lǐng),Li等[31]采用激光輻照技術(shù)輔助加速蛋白酶解, 并以N-末端多肽為目標(biāo),在多肽層面上實(shí)現(xiàn)了8 h內(nèi)定量分析2000個(gè)樣品中的GHb。其中,上樣、酶解、激光輻照、分析等步驟全部在同一樣品靶完成,避免了傳統(tǒng)的繁瑣樣本預(yù)處理過程。隨著質(zhì)譜儀器的不斷升級(jí)和激光頻率的繼續(xù)提升,將進(jìn)一步拓寬MALDI-TOF MS在蛋白質(zhì)的非酶促糖化的應(yīng)用范圍。

    3.2 ESI-MS用于非酶促糖化蛋白分析

    MALDI-TOF MS用于非酶促糖化蛋白的高通量定性定量分析的優(yōu)勢(shì)突出,但固體制樣方式并不適用于分析所有蛋白。ESI-MS的液體進(jìn)樣方式不僅可實(shí)現(xiàn)蛋白的定性和定量分析,還可反映蛋白質(zhì)的固有狀態(tài)[32,33]。由于ESI-MS進(jìn)樣口可與色譜檢測(cè)器末端相互兼容,尤其適用于分析復(fù)雜基體的樣本,因此被廣泛應(yīng)用于血液中AGEs鑒定[34],其常規(guī)的鑒定流程如圖6所示,首先將細(xì)胞或組織破碎提取蛋白質(zhì),對(duì)特定的蛋白進(jìn)行富集、酶解,獲得多肽進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行二級(jí)或多級(jí)質(zhì)譜分析,并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及搜庫。

    3.2.1 ESI-MS/MS用于血漿中AGEs分析 Lapolla等[34]利用LC-MS/MS研究發(fā)現(xiàn)糖化反應(yīng)會(huì)降低HSA的酶解效率,并獲得了5個(gè)(233K、276K、378K、545K、525K)易被糖化位點(diǎn),與理論計(jì)算結(jié)果吻合。雖然酶解后的肽段可直接進(jìn)行質(zhì)譜分析,并獲得修飾信息,但易缺失糖化程度較低的位點(diǎn)信息。利用硼酸親和富集方式可提高糖化修飾位點(diǎn)鑒定信息[35,36]。Zhang等[37]采用該方法并結(jié)合電子轉(zhuǎn)移解離技術(shù)(Electron transfer dissociation,ETD)鑒定到76種血漿蛋白和31種紅細(xì)胞膜蛋白同時(shí)被糖化,其中糖尿病患者體內(nèi)蛋白糖化和修飾位點(diǎn)數(shù)均高于健康者。在對(duì)血漿蛋白、血漿低豐度蛋白和紅細(xì)胞膜蛋白富集后的糖化肽段進(jìn)行陽離子交換,獲取不同餾分,并進(jìn)行質(zhì)譜分析,可鑒定7749種肽段和3742種蛋白被糖化[38]。

    同位素標(biāo)記技術(shù)發(fā)展為蛋白組學(xué)研究提供了新的選擇,Priego-Capote等[39,40]利用高能碰撞解離技術(shù)(High-energy collisional dissociation,HCD)碎裂技術(shù),結(jié)合碰撞誘導(dǎo)解離(Collision-induced dissociation,CID)的碎片信息,從血漿參照物中鑒定了50種糖化蛋白和161種糖化修飾位點(diǎn),通過計(jì)算13C6和12C6葡萄糖作用糖化肽段信號(hào)強(qiáng)度比值可實(shí)現(xiàn)糖化修飾的定量分析,具體流程見圖7。由于HSA本身的選擇性糖化,利用同位素標(biāo)記技術(shù)可獲得難糖化肽段和易糖化肽段。Zhang等[41]通過將難糖化肽段作為內(nèi)標(biāo),發(fā)展了一種無需標(biāo)準(zhǔn)品、無標(biāo)記的糖化肽段的質(zhì)譜分析法,利用該方法篩選到8條可進(jìn)行糖尿病早期診斷的潛在標(biāo)志物。

    在蛋白鑒定過程中,新型離子解離方式的引入常會(huì)改善蛋白鑒定效果,Keilhauer等[42]通過優(yōu)化后的HCD對(duì)人體糖化蛋白進(jìn)行了分析。新型發(fā)展HCD有利于發(fā)現(xiàn)新的修飾位點(diǎn), 且采用1 μL血液樣本、 在單次質(zhì)譜分析條件下即可穩(wěn)定獲得101種修飾位點(diǎn)信息[42]。 除離子解離方式外,質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集模式也會(huì)影響蛋白鑒定結(jié)果。Frolov等[43]發(fā)展了一種分段采集離子(Gas phase fractionation,GPF)技術(shù),并利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了人體AGEs肽段的定性和定量分析,其中19個(gè)糖化位點(diǎn)在糖尿病患者體內(nèi)含量升高。Spiller等[44~46]利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)(Multiple reaction monitoring,MRM)精確篩選到健康者和糖尿病患者中差異表達(dá)的6種特異性糖化位點(diǎn),將結(jié)合珠蛋白的Lys-141糖化信息、GHb和空腹血糖等指標(biāo)聯(lián)合用于糖尿病診斷,方法的敏感性和特異性分別為94%和96%。人體中的糖化反應(yīng)(如羧乙基化(Carboxyethylation,CEL)和羧甲基化(Carboxymethylation, CML))被證實(shí)會(huì)參與細(xì)胞黏附、信號(hào)通路、血管再生等活動(dòng)[47]。然而,上述修飾在血漿中難以檢測(cè),常規(guī)手段需要進(jìn)行體外孵育[48]。Graifenhagen等[49]利用CEL、CML修飾肽段碎裂時(shí)產(chǎn)生的特征性碎片實(shí)現(xiàn)了人體血漿中CEL、CEL修飾,并進(jìn)行了鑒定分析,共鑒定到17種蛋白和21種CML及CEL修飾。

    在線自動(dòng)化處理技術(shù)技術(shù)的發(fā)展,推動(dòng)了非酶促糖化蛋白的分析技術(shù)的進(jìn)步。Zhang等[50]利用二維色譜分離串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在線分離富集血漿中糖化多肽及分析,方法的檢出限為1.2×10Symbolm@@12 g,相對(duì)偏差小于20%,獲得的糖化肽段數(shù)目是一維液相色譜的3倍。Jeon等[51]發(fā)展了一種可高通量進(jìn)行蛋白前處理的系統(tǒng),該系統(tǒng)將蛋白還原、烷基化、酶解、糖化肽段富集等多個(gè)步驟整合在一塊96孔板進(jìn)行,具有重現(xiàn)性好、通量高的分析優(yōu)勢(shì),對(duì)無標(biāo)記的蛋白定量分析具有重要意義。另外,隨著質(zhì)譜軟硬件的不斷升級(jí),涌現(xiàn)出多種新型采集模式,包括平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Parallel reaction monitoring,PRM)和數(shù)據(jù)非依賴性采集技術(shù)(Data-independent acquisition/Sequential window acquisition of all theoretical fragment ions,DIA/SWATH)。Korwar等[52]采用PRM、SWATH等多個(gè)定量分析策略研究了不同糖尿病表型的HSA糖化肽段的分布信息。利用PRM和SWATH技術(shù)可獲得相同的結(jié)果,均可用于篩選具有糖尿病診斷的潛在標(biāo)志物。與數(shù)據(jù)依賴性采集(Data-dependent acquisition,DDA)相比,DIA/SWATH技術(shù)無需指定目標(biāo)肽段,可無遺漏、無差異地獲得待測(cè)樣本中所有蛋白組分碎裂信息,具有重現(xiàn)性好、通量高的優(yōu)勢(shì)。DDA是蛋白質(zhì)鑒定最有效的手段,在通常情況下,DIA的定量分析能力發(fā)揮需依賴于DDA技術(shù)建立肽段譜庫。Bruderer等[53]采用DDA模式采集并建立了肥胖癥及糖尿病人群的血漿蛋白譜庫?;谝陨献V庫,在DIA模式下實(shí)現(xiàn)了1508份臨床樣本中565種血漿蛋白的重復(fù)穩(wěn)定的定量分析,并首次在未進(jìn)行糖化肽段富集的情況下定量分析了234個(gè)糖化位點(diǎn)。根據(jù)臨床資料,蛋白質(zhì)的非酶促糖化比例在減肥到體重維持穩(wěn)定期間會(huì)呈先上升后下降的生理現(xiàn)象。

    雖然Bottom-up技術(shù)是AGEs分析主流,但該技術(shù)需經(jīng)歷蛋白變性、還原、烷基化及酶切等步驟,會(huì)缺失肽段與蛋白質(zhì)之間的歸屬信息,導(dǎo)致不同修飾之間的關(guān)聯(lián)分析變得困難。自中向下(Middle-down)和自上而下(Top-down)蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展解決了上述部分問題[54]。Middle-down采用不同的酶解策略可以獲得較大肽段,相比Bottom-up方法來說,可分析的肽段范圍更廣[55]。Top-down因不需酶切過程,直接以完整蛋白質(zhì)為分析對(duì)象,提供了蛋白質(zhì)更精準(zhǔn)、更豐富的生物學(xué)信息[56~58]。由于非酶促糖化反應(yīng)涉及反應(yīng)物種類繁多,因此生成的AGEs均具備異質(zhì)性。采用Middle-down和Top-down技術(shù)可有效地對(duì)AGEs進(jìn)行規(guī)模化的蛋白質(zhì)變體鑒定[59]。Liu等[60]利用Middle-down技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)含有FC片段蛋白的快速鑒定,有效提高了異質(zhì)蛋白的多種翻譯后修飾鑒定(包括糖基化、糖化及氧化等),還可用于獲取抗體藥物在研發(fā)及臨床應(yīng)用過程中糖化修飾的動(dòng)態(tài)變化信息。人載脂蛋白A-I (ApoA-I)的含量與冠心病患病率負(fù)相關(guān),是一種調(diào)節(jié)高密度脂蛋白膽固醇流出量(HDL-E)的功能蛋白,但是ApoA-I本身含有多種異構(gòu),各個(gè)異構(gòu)體與HDL-E高低關(guān)系有待研究。Seckler等[61]利用Top-down策略對(duì)ApoA-I進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)ApoA-I含有18種異構(gòu)和11種翻譯后修飾,包括了糖化、磷酸化、羧甲基化、棕櫚?;?,其中在18種異構(gòu)體中的6種在高HDL-E值中發(fā)生了顯著性上調(diào)。

    3.2.2 ESI-MS/MS用于GHb分析 2002年,IFCC將ESI-MS認(rèn)定為GHb測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。采用高壓液相色譜法將GHb中β鏈N-末端的VHLTPE肽段進(jìn)行分離,然后采用ESI-MS對(duì)GHb進(jìn)行定量測(cè)定[62]。Priego-Capote等[63]采用同位素標(biāo)記方法定量研究了葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)物中蛋白的影響。研究表明,紅細(xì)胞中多種蛋白糖化比例與GHb值正相關(guān)。Wang等[12]分別采用胰蛋白酶、凝乳胰蛋白酶和金黃色葡萄球菌V8蛋白酶對(duì)血紅蛋白進(jìn)行酶解及糖化位點(diǎn)鑒定。利用3種酶酶切的互補(bǔ)性,可深度獲得血紅蛋白的糖化修飾信息,且各位點(diǎn)在正常人和糖尿病患者體內(nèi)有明顯差異。血紅蛋白作為紅細(xì)胞中的主要成分,除了與葡萄糖作用外,同時(shí)受其它體內(nèi)外代謝物作用,因此獲取其它修飾位點(diǎn)信息對(duì)糖尿病疾病的認(rèn)識(shí)具有重要的臨床意義。如丙酮醛化血紅蛋白在糖尿病患者的含量高于正常人[64,65],當(dāng)人體丙酮醛含量升高時(shí),會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗和典型的糖尿病代謝紊亂,似乎是糖尿病及并發(fā)癥發(fā)生的起因[66]。此外,Jagadeeshaprasad等[67]利用PRM研究了糖化、羧甲基化及羧乙基化修飾位點(diǎn)與糖尿病表型的相關(guān)性,研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合3種糖化修飾可有效評(píng)價(jià)糖尿病患病進(jìn)程。Chen等[68~71]采用nano-LC-MS/MS系統(tǒng)研究了多種修飾血紅蛋白在糖尿病吸煙患者和非吸煙患者之間的差異,獲得了吸煙對(duì)糖尿病的影響顯著性修飾信息,為研究吸煙與糖尿病的相關(guān)性提供了理論依據(jù)。

    4 總結(jié)與展望

    目前,質(zhì)譜技術(shù)在AGEs分析研究中的應(yīng)用日趨廣泛,MALDI-TOF MS可實(shí)現(xiàn)蛋白整體糖化水平,Bottom-up方式可同時(shí)獲得蛋白多種翻譯后修飾信息。但是, 非酶促糖化是一個(gè)修飾多樣性、各類修飾豐度差異大的動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程,對(duì)于含量極低的修飾,同時(shí)滿足高豐度和低豐度修飾信息的分析還具有很大的挑戰(zhàn)。另外,Bottom-up以多肽為研究主體,在酶切過程中丟失了肽段與蛋白質(zhì)之間的歸屬信息,導(dǎo)致不同修飾之間的關(guān)聯(lián)分析變得困難。充分發(fā)揮Middle-down和Top-down技術(shù)的優(yōu)點(diǎn), 獲取蛋白結(jié)構(gòu)和功能等生物學(xué)信息, 是非酶促糖化蛋白未來研究的一個(gè)發(fā)展方向。

    獲得分析速度快、穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好的定量分析結(jié)果是蛋白分析的一個(gè)難題。目前,集成化的蛋白酶解策略的發(fā)展在有效降低蛋白樣本處理時(shí)間,結(jié)合DIA具有重現(xiàn)好、通量高的優(yōu)勢(shì)將獲得更加精確、穩(wěn)定的蛋白定量信息,加上新發(fā)展的BoxCar質(zhì)譜采集方法,通過將母離子的荷質(zhì)比采集窗口分段成多個(gè)窗口,提高母離子注入時(shí)間,使高豐度和低豐度肽段信號(hào)強(qiáng)度平均化,在未進(jìn)行分離富集的情況下提升了低豐度肽段信噪比,是未來AGEs定量分析的另一個(gè)發(fā)展趨勢(shì),既滿足臨床自動(dòng)化分析策略的需求,也是順應(yīng)醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)時(shí)代的發(fā)展需要[72~75]。

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    1(Integrated Chinese and Western Medicine Postdoctoral Research Station, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

    2(The First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen 518020, China)

    3(Shenzhen Institute of Gerontology, Shenzhen 518020, China)

    Abstract Diabetes mellitus is a metabolic disorder disease characterized by hyperglycemia. Long-term physiological environment of hyperglycemia will aggravate the degree of non-enzymatic glycation proteins. Because the abnormal changes of non-enzymatic process will cause a series of pathological changes, non-enzymatic glycation proteins have attracted researchers' attention. Mass spectrometry is an indispensable and powerful analytical tool for qualitative and quantitative analysis of proteins due to its ultra-high sensitivity, excellent detection limit, and multi-component simultaneous analysis, and has been applied to the identification and qualification of non-enzymatic glycation protein. Herein, the principle of non-enzymatic proteins and the research progress of mass spectrometry in the identification and analysis of glycated plasma proteins and hemoglobin in blood were reviewed, and the development trend of this field was prospected.

    Keywords Mass spectrometry; Non-enzymatic glycation; Proteins; Diabetes mellitus; Review

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