蛋白質(zhì)組學(xué)在慢性乙型肝炎常見中醫(yī)證型中的研究

周騰騰 鄭瑩 梁恵卿 唐金模

摘要：蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸成為系統(tǒng)性認(rèn)知疾病的一種重要方法，該方法從整體角度分析不同狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，與中醫(yī)的整體觀一致，在研究中醫(yī)證候中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并在認(rèn)識(shí)多種疾病的中醫(yī)證候上取得進(jìn)展。目前蛋白質(zhì)組學(xué)在研究慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制及預(yù)后上取得一定成果，在慢性乙型肝炎常見中醫(yī)證型差異上也取得進(jìn)展。本文主要對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)在慢性乙型肝炎常見中醫(yī)證型中的研究做一綜述。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué);慢性乙型肝炎;中醫(yī)證型

中圖分類號(hào)：R259 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.20.009

文章編號(hào)：1006-1959（2019）20-0030-04

Study on Proteomics in Common TCM Syndromes of Chronic Hepatitis B

ZHOU Teng-teng1，ZHENG Ying2，LIANG Hui-qing2，TANG Jin-mo2

Abstract：Proteomics has gradually become an important method for systemic cognitive diseases. This method analyzes the dynamic changes in cells under different conditions from a holistic perspective. It is consistent with the overall view of TCM and shows unique advantages in the study of TCM syndromes. And made progress in understanding TCM syndromes of various diseases. At present， proteomics has made progress in studying the pathogenesis and prognosis of chronic hepatitis B， and has made progress in the differences in common TCM syndrome types of chronic hepatitis B. This article reviews the research of proteomics in common TCM syndromes of chronic hepatitis B.

Key words：Proteomics; Chronic hepatitis B; TCM syndromes

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是指機(jī)體感染乙型肝炎病毒后，可檢測到乙肝病毒陽性的傳染性肝病。CHB呈世界性流行，但各個(gè)地區(qū)的流行性差異很大，我國是乙肝大國，2006年全國乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國1～59歲一般人群乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）攜帶率為7.18%，經(jīng)推算，我國乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者約9300萬人，其中CHB患者約2000萬人[1]。持續(xù)性的病毒感染會(huì)導(dǎo)致肝臟損害，肝纖維化形成、肝硬化及肝癌的發(fā)生。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，篩選出和疾病發(fā)生機(jī)制、臨床診斷、治療及預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)蛋白成為可能，蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)于CHB的研究受到廣泛關(guān)注。中醫(yī)藥在慢性乙型肝炎診治中發(fā)揮著十分重要的作用，形成了慢性乙型肝炎辨證分型和治療方案，明確了中醫(yī)藥治療慢性乙型肝炎的優(yōu)勢(shì)環(huán)節(jié)[2]，多數(shù)學(xué)者通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究CHB中醫(yī)證候，為詮釋中醫(yī)現(xiàn)代化內(nèi)涵提供理論支持，本文主要對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)這一新興技術(shù)對(duì)CHB常見證型的研究作一綜述。

1蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)是人體及各種生命物質(zhì)的基本組成單位，已知的蛋白質(zhì)有一百多萬種，具有不同的組成、結(jié)構(gòu)和修飾。在生理、病理狀態(tài)下，機(jī)體的蛋白質(zhì)組具有特定的表達(dá)，機(jī)體代謝物的蛋白質(zhì)組發(fā)生變化，通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，找到這些新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)（稱為“上調(diào)”）或減少的蛋白質(zhì)（稱為“下調(diào)”），這些蛋白質(zhì)叫做“差異蛋白”[3，4]。蛋白質(zhì)組學(xué)以全面的蛋白質(zhì)研究為基礎(chǔ)，全方位對(duì)蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)機(jī)理、功能聯(lián)系等方面進(jìn)行探索。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteome）最早由澳大利亞科學(xué)家Wilkins和William于1994年在Siena雙向凝膠電泳會(huì)議上提出，于1995年7月發(fā)表在Electrophoresis雜志上，現(xiàn)在把它定義為“基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”，它與基因組相對(duì)應(yīng)，也是一個(gè)整體的概念[5]。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究層次涉及細(xì)胞、組織、器官、機(jī)體在一定狀態(tài)或者一定時(shí)間內(nèi)的蛋白質(zhì)功能的具體表達(dá)，包括了蛋白的組成、分布、種類、蛋白質(zhì)表達(dá)水平、翻譯后修飾、蛋白間的互相作用，研究著眼于蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[6]。近年來蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)進(jìn)展為深入研究提供了契機(jī)，如常用的熒光差異雙向凝膠電泳能在動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)對(duì)相應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量，固相pH梯度雙向電泳體系可分析復(fù)雜蛋白質(zhì)復(fù)合物，而雙向高效液相色譜技術(shù)，其分離蛋白質(zhì)的容量較熒光差異雙向凝膠電泳大，且操作簡單、速度快，通過與質(zhì)譜結(jié)合，既可在常溫下分離制備水溶性物質(zhì)，又具有高溫、高效、高分辨率和高靈敏度等特點(diǎn)。隨著計(jì)算機(jī)軟件分析的廣泛運(yùn)用，可在樣品分離后，處理蛋白質(zhì)表達(dá)的數(shù)據(jù)，尋找表達(dá)的差異點(diǎn)后切割酶解，并分析鑒定，確定其種類、組成和修飾，搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對(duì)比確定蛋白質(zhì)的信息，蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中比較理想的技術(shù)平臺(tái)[7]。

2蛋白質(zhì)組學(xué)與中醫(yī)辨證論治

中醫(yī)的“證”是生命物質(zhì)在疾病過程中具有時(shí)相性的本質(zhì)的反映，“候”是病變的臨床表現(xiàn)。證候?qū)嵸|(zhì)的研究一直是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的熱點(diǎn)，研究認(rèn)為中醫(yī)證候之間的差異性具有特定的微觀基礎(chǔ)。近年來，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)的進(jìn)展為中醫(yī)證候?qū)W研究提供微觀層次的理論支持，蛋白質(zhì)組學(xué)是一種系統(tǒng)化的研究方法，它著眼于將研究對(duì)象作為一個(gè)完整的系統(tǒng)進(jìn)行研究，且具有特定時(shí)間、特定狀態(tài)下的特異性表達(dá)的特點(diǎn)，與中醫(yī)證候的整體觀、恒動(dòng)觀、辨證論治十分相似[8]。蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化與機(jī)體的動(dòng)態(tài)演變具有一致性，能夠在微觀層次說明中醫(yī)證候的差異，是實(shí)現(xiàn)微觀辨證的重要技術(shù)，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可進(jìn)一步說明中醫(yī)同病異證及異病同證的理論基礎(chǔ)，解釋中醫(yī)證型的物質(zhì)基礎(chǔ)，更深層次的了解變化規(guī)律，建立“證蛋白質(zhì)表達(dá)譜”，理解中醫(yī)證候的客觀內(nèi)涵，為中醫(yī)辨證的客觀化提供依據(jù)與方法[9，10]。

目前蛋白質(zhì)組學(xué)在多種疾病的中醫(yī)辨證論治中取得一定研究進(jìn)展，其差異性表達(dá)能夠?yàn)榕R床辨證論治提供依據(jù)，在心、腎、腦等重要臟器的疾病證候認(rèn)識(shí)上已有廣泛運(yùn)用。胡小勤等[11]選擇高血壓病氣虛血瘀證和肝陽上亢證患者各40例進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)差異蛋白有27個(gè)，其中有11個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，16個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。熊新貴等[12]通過對(duì)比10例健康人與13例高血壓病肝陽上亢證患者的血清蛋白質(zhì)組，用凝膠電泳技術(shù)檢測出500個(gè)蛋白點(diǎn)，與健康組對(duì)比發(fā)現(xiàn)16個(gè)明顯差異的蛋白點(diǎn)，肝陽上亢患者血清中血清銅藍(lán)蛋白、甲基-天冬氨酸蛋白受體、維生素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白等表達(dá)均上調(diào)，糖蛋白表達(dá)下調(diào)。王剛等[13]對(duì)冠心病心血瘀阻證和心腎陰虛證這兩種證候之間差異進(jìn)行研究，共發(fā)現(xiàn)10種差異表達(dá)蛋白，其中7種表達(dá)上調(diào)，3種表達(dá)下調(diào)。涉及的通路主要有補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路及阿爾茲海默癥信號(hào)通路。研究認(rèn)為補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路及阿爾茲海默癥信號(hào)通路與冠心病心血瘀阻證和心腎陰虛證的中醫(yī)分型有關(guān)。盧德趙[14]通過凝膠內(nèi)差異顯示電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)藥物性腎陽虛能夠?qū)е聶C(jī)體多種功能代謝紊亂，并從肝線粒體蛋白質(zhì)組角度闡述腎陽虛與能量代謝的關(guān)系。蛋白質(zhì)組學(xué)在一定程度上反映疾病不同證候間的生物學(xué)差異，檢測差異蛋白仍是目前研究的熱點(diǎn)。

3蛋白質(zhì)組學(xué)與CHB

目前蛋白質(zhì)組學(xué)在CHB的研究應(yīng)用中涉及發(fā)病機(jī)制、療效預(yù)測等方面。Liu F等[15]使用基于蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定技術(shù)，將自發(fā)性HBsAg血清清除組和CHB患者組對(duì)照，發(fā)現(xiàn)血漿纖連蛋白可能與HBsAg血清清除有關(guān)，并可能成為“功能性治愈”的預(yù)測因子。Dai YN等[16]通過檢查不同纖維化階段CHB患者的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，來尋找肝纖維化S2期的血清生物標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)139種差異蛋白，其中凝膠蛋白2（ficolin-2）和羧肽酶B2（carboxypeptidase B2）在患者和健康對(duì)照組間有明顯差異，并可能參與CHB發(fā)病機(jī)制。Makjaroen J等[17]在CHB患者的臨床試驗(yàn)中測試了干擾素λ（IFN-λ），其只存在于上皮細(xì)胞中，故副作用相比干擾素α（IFN-α）局限，其蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)表明干擾素λ3（IFN-λ3）抑制細(xì)胞中的HBV復(fù)制、降低HBV轉(zhuǎn)錄物和細(xì)胞內(nèi)HBVDNA的水平。She S等[18]為了獲得關(guān)于CHB發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步信息，并尋找用于抗CHB治療的新型推定分子，采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)來鑒定在HBV DNA轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞系及其親本HepG2細(xì)胞系中差異表達(dá)的分泌蛋白，總共檢測到133種獨(dú)特蛋白差異表達(dá)，其中ENPP2（Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2 precursor）是與HBV復(fù)制相關(guān)的上調(diào)最顯著的分泌蛋白之一，該研究表明ENPP2可能是一種新的抗HBV靶標(biāo)，抑制其表達(dá)可能抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

4蛋白質(zhì)組學(xué)與CHB中醫(yī)證型

中醫(yī)學(xué)中無CHB的病名，但從其發(fā)病特點(diǎn)及其臨床表現(xiàn)來看，將其歸屬于“脅痛”“黃疸”“肝著”“瘟疫”“積聚”范疇，關(guān)于辨證分型的標(biāo)準(zhǔn)，2004年湖北宜昌標(biāo)準(zhǔn)中將CHB分為五個(gè)證型：肝郁脾虛證、肝腎陰虛證、肝膽濕熱證、脾腎陽虛證、瘀血阻絡(luò)證，具體描述了每個(gè)證型的辨證要點(diǎn)，近十余年來，CHB的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)無明顯變化。2018年中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肝膽病分會(huì)制定的《CHB中醫(yī)診療指南》將CHB中醫(yī)證型分為肝膽濕熱證、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證、瘀血阻絡(luò)證、脾腎陽虛證[19]。

現(xiàn)階段，對(duì)CHB證候的差異蛋白研究正在逐漸系統(tǒng)化，蛋白質(zhì)組學(xué)與中醫(yī)證候的動(dòng)態(tài)變化明顯相關(guān)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)志性差異蛋白仍是目前的研究熱點(diǎn)。周明德[20]運(yùn)用iTRAQ技術(shù)篩選出CHB肝郁脾虛證與正常組的血清差異表達(dá)蛋白，共篩選出30個(gè)血清差異表達(dá)蛋白，其中22個(gè)上調(diào)，8個(gè)下調(diào)，運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)選定的CHB肝郁脾虛證差異表達(dá)蛋白等進(jìn)行驗(yàn)證，得出PSMA6（proteasome subunit alpha type-6）、PF4V（platelet factor 4 variant）作為CHB肝郁脾虛證的證候特異性表達(dá)蛋白較為可靠，PSMA6在治療前與健康對(duì)照組比較表達(dá)趨勢(shì)上調(diào)，研究發(fā)現(xiàn)PSMA6蛋白可能是CHB肝郁脾虛證療效動(dòng)態(tài)變化的預(yù)測標(biāo)志物，對(duì)CHB肝郁脾虛證的早期診斷、治療及預(yù)后的判斷有重要意義。楊健坤[21]通過對(duì)比CHB肝郁脾虛證與脾胃濕熱證，發(fā)現(xiàn)PF4V、PSMA6可作為可靠的肝郁脾虛證候特異表達(dá)蛋白，F(xiàn)ETUA（alpha-HS-glycoproteine）、CATC（dipetidyl peptidase 1）、PLTP（Phospholipid transfer protein）則可作為CHB肝膽濕熱證可靠的特異表達(dá)蛋白。楊利超[22]的研究顯示，TUBAIA（tubulin alpha-1A chain）是CHB肝郁脾虛證的生物標(biāo)志物，功能可能與酶活性調(diào)節(jié)代謝過程、脂質(zhì)代謝、結(jié)合、催化活性、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答有關(guān)系，ACTA2（actin，aortic smooth muscle）、ACTG2（actin，gamma-enteirc smooth muscle）、ZNF628（zinc ifnger protein 628）、DEFA1（neutrophil defensin 1）、DEFA3（Nneutrophil defensin3）、CaM（calmodulin）為濕熱證的潛在標(biāo)志物，可能與肌動(dòng)蛋白、免疫反應(yīng)、細(xì)胞殺傷、細(xì)胞凋亡、刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)、結(jié)合、催化活性有關(guān)。Yang J等[23]采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定30名肝郁脾虛證和30名肝膽濕熱證患者的潛在血清蛋白生物標(biāo)志物，在842個(gè)檢測到的蛋白質(zhì)中，分別有273和345個(gè)在患者與健康對(duì)照組間差異表達(dá)。兩種證型共有142種上調(diào)蛋白和84種下調(diào)蛋白，其中幾種蛋白已被報(bào)道為候選生物標(biāo)志物，包括免疫球蛋白相關(guān)蛋白，補(bǔ)體成分，載脂蛋白，熱休克蛋白，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白質(zhì)和α-2-巨球蛋白。

陳文莉等[24]通過對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，共發(fā)現(xiàn)7個(gè)差異表達(dá)蛋白，主要包括免疫相關(guān)蛋白，炎癥蛋白以及脂類代謝相關(guān)蛋白，驗(yàn)證了CHB肝郁脾虛證和濕熱中阻證間存在多個(gè)差異表達(dá)蛋白，提示不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜可能是同病異證的分子基礎(chǔ)，各證型中免疫球蛋白J鏈（IGJ）表達(dá)均有升高，其中肝郁脾虛證IGJ表達(dá)量比濕熱中阻證中的高，濕熱中阻證中表達(dá)異常的蛋白質(zhì)主要屬于急性時(shí)相和脂類代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)，臨床表現(xiàn)濕熱越重，肝功能損害越重，故反應(yīng)急性時(shí)相的蛋白質(zhì)如C反應(yīng)蛋白（CRP）、血清淀粉蛋白酶在濕熱中阻中較正常人表達(dá)明顯升高。載脂蛋白（APO-A1、APO-C2和APO-C3）在CHB各證型組與正常人對(duì)照組相比有明顯下降，可能與肝細(xì)胞損傷后影響載脂蛋白生理合成有關(guān)。

蛋白質(zhì)組學(xué)在證候差異上具有鮮明特點(diǎn)，分析證候間的差異蛋白與CHB免疫狀態(tài)下的不同特點(diǎn)，可進(jìn)一步與中醫(yī)理論相結(jié)合，建立“證蛋白質(zhì)表達(dá)譜”。馮培民[25]運(yùn)用差異蛋白組學(xué)方法將CHB的肝膽濕熱、肝郁脾虛、脾胃濕熱證型與健康人對(duì)比，其中肝郁脾虛證與肝膽濕熱證比較上調(diào)的蛋白有59個(gè)，下調(diào)的蛋白有64個(gè)，肝郁脾虛證與脾胃濕熱證比較上調(diào)的蛋白有32個(gè)，下調(diào)的蛋白有188個(gè)，脾胃濕熱證與肝膽濕熱證比較上調(diào)的蛋白有189個(gè)，下調(diào)的蛋白有21個(gè)，各個(gè)組間差異蛋白表達(dá)情況不同，脾胃濕熱證與肝膽濕熱證在實(shí)驗(yàn)通路信息學(xué)分析中有顯著差異的通路是hsa04145，與吞噬、細(xì)胞粘附作用有關(guān)，肝郁脾虛證與脾胃濕熱證有顯著差異的通路是hsa04514，與細(xì)胞粘附分子、丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸有關(guān)，除此以外，各組與健康人對(duì)比，蛋白組成均有明顯差異。郭芳宏[26]通過雙向電泳技術(shù)分離CHB濕熱中阻、肝郁脾虛和瘀血阻絡(luò)三證型患者外周血總蛋白來建立相應(yīng)蛋白質(zhì)圖譜，對(duì)比發(fā)現(xiàn)CHB患者的不同證型間存在同病異證的蛋白圖譜區(qū)別，在濕熱中阻證中差異表達(dá)的與炎癥有關(guān)的急性時(shí)相CRP、結(jié)合珠蛋白升高，而肝郁脾虛證中蛋白譜差異表現(xiàn)在肝功能狀況的前白蛋白表達(dá)較正常人降低，但較其他兩種證型下降程度輕，提示肝郁脾虛證的肝臟損傷水平或較其他兩種證型更接近正常人水平，瘀血阻絡(luò)證中表達(dá)蛋白涉及免疫與炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白如IGJ鏈的特異性表達(dá)，其中結(jié)合珠蛋白大幅度降低提示瘀血阻絡(luò)證。

5總結(jié)

蛋白質(zhì)組學(xué)在辨證論治中能夠發(fā)揮其自身的優(yōu)勢(shì)，在CHB不同中醫(yī)證型的差異蛋白研究仍處于探索階段，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來探討證候，發(fā)現(xiàn)并揭示與證候形成相關(guān)的功能性蛋白質(zhì)及其特征，在整體蛋白質(zhì)表達(dá)水平上闡釋證候的本質(zhì)仍是目前的研究熱點(diǎn)。CHB證候間的蛋白水平差異潛在機(jī)制已有初步認(rèn)識(shí)，多種差異蛋白顯示中醫(yī)不同證型具有自身特定的生物學(xué)基礎(chǔ)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究中醫(yī)證候具有十分長遠(yuǎn)的影響，兼顧個(gè)體的特征并詮釋疾病共性，尋找相關(guān)蛋白與中醫(yī)證候的聯(lián)系、拓展并精確發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵蛋白，從蛋白質(zhì)組學(xué)角度揭示中醫(yī)證候、為辨證論治、評(píng)估預(yù)后提供更多的可能性，為臨床用藥的選擇、防治及慢性乙型肝炎向肝纖維化、肝硬變的發(fā)生、發(fā)展提供指導(dǎo)，相較于傳統(tǒng)的診斷方法和單一的生化指標(biāo)更符合發(fā)展趨勢(shì)。

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收稿日期：2019-8-7;修回日期：2019-8-15

編輯/肖婷婷