針刺對(duì)腦梗死大鼠骨骼肌ATP酶及血清CK、LDH活性的影響

張懿+施靜+馮斯峰+劉梅芳+陳致宏+杜福生

摘要：目的從骨骼肌損傷標(biāo)志酶的活性改變?nèi)胧?，探討針刺?duì)腦梗死后骨骼肌運(yùn)動(dòng)功能的改善作用，以進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制。方法健康雄性SD大鼠100只，體重（192±9）g，隨機(jī)分為頭針組、體針組、頭針+體針組，模型組和空白組。每組20只。采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦梗死模型，并應(yīng)用Zea-Longa的5級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)造模大鼠進(jìn)行篩選。每組分別于針刺治療后即刻、24 h、48 h股動(dòng)脈取血離心，檢測(cè)ATP酶、CK、LDH活性。結(jié)果①模型組ATP酶活性在0h明顯低于空白組（P<0.001），并與24h至48h之間回升；與模型組相比，頭針加體針治療組在0h（P<0.001），24h（P<0.01），48（P<0.05）小時(shí)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，體針組在24h有顯著性差異（P<0.001），增加ATP酶活性的作用達(dá)到峰值；頭針組在0h差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。②模型組CK活性在48h明顯高于空白組（P<0.001）；與模型組相比，三個(gè)針刺組中CK含量有明顯變化，頭針加體針治療組在0h（P<0.05），24h（P<0.05），48h（P<0.01）差異均具有可比性；體針組在0h，48h有顯著性差異（P<0.01）；頭針組在24h有顯著性差異（P<0.05）③模型組CK活性在0h、12h、48h均明顯高于空白組（P<0.001）；與模型組比較，三個(gè)針刺組中LDH含量均有明顯變化，頭針加體針治療組在0h（P<0.01）、24h（P<0.05）均具有可比性，體針組在48h有顯著性差異（P<0.01），頭針組在0h有顯著性差異（P<0.01）。④頭針+體針組與體針組在改變ATP、CK、LDH含量的變化方面無顯著差異（P>0.05）。結(jié)論針刺可以增加ATP酶活性，降低血清CK及LDH活性，提高骨骼肌有氧酵解，增加肌細(xì)胞膜通透性，減輕骨骼肌損傷。

關(guān)鍵詞：針刺；腦缺血；大鼠；骨骼肌；ATP酶、CK、LDH活性

中圖分類號(hào)：R255.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）04-0087-04Effects of Acupuncture on ATPase and Serum CK and LDH Activity

in Skeletal Muscle of Rats with Cerebral Infarction

ZHANG Yi1， SHI Jing2， FENG Si-feng2， LIU Mei-fang2， CHEN Zhi-hong2， DU Fu-sheng1

（1. Yunnan Uinversity of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， Yunnan；

2. Yunnan Traditional Chinese Medicine Hospital， Kunming 650021， Yunnan）

【Abstract】Objective： To study the effect of acupuncture on skeletal muscle motor function after cerebral infarction， and to reveal its mechanism from the changes of skeletal muscle injury marker enzyme activity. Methods： 100 healthy male SD rats weighing 192±9 g were randomly divided into a scalp acupuncture group， a body acupuncture group， a scalp + body acupuncture group， a model group and a blank group， 20 rats per group. The suture method was used to establish rat models of focal cerebral infarction and Zea-Longa's five-level scoring standard was used to screen the model rats. The activity of ATPase， CK and LDH of each group were measured by centrifugation at 24 h and 48 h after acupuncture treatment. Results： 1. The activity of ATPase in the model group was significantly lower than that in the blank group （P<0.001） at 0h， and recovered from 24h to 48h. Compared with the model group， the scalp acupuncture group showed significant differences at 0h （P<0.001）， 24h（P<0.01）， and at 48h （P<0.05）. The body acupuncture showed the significant difference at 24h（P<0.001）and the effect of increasing activity of ATPase reached the peak. The scalp acupuncture group showed the difference was statistically significant. 2. CK activity in the model group was significantly higher than that in blank group at 48h （P<0.001）. Compared with model group， CK contents in three acupuncture groups significantly changed at 0h （P<0.05）， 24h （P<0.05） and 48h （P<0.01）.The differences were comparable. The body acupuncture group had significant difference at 0h and 48h （P<0.01）. The scalp acupuncture had significant difference at 24h （P<0.05）. 3. CK activity in the model group was significantly higher than that in the control group （P<0.001） ， at 0h， 12h and 48h. Compared with the model group， the levels of LDH in the three acupuncture groups significantly changed. The difference of the scalp + body acupuncture group was comparable， at 0h （P<0.01） and 24h （P<0.05）. The body acupuncture group had significant difference at 48h （P<0.01）. And the scalp acupuncture group had significant difference at 0h （P<0.01）. 4. The scalp + body acupuncture group had no significant difference in the changes of ATP， CK and LDH contents （P>0.05）. Conclusion： Acupuncture can increase the activity of ATPase， decrease the activity of serum CK and LDH， improve the aerobic glycolysis of skeletal muscle， increase the permeability of muscle membrane and reduce skeletal muscle injury.

【Key words】acupuncture， cerebral ischemia， rat， skeletal muscle. ATPase， CK， activity of LDH

腦梗死具有極高的致殘率，超過2/3的腦梗死患者伴有肢體功能障礙[1～2]，主要包括骨骼肌無力、關(guān)節(jié)攣縮以及肌肉萎縮等。骨骼肌的繼發(fā)性損傷是導(dǎo)致肢體功能障礙的主要原因之一，現(xiàn)代研究表明腦梗死后4 h即可以觀察到患側(cè)骨骼肌適應(yīng)性的改變[3]，從而導(dǎo)致肌肉運(yùn)動(dòng)模式的改變，引起肢體功能障礙[4]。針刺作為一門傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，治療腦梗死后肢體功能障礙療效顯著[5-6]，近年來，已應(yīng)用多種客觀指標(biāo)觀察針刺對(duì)腦梗死的恢復(fù)作用，如血液流變[7]、免疫機(jī)制[8]、神經(jīng)保護(hù)因子等[9]，但針刺對(duì)腦梗死后骨骼肌的恢復(fù)作用的研究尚不多見。課題組前期開展多中心、大樣本研究已證實(shí)針刺可有效促進(jìn)腦梗死患者骨骼肌功能的恢復(fù)。也有研究證明穴位電刺激可改變大鼠骨骼肌ATP酶、CPK、LDH，并可改變骨骼肌細(xì)胞胞漿內(nèi)游離鈣濃度，對(duì)肌肉快速收縮和舒張產(chǎn)生積極效果[10～11]。為進(jìn)一步探索針刺對(duì)腦梗死大鼠骨骼肌損傷后的改善作用機(jī)制，本試驗(yàn)基于能量代謝的基礎(chǔ)上，觀察不同針刺時(shí)間對(duì)骨骼肌ATP酶、CK、LDH活性的變化的影響。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料2月齡健康雄性SD大鼠100只，體重（192±9）g，購(gòu)于昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK2010-0006）。實(shí)驗(yàn)室溫度（24±2）℃，濕度（50±5）%，光照時(shí)間8：00-20：00，自由飲水和進(jìn)食，普通大鼠飼料購(gòu)于昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。術(shù)前12h禁食。

1.2腦梗死模型的建立以10%水合氯醛（4 mL/kg）注射于大鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行麻醉，均保留自主呼吸。麻醉后采用腔內(nèi)線栓法制備大鼠左側(cè)中動(dòng)脈局灶性腦梗死模型。大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)頸部備皮，于頸部正中偏左側(cè)切口，逐層分離右側(cè)的頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，并于頸總動(dòng)脈近心端及 “V”型分叉處放置動(dòng)脈夾，將尼龍線末端點(diǎn)涂石蠟形成光滑線頭，置入兩動(dòng)脈夾之間，長(zhǎng)度約18 mm，直至稍遇阻滯感停止進(jìn)線，結(jié)扎線栓及頸總動(dòng)脈，以防止出血和線栓脫落，放開動(dòng)脈夾，縫合皮膚。

1.3模型納入排除標(biāo)準(zhǔn)參照Z(yǔ)ea-Longa的5級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)造模大鼠進(jìn)行篩選[12]，0分提示未見神經(jīng)病學(xué)征象；1分提示輕度局灶性神經(jīng)功能缺失，大鼠被提尾懸空時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢呈屈曲、抬高狀等；2分提示中度局灶性神經(jīng)功能缺失，出現(xiàn)向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)征象；3分提示重度局灶性神經(jīng)功能缺失，有向癱瘓側(cè)跌倒征象；4分提示無自發(fā)活動(dòng)及意識(shí)水平下降。評(píng)分在1-3分為造模成功。以下兩種情況為造模失敗，予以剔除：①實(shí)驗(yàn)過程中大鼠死亡。②規(guī)定時(shí)間處死動(dòng)物時(shí)見有蛛網(wǎng)膜下腔出血或頸內(nèi)動(dòng)脈分叉部出血。

1.4實(shí)驗(yàn)分組蘇醒后大鼠按照上述方法進(jìn)行評(píng)分，參加試驗(yàn)大鼠共100只，模型制備過程中死亡6只，造模失敗9只，最終1-3分共85只大鼠納入試驗(yàn)。按照數(shù)字隨機(jī)表法分為頭針組、體針組、頭針+體針組，模型組和空白組。每組17只。組間動(dòng)物體重均無顯著性差異。

1.5針刺干預(yù)方案大鼠取穴的定位及針刺手法均參照華興邦等研制的《大鼠穴位圖譜》。頭針組：針刺大鼠的頭穴：百會(huì)、風(fēng)府，留針5 min，每日1次；體針組：針刺大鼠后會(huì)、環(huán)跳、前三里、陽(yáng)陵泉、后三里，留針5 min，每日1次；頭針+體針組：針刺大鼠的百會(huì)、風(fēng)府、后會(huì)、環(huán)跳、前三里、陽(yáng)陵泉、后三里，留針5 min，每日1次；模型組：造模后不施加任何刺激；空白組：空白對(duì)照不造模，正常喂養(yǎng)

1.6標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)分別于每組針刺即刻、24 h、48 h于大鼠腹主動(dòng)脈取血，采用南京建成生物工程研究所提供的ATP酶（產(chǎn)品貨號(hào)A016-2）、CK（產(chǎn)品貨號(hào)A032）、LDH（產(chǎn)品貨號(hào)A020-2）試劑盒和帝肯酶標(biāo)儀（型號(hào)：Sunrise RC TS TC，產(chǎn)地：奧地利）進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法報(bào)告中所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選擇LSD 法，以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1針刺不同時(shí)刻對(duì)大鼠ATP酶活性的影響由表1、圖1可以看出，與模型組相比，頭針加體針治療組在0、24、48 h差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，體針組在24 h有顯著性差異（P<0.001），增加ATP酶活性的作用達(dá)到峰值；頭針組在0h差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2針刺不同時(shí)刻對(duì)大鼠CK活性的影響由表2、圖2可以看出，模型組CK活性在48h明顯高于空白組（P<0.001）；頭針加體針治療組在0、24、48 h差異均具有可比性；體針組在0 h，48 h有顯著性差異（P<0.01）；頭針組在24 h有顯著性差異（P<0.05）

2.3針刺不同時(shí)刻對(duì)大鼠LDH活性的影響由表3、圖3可以看出，模型組CK活性在0h、12h、48h均明顯高于空白組（P<0.001）；頭針加體針治療組在0h（P<0.01）、24h（P<0.05）均具有可比性，體針組在48h有顯著性差異（P<0.01），頭針組在0h有顯著性差異（P<0.01）

3討論

腦梗死后患者多伴有骨骼肌萎縮失用，許多研究表明骨骼肌出現(xiàn)病理性變化是腦梗死后肢體殘疾的重要原因[13]，而能量代謝與骨骼肌功能的正發(fā)揮有著密切的關(guān)系。大量研究證實(shí)，針灸對(duì)腦梗死后的骨骼肌萎縮產(chǎn)生良性調(diào)節(jié)作用。

ATP酶是影響肌肉收縮張力和收縮速率的重要因素，是判斷肌肉收縮能力的重要生化指標(biāo)[14～17]。乳酸脫氫酶（LDH）是糖原無氧酵解的關(guān)鍵酶之一，能保證肌肉在短暫缺氧時(shí)仍能獲得ATP，評(píng)價(jià)骨骼肌受損情況。肌酸激酶CK在骨骼肌中含量最多，當(dāng)肌細(xì)胞膜受損時(shí)，血液中CK含量明顯升高，因此，通過針刺干預(yù)肌肉內(nèi)能量的轉(zhuǎn)化可判斷損傷骨骼肌的恢復(fù)狀態(tài)[18～19]。本試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為①造模成功后，機(jī)體處于缺氧狀態(tài)，骨骼肌線粒體氧化磷酸化功能受損，ATP酶生成減少，活性顯著降低。當(dāng)針刺介入后ATP酶含量出現(xiàn)增高趨勢(shì)，其中頭針+體針組在針刺即刻療效最為顯著，48h后ATP酶含量已與正常水平無差異。體針組ATP酶含量呈先增高后降低的態(tài)勢(shì)，于24h異常增高，超出正常水平。②大鼠腦梗死后0h即出現(xiàn)血清LDH活性的增高。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是腦梗死后缺氧狀態(tài)下骨骼肌細(xì)胞內(nèi)離子代謝紊亂，大量自由基生成造成細(xì)胞膜通透性改變，此時(shí)LDH通過細(xì)胞膜進(jìn)入血液中，造成血液中LDH含量的異常增高。還可能是因?yàn)槟X梗死缺氧狀態(tài)下骨骼肌中ATP酶活性顯著降低，吸收和代謝過程受阻，有氧化受阻，無氧酵解活躍，與進(jìn)行無氧酵解相關(guān)的LDH的活性相應(yīng)地升高，使其在肌肉的能量代謝過程中發(fā)揮重要作用，這是機(jī)體的一種代償性反應(yīng)。③血清CK在腦梗死24h之后出現(xiàn)大幅度增高，可能在48h達(dá)到峰值。其變化與LDH類似但并不一致，均可能與細(xì)胞膜的損害有關(guān)。針刺介入后，頭針+體針組于即刻短暫升高后逐漸降低，但48h后仍沒有達(dá)到正常水平，CK活性的變化與LDH兩者之間的關(guān)系仍需要進(jìn)一步試驗(yàn)支持。研究結(jié)果表明頭針和體針穴位均對(duì)肌細(xì)胞膜有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是，頭針和體針穴位可以清除機(jī)體內(nèi)的過剩自由基，提高有氧酵解，維從而持細(xì)胞膜Na+、K+的穩(wěn)定轉(zhuǎn)運(yùn)，減少對(duì)肌細(xì)胞膜的傷害，保持細(xì)胞膜的良好通透性，從而減少血液中LDH、CK流出，從而改善骨骼肌微血管機(jī)能狀態(tài)，保護(hù)骨骼肌，最終達(dá)到了恢復(fù)腦梗死后骨骼肌運(yùn)動(dòng)能力的目的。

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，大鼠腦梗死骨骼肌損傷后，頭針+體針組在改善ATP酶及血清CK及LDH活性方面療效較為穩(wěn)定，可以提高骨骼肌有氧酵解，增加肌細(xì)胞膜通透性，減輕骨骼肌損傷，在臨床實(shí)驗(yàn)中，針刺是否會(huì)對(duì)腦梗死后骨骼肌的能量代謝產(chǎn)生上述影響以及其中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Thorvaldsen P，Kuulasmaa K，Rajakanga SAM，etal.Stroke trends in the WHO MONICA project[J]，Stroke，1997，28：500-506.

[2]Gresham GE，Phillips TF，Wolf PA，et al.Epidemiologic profile of long term stroke disability.The Framingham study[J].Arch Phys Med Rehabilitation，1979，60（11）：487-491.

[3]Arasaki K，Igarashi 0，Ichikawa Y，et al.Reduction in the motor unit number estimate（MUNE）after cerebral infarction[J].Neurol Sci.2006：250：27-32.

[4]Hafer-Macko CE，Ryan AS，Ivey FM，et al.Skeletal muscle changes after hemiparetic stroke and potential beneficial ef-fects of exercise interve-ntion strategies[J].J Rehabil Res Dev，2008，45（2）：261-272.

[5]高文祥，柳君澤，吳利平，等.急、慢性缺氧對(duì)大鼠腦線粒體能量代謝的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2000，10：16-19.

[6]張敏，陳立軍，史娜，等.骨骼肌肌漿網(wǎng)Na～+，K～+-ATP酶和Ca～（2+）-ATP酶活性在不同訓(xùn)練條件下的變化[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，37：6963-6966.

[7]周杰芳，靳瑞.針刺對(duì)中風(fēng)患者微循環(huán)與血液流變學(xué)作用的觀察[J].廣州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，8：（23）.

[8]王潤(rùn)芳.針刺治療急性腦梗死的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究[D].山西中醫(yī)學(xué)院，2013.

[9]凌麗，方邦江.中醫(yī)藥治療促進(jìn)腦梗死后血管新生作用的研究進(jìn)展[J].世界中藥，2015，03：452-456.

[10]楊華元、謝佳吟，顧順杰，等.穴位電刺激對(duì)大鼠骨骼肌能量代謝的影響[J].中國(guó)針灸，2001，21（4）：239-240.

[11]馬海峰，吳瑛.穴位電刺激對(duì)大鼠骨骼肌胞漿鈣離子濃度的影響[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2005，24（1）：100-102.

[12]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke.1989；20（1）：84-91.

[13]Scherbakov N，Doehner W.Sarcopenia in stroke-facts and numbers on muscle lossaccounting for disability after stroke[J].J Cachexia Sarcopenia Muscle，2011，2：5-6.

[14]ACKERMAN S H，TZAGOLOFF A.Function，structure，and biogenesis of mitochondrial ATP synthase[J].ProgNucleic Acid Res Mol Biol，2005，80：95-133.

[15]周錦琳，田野.急性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌線粒體Ca2+-ATP 酶和 H+-ATP 酶活性的影響[J].北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（3）：320-323.

[16]詹承烈，龍?jiān)品?，黃宇霞.太極拳運(yùn)動(dòng)對(duì)中老年人紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性的影響[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2002，18（1）：30-32.

[17]季麗萍，馮照軍.間歇性訓(xùn)練和持續(xù)性訓(xùn)練對(duì)大鼠胖腸肌 ATP 酶活性的影響[J].體育與科學(xué)，2004，25（1）：64-65.

[18]康純潔，王天芳.消疲怡神口服液對(duì)慢性束縛致大鼠疲勞骨骼肌能量代謝的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22（4）：21-23.

[19]Landin S，Hagenfeldt L，Saltin B，et al.Muscle metabolism during exercise in hemiparetic patients[J].Clin Sci Mol Med，1977，53（3）：257-269.