淺談基因編輯技術(shù)與豬遺傳改良

李嘉楠，顧 浩，徐在言，左 波

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430070）

前言

從本質(zhì)上講，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是人為的在生物體原DNA 中引入一段外源DNA 序列，從而達(dá)到改變生物自身性狀并穩(wěn)定遺傳的技術(shù)。而基因編輯技術(shù)則是對(duì)物種本身的基因進(jìn)行各種 “粘貼復(fù)制” 或者 “剪切替換” 等修飾，從而抑制機(jī)體內(nèi) “不好” 基因的表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體內(nèi) “好” 基因的表達(dá)，且不具有引入未知成分的風(fēng)險(xiǎn)，相較于轉(zhuǎn)基因技術(shù)其安全性更高、可控性更強(qiáng)。目前，新興的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在分子生物學(xué)中呈現(xiàn)出了巨大的潛力，將現(xiàn)代生物學(xué)研究推向了一個(gè)新的水平，幾乎所有的生物實(shí)驗(yàn)室均可掌握這項(xiàng)技術(shù)并對(duì)任何物種進(jìn)行研究，基因改變未來(lái)的時(shí)代已經(jīng)到來(lái)。

1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)

CRISPR/Cas 系 統(tǒng) 最 早 是1987 年日本學(xué)者在大腸埃希菌（Escherichia coli） 中 發(fā) 現(xiàn) 的， 并將其命名為規(guī)律性成簇間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）， 隨后又有大量學(xué)者證明多種細(xì)菌和古細(xì)菌中也存在這種系統(tǒng)，并預(yù)測(cè)該系統(tǒng)可能與DNA 修復(fù)和基因調(diào)控相關(guān)[1-3]。2007 年，研究人員首次使用細(xì)菌中CRISPR 系統(tǒng)對(duì)噬菌體進(jìn)行適應(yīng)性免疫，并證明了CRISPR 基因座附近存在的一系列相 關(guān) 蛋 白（CRISPR associated 蛋白；Cas 蛋白） 能對(duì)外源DNA 進(jìn)行切割[4]。CRISPR 基因是由一段長(zhǎng)度約為300 ～500 bp 富含AT 堿基序列的前導(dǎo)序列和一段具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的重復(fù)序列以及多個(gè)捕獲外源基因的間隔序列組成；前導(dǎo)序列的上游為一系列多態(tài)型Cas 基因，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Cas1 ～Cas10 等多種類(lèi)型的Cas 基因，與CRISPR 組合形成CRISPR/Cas 系統(tǒng)。根據(jù)不同Cas 基因編碼的蛋白功能不同，將CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為三個(gè)類(lèi)型，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)都是由多種Cas 蛋白共同發(fā)揮作用， 參 與CRISPR RNA（crRNA）加工并促進(jìn)其與DNA 雙鏈結(jié)合，形成R 環(huán)結(jié)構(gòu)， 最終與反式激活CRISPR RNA（tracrRNA） 識(shí)別R 環(huán)結(jié)構(gòu)切斷DNA 雙鏈；Ⅱ型CRISPR/Cas 系 統(tǒng) 僅 需 一 種Cas 蛋白，就可以在RNA 的介導(dǎo)下造成DNA 雙鏈斷裂，因此其成為了目前應(yīng)用最廣泛的基因編輯系統(tǒng)，其中包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12（cpf1）、CRISPR/Cas13 系統(tǒng)等[5]。

2 新型基因編輯技術(shù)概述

2.1 CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)

Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)中CRISPR/Cas9 蛋白的基因編輯是由RNA 介導(dǎo)，主要結(jié)構(gòu)包括Cas9 蛋白、crRNA和tracrRNA 組 成，tracrRNA 負(fù) 責(zé)激活RNase Ⅲ從而促進(jìn)crRNA 成熟，成熟的crRNA 通過(guò)堿基配對(duì)與靶序列結(jié)合，引導(dǎo)Cas9 蛋白的兩個(gè)活性位點(diǎn)RuvC 和HNH 分別對(duì)靶序列的兩條鏈進(jìn)行的切割，造成DNA雙鏈斷裂，從而使細(xì)胞發(fā)生非同源末端修復(fù)機(jī)制（NHEJ）和同源末端修復(fù)機(jī)制（HDR），實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除和插入[6]。2012 年，Jinek 等將crRNA 和tracrRNA 的核心區(qū)連接在一起形成一個(gè)20 bp 長(zhǎng)度左右的sgRNA（single guide RNA）去引導(dǎo)Cas9 蛋白，僅僅只需一個(gè)蛋白質(zhì)和一個(gè)RNA 分子就可以實(shí)現(xiàn)基因編輯，這一改造大大簡(jiǎn)化了CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在基因組中的應(yīng)用[7,8]。但其自身存在的嚴(yán)重脫靶問(wèn)題也被人們所詬病，因此，其同源蛋白也成為了研究熱點(diǎn)之一，其中CRISPR/Cas12a（cpf1）與CRISPR/Cas9 一樣都是由RNA 介導(dǎo)的基因編輯，但與CRISPR/Cas9 相比具有以下幾點(diǎn)不同：首先，該系統(tǒng)只由Cas12a（cpf1）和crRNA 組成，不需要tracrRNA 的參與，因?yàn)镃as12a（cpf1）蛋白自身就可以促進(jìn)crRNA成熟， 進(jìn)而識(shí)別靶序列。 其次，Cas12（cpf1）的PAM 識(shí)別區(qū)為5’-TTTN-3’，而Cas9 的PAM 識(shí)別區(qū)為5’-NGG-3’，兩者的結(jié)合能夠有效提高基因編輯在基因組中的識(shí)別范圍。 最后，Cas12a（cpf1） 蛋白與Cas9 蛋白同樣具有切割活性的RuvC 和特殊的HNH 結(jié)構(gòu)域，不同的是Cas12a（cpf1）蛋白切割后會(huì)產(chǎn)生一個(gè)4 ～5bp 的黏性末端，有利于細(xì)胞發(fā)生同源末端修復(fù)機(jī)制，提高編輯效率，而Cas9 蛋白切割產(chǎn)生的是平末端[9]。同時(shí)，也有研究表明CRISPR/Cas12b 與CRISPR/Cas12a（cpf1） 發(fā)揮同樣的作用，只是Cas12b 蛋白分子量更小，編碼序列更短，具有更高的編輯效率和較低的脫靶率[10]。CRISPR/Cas13基因編輯系統(tǒng)也是由RNA 介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)，與前幾種Cas 系統(tǒng)的不同之處在于，Cas13 蛋白具有兩個(gè)高度保守的HEPN endoRNase結(jié)構(gòu)域，具有RNA 酶活性，能在crRNA 介導(dǎo)下對(duì)單鏈RNA 進(jìn)行精確編輯[11]。

2.2 單堿基編輯技術(shù)

上述的CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)通常是通過(guò)堿基配對(duì)定位到目 標(biāo)DNA 序 列 上， 在sgRNA 指定的特定位點(diǎn)造成雙鏈斷裂。通過(guò)細(xì)胞對(duì)DNA 雙鏈斷裂的同源末端修復(fù)或非同源末端修復(fù)機(jī)制造成目的基因的插入和敲除，達(dá)到改變生物性狀的目的，然而對(duì)于很多基因操作而言，不需要雙鏈斷裂，僅僅改變單個(gè)堿基就可以實(shí)現(xiàn)生物性狀的改變，這一技術(shù)稱(chēng)為單堿基編輯技術(shù)。2016 年， 哈佛大學(xué)的研究學(xué)者將Cas9 蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，得到兩種突變體，分別為Cas9 切口酶突變體（Cas9 nickase，Cas9n）和核酸酶缺陷Cas9（dead Cas9, dCas9）， 其 中Cas9n 具有切割DNA 單鏈的能力，將Cas9n 與鼠源的胞嘧啶脫氨酶融合在一起構(gòu)成了第一代胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor, CBE），實(shí) 現(xiàn) 從C 到T 或G 到A 的 轉(zhuǎn) 換，造成錯(cuò)義突變或者提前終止翻譯，達(dá)到目的基因的敲除[12]。隨后2018年該研究團(tuán)隊(duì)在CBE 的基礎(chǔ)下，對(duì)大腸桿菌的腺苷脫氨酶進(jìn)行改造獲得了第一代腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor, ABE），實(shí)現(xiàn)了單堿基從A 到G 或從T 到C 的轉(zhuǎn)換。與CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相比，ABE 和CBE 單堿基編輯系統(tǒng)能夠在不切斷DNA 雙鏈的情況下實(shí)現(xiàn)四種堿基對(duì)之間的完美轉(zhuǎn)換[13]。目前，ABE 和CBE 單堿基編輯系統(tǒng)在擬南芥、小麥、水稻、大豆、玉米等植物的性狀改良和抗病性應(yīng)用較為廣泛，但是在動(dòng)物方面研究較少，尤其是應(yīng)用于豬、牛、羊等大動(dòng)物。2019 年，中國(guó)科學(xué)家通過(guò)胚胎注射和體細(xì)胞核移植首次在豬的細(xì)胞、胚胎和個(gè)體水平上對(duì)豬的多基因位點(diǎn)進(jìn)行單堿基編輯，培育出了單基因突變的早衰豬模型和杜氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良豬，同時(shí)也獲得了與免疫機(jī)能相關(guān)的多基因突變的免疫缺陷豬模型[14]。隨著對(duì)單堿基編輯技術(shù)的深入研究、系統(tǒng)的優(yōu)化和完善，未來(lái)基因編輯定會(huì)進(jìn)入一個(gè)精確編輯的時(shí)代。

2.3 基于CRISPR/Cas9 技術(shù)衍生的基因表達(dá)調(diào)控

在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)廣泛應(yīng)用之前，鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFNs）和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶（TALENs） 的應(yīng)用在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是由于它們DNA 結(jié)構(gòu)域?qū)A基識(shí)別的規(guī)律復(fù)雜性，在調(diào)控多個(gè)內(nèi)源基因時(shí)出現(xiàn)了很大的阻礙[15-17]。但在CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)中，Cas9 蛋白是由sgRNA 引導(dǎo)通過(guò)與靶位點(diǎn)進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)和DNA結(jié)合并發(fā)揮剪切作用，可以設(shè)計(jì)不同的sgRNA 同時(shí)引導(dǎo)Cas9 蛋白定位到多個(gè)基因組位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)調(diào)控。也有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白的另一種突變體dCas9 具有只結(jié)合DNA 而不發(fā)揮剪切作用的能力[18]， 可 以 將dCas9 與 轉(zhuǎn) 錄 抑 制域或轉(zhuǎn)錄激活域進(jìn)行融合，形成CRISPR interference（CRISPR i）和CRISPR activator（CRISPR a） 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的抑制或激活[19]。dCas9 在調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾上也發(fā)揮了一定的作用，有研究學(xué)者將dCas9 與人乙?；D(zhuǎn)移酶 p300 的催化核心融合，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)基因修飾后的增強(qiáng)子，其靶向到啟動(dòng)子上時(shí)對(duì)乙?；哂袕?qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄激活作用[20]。

3 基因編輯技術(shù)在豬遺傳改良中的應(yīng)用

自CRISPR/Cas9 技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，基因組編輯已經(jīng)迅速席卷整個(gè)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括畜牧業(yè)，尤其在豬基因組編輯中的研究已成為了一個(gè)勢(shì)不可擋的趨勢(shì)，它不僅克服了大動(dòng)物傳統(tǒng)育種中育種周期長(zhǎng)、遺傳效力低等問(wèn)題，而且在抗病性、肉質(zhì)改善、動(dòng)物福利及動(dòng)物疾病模型等研究上都有重要突破，基因編輯技術(shù)在豬基因組編輯中應(yīng)用的部分實(shí)例見(jiàn)表1。

4 基因編輯技術(shù)的局限性及優(yōu)化策略

近 幾 年，CRISPR/Cas9 基 因編輯技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著巨大潛力，尤其是在功能基因研究和動(dòng)物疾病模型上。但是該技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中還存在脫靶效應(yīng)、編輯效率低等一系列風(fēng)險(xiǎn)，給精確基因編輯造成一定的阻礙?；诖?，科學(xué)家們?cè)诮档兔摪行?yīng)和提高基因編輯特異性等方面進(jìn)行了很多研究：1）sgRNA 的選擇及優(yōu)化：減少脫靶和提高sgRNA 特異性的首要任務(wù)是正確選擇活性高的sgRNA，目前有許多關(guān)于sgRNA 設(shè)計(jì)的軟件程序，研究人員可以根據(jù)2 ～3 個(gè)不同軟件綜合比較挑選出得分較高的sgRNA，有助于最大化的降低脫靶效應(yīng)。更有研究者通過(guò)截短sgRNA的3’端或在sgRNA 的5’端加入兩個(gè)堿基，證明了截短和修飾后的sgRNA 特異性更高，且不影響靶基因組的編輯效率[34]。2）cas9 蛋白的結(jié)構(gòu)改造：有研究證明SpCas9-HF1[35]、eSpCas9[36]及HypaCas9[37]等Cas9 核酸酶突變體，都具有較低的脫靶效應(yīng)，同時(shí)還和野生型Cas9具有相同的基因編輯能力。除此之外，Hu 等研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)獲得Cas9的突變體xCas9 來(lái)拓寬Cas9 蛋白識(shí)別更廣泛的PAM 序列（NGG、NG、GAA、GAT 等），增加在基因組中的靶向范圍[38]。2014 年，Ran等研究團(tuán)隊(duì)發(fā)明了一種雙切口編輯技術(shù)，通過(guò)將兩個(gè)成對(duì)的sgRNA與Cas9n 結(jié)合起來(lái)，分別切割DNA的兩條鏈，提高了sgRNA 對(duì)靶向基因組序列識(shí)別的特異性，證明了在基因組編輯效率不變的情況下，sgRNA 的脫靶效率顯著降低[39]。3）基因組位點(diǎn)、宿主細(xì)胞類(lèi)型、培養(yǎng)條件、Cas9 及sgRNA 復(fù)合物濃度和Cas9 蛋白持續(xù)表達(dá)的時(shí)間等多種因素都會(huì)影響編輯的精確性[40-42]。宿主細(xì)胞中持續(xù)高水平的表達(dá)Cas9蛋白能夠提高靶基因編輯效率，但sgRNA 的錯(cuò)配耐受數(shù)也在增加，脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更高。為了減少這種影響，2017 年，Rauch 等人通過(guò)添加Cas9 核酸酶抑制劑Acr ⅡA4調(diào)節(jié)Cas9 核酸酶在細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間[43]。

表1 基因編輯技術(shù)在豬基因組編輯中應(yīng)用的部分實(shí)例

5 小結(jié)與展望

近年來(lái)，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)除了在小鼠、果蠅、斑馬魚(yú)等常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中應(yīng)用之外，還在豬、牛、羊等大型動(dòng)物以及靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物—食蟹猴等都有廣泛應(yīng)用，展現(xiàn)出基因編輯技術(shù)未來(lái)發(fā)展的無(wú)限可能，但編輯效率、脫靶效應(yīng)和打靶特異性等許多問(wèn)題亟待解決，尤其是需要克服脫靶效應(yīng)，“零脫靶” 是未來(lái)基因編輯走向臨床應(yīng)用上的重中之重。目前，CRISPR/Cas 系統(tǒng)所衍生出來(lái)的新技術(shù)正在逐步優(yōu)化和改進(jìn)，但開(kāi)發(fā)更精準(zhǔn)高效的基因編輯新技術(shù)仍是未來(lái)需要攻破的難題和努力的方向，這對(duì)于研究人員來(lái)說(shuō)既是一種新的挑戰(zhàn)，同時(shí)也是基因編輯技術(shù)發(fā)展的機(jī)遇和重要突破。