銀杏黃酮對缺氧復(fù)氧心肌H9c2細胞損傷的保護作用及其機制

高 陽，康 凱，王 慧

(哈爾濱醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 重癥監(jiān)護室，黑龍江 哈爾濱 150001)

心肌缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，涉及心肌細胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)多個環(huán)節(jié)[1]。心肌缺血時誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物及炎性因子釋放增加，破壞心肌細胞正常生理功能，加重心臟組織損傷[2]。銀杏黃酮(ginkgo biloba)系中藥銀杏葉的活性成分，具有抗炎、抗氧化、擴張血管、抑制血小板聚集等藥理作用，此外，銀杏黃酮對缺血再灌注心肌具有保護作用[3-5]。本實驗以H9c2細胞為研究對象，采用缺氧/復(fù)氧處理模擬在體心肌缺血再灌注損傷，研究銀杏黃酮對H9c2細胞的保護作用及機制，為其臨床應(yīng)用提供科學的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 銀杏黃酮(批號：8310469，購自深圳市思美泉生物科技有限公司)；H9c2細胞(中科院上海細胞庫)；DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)；CCK8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialedhyde，MDA)活性檢測試劑盒(南京建成生物試劑公司)；Hoechst 染色試劑盒(上海碧云天公司)；FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；Bcl-2及Bax抗體(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 缺氧復(fù)氧模型的建立及細胞分組 共分4組，每組5個復(fù)孔。①對照組：H9c2細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d換液1次。②實驗組(缺氧復(fù)氧心肌細胞模型)：H9c2細胞置37 ℃培養(yǎng)罐中，緩慢持續(xù)通入含有5% CO2+95%N2的混合氣體，至罐內(nèi)氧氣含量低于1%，造成H9c2細胞的缺氧，密封培養(yǎng)罐4 h后，把原來的培養(yǎng)液吸除，重新更換培養(yǎng)液，立即將H9c2細胞移至37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，使細胞復(fù)氧。③銀杏黃酮低、高濃度組進行缺氧/復(fù)氧操作前0.5 h，在培養(yǎng)基中加入溶于DMSO的銀杏黃酮(1、10 μg/ml)，其余步驟及同實驗組。

1.2.2 CCK 8法測定H9c2細胞增殖 H9c2細胞培養(yǎng)于96孔板內(nèi)，每孔200 μL，細胞密度為1×105/mL，棄去原有培養(yǎng)液，將已配置含10%CCK8的培養(yǎng)基以換液的形式加入，接種后的96孔板37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，觀察細胞已貼壁。用480 nm吸光度進行檢測。

1.2.3 各組細胞上清液 LDH 及細胞內(nèi)SOD、MDA 檢測 收集H9c2細胞上清液，嚴格按照 LDH試劑盒說明書檢測各組細胞上清液LDH活性；另取各組細胞，裂解后按照 SOD、MDA試劑盒的方法進行各樣本吸光度值檢測。

1.2.4 細胞凋亡的形態(tài)學觀察 我們采用Hoechst染色法定量觀察細胞凋亡情況，細胞接種于6孔板中，調(diào)整細胞密度至3×105/mL，按照試劑盒說明，更換細胞培養(yǎng)液并用PBS沖洗3遍，在150 μL 的Binding Buffer中分別加入Hoechst(5 μL)，室溫避光反應(yīng)5 min，熒光顯微鏡下觀查并拍照并統(tǒng)計分析凋亡細胞比例。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察H9c2細胞超微結(jié)構(gòu) H9c2細胞固定于2.5%戊二醛溶液中，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗2次后四氧化鋨(1%)后固定，梯度脫水包埋，做超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色5 min，透射電子顯微鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)改變。

1.2.6 Western Blot檢測Bcl-2及Bax的蛋白表達水平 收集細胞冰上加入400 μL含有蛋白酶抑制劑的裂解液研磨30 min以提取蛋白，10 000 rpm離心10 min后取上清，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%的脫脂奶粉4℃封閉2 h，加一抗(稀釋濃度1∶1 000)過夜，室溫下孵育二抗(稀釋濃度1∶2 000 )1 h，ECL化學發(fā)光法自顯影并采集圖像。利用樣本目的蛋白的光密度比內(nèi)參條帶的光密度，比較不同樣本的相對表達率。

2 結(jié)果

2.1 銀杏黃酮濃度依賴性的提高H9c2細胞存活率 實驗組H9c2細胞存活率為(31.37±3.51)%，與對照組(98.66±4.50)%比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低、高濃度銀杏黃酮處理后，H9c2細胞存活率逐漸提高，分別為(54.80±4.27)%和(68.04±6.85)%，與實驗組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 銀杏黃酮對缺氧/復(fù)氧H9c2細胞LDH、SOD活性和MDA水平的影響 如表1所示，與對照組相比，實驗組細胞外培養(yǎng)基中LDH的釋放顯著增加(P<0.05)。與實驗組相比，銀杏黃酮能夠顯著降低缺氧/復(fù)氧H9c2細胞外上清液中LDH水平(P<0.05)，說明銀杏黃酮能緩解細胞損傷。與對照組比較，實驗組H9c2細胞內(nèi)SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；與實驗組比較，銀杏黃酮組能顯著升高SOD活力，降低MDA水平(P<0.05)，且呈劑量依賴性。

表1銀杏黃酮對缺氧/復(fù)氧H9c2細胞LDH、SOD和MDA的影響

組別LDH(U/L)SOD(U/g)MDA(nmol/mg)對照3.16±1.22167.09±4.431.43±1.85實驗26.08±1.35?108.28±5.13?8.24±2.37?銀杏黃酮低濃度17.74±1.53#127.53±4.17#5.75±2.64#銀杏黃酮高濃度8.59±1.55#143.11±3.63#3.79±2.00#

*：與對照組比較，P<0.05；#：與實驗組比較，P<0.05。

2.3 銀杏黃酮對H9c2細胞凋亡的影響 熒光顯微鏡下，對照組未見明顯凋亡細胞，細胞核均為暗藍色低熒光；實驗組細胞核著色不均勻，凋亡細胞呈亮藍色高熒光；銀杏黃酮處理后凋亡細胞數(shù)量逐漸減少(見圖1)；各組細胞的調(diào)亡情況見表2。

A：對照組；B：實驗組；C：銀杏黃酮低濃度組；D：銀杏黃酮高濃度組。圖1 Hoechst染色觀察H9c2細胞凋亡

表2各組細胞凋亡率

組別細胞凋亡率(%)對照4.57±2.34實驗69.09±5.31 ?銀杏黃酮低濃度45.88±5.53 #銀杏黃酮高濃度23.63±4.27 #

*：與對照組比較，P<0.05； #：與實驗組比較，P<0.05。

2.4 各組細胞超微結(jié)構(gòu)改變 對照組H9c2細胞核形態(tài)正常，核膜連續(xù)，細胞核染色質(zhì)分布均勻；實驗組H9c2細胞腫脹，可觀察到空泡樣結(jié)構(gòu)(自噬溶酶體水解其內(nèi)容物后的產(chǎn)物)線粒體腫脹；低、高濃度銀杏黃酮處理后，H9c2細胞形態(tài)逐漸改善，線粒體、溶酶體等細胞器逐漸恢復(fù)正常形態(tài)(見圖2)。

A：對照組；B：實驗組；C：銀杏黃酮低濃度組；D:銀杏黃酮高濃度組；放大倍數(shù)×10000。圖2 電鏡觀察H9c2細胞改變

2.5 銀杏黃酮干預(yù)促進Bcl-2蛋白表達并降低Bax蛋白表達 Bcl-2蛋白在實驗組中的表達明顯降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低、高濃度銀杏黃酮組Bcl-2蛋白表達逐漸升高，與實驗組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Bax蛋白在實驗組中的表達明顯升高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；銀杏黃酮干預(yù)可降低Bax蛋白的表達，低、高劑量銀杏黃酮組Bax蛋白的相對表達量與實驗病組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3，表3)。

A：對照組；B：實驗組；C：銀杏黃酮低濃度組；D:銀杏黃酮高濃度組。圖3 銀杏黃酮對H9c2細胞內(nèi)Bcl-2及Bax表達的影響

組別Bcl-2Bax對照1.63±0.540.21±0.06實驗0.56±0.35 ?0.89±0.11 ?銀杏黃酮低濃度0.80±0.16 # 0.52±0.10 # 銀杏黃酮高濃度1.22±0.18 #0.30±0.12 #

*：與對照組比較，P<0.05； #：與實驗組比較，P<0.05。

3 討論

多種心血管疾病的損傷機制與心肌細胞的缺氧復(fù)氧損傷密切相關(guān)[6]。心肌細胞復(fù)氧后在黃嘌呤氧化酶的作用下大量活性氧族(ROS) 堆積，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙，進一步促進ROS的生成[7-8]。本實驗?zāi)M心肌缺氧再灌注損傷，體外培養(yǎng)H9c2細胞并制備缺氧/復(fù)氧損傷模型，以期進一步探討該藥物對H9c2細胞的保護作用。我們的研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧破壞了H9c2細胞正常生理功能，細胞存活率明顯下降。

臨床上，銀杏黃酮已被用于輔助治療心肌缺血再灌注損傷[9]。研究顯示，銀杏黃酮通過擴張心肌血管改善微循環(huán)、恢復(fù)缺血病變區(qū)血流量，有利于心臟功能復(fù)原和改善；此外，銀杏黃酮還可減輕心臟血管損傷和炎癥反應(yīng)，從而減少缺血缺氧對心臟功能的損傷，對心肌缺血再灌注損傷疾病有較好療效[10]。

關(guān)于銀杏黃酮對H9c2細胞缺氧復(fù)氧損傷保護作用的研究不多，國內(nèi)學者徐露通過制備大鼠心臟缺血再灌損傷模型，在體觀察銀杏黃酮對大鼠心肌保護作用，證實銀杏黃酮可改善大鼠心律失常，對抗大鼠心臟缺血再灌損傷并降低Cx43異常表達[11]。

心肌細胞氧化功能破壞產(chǎn)生大量ROS。銀杏黃酮預(yù)處理能顯著降低缺氧復(fù)氧H9c2細胞外上清液中LDH漏出率，增加缺氧復(fù)氧H9c2細胞內(nèi)SOD的表達，降低細胞內(nèi)MDA含量，說明銀杏黃酮能夠有效緩解細胞損傷。

Hoechst 染色劑能透過細胞胞膜并嵌入細胞核DNA，使其發(fā)出明亮的藍色熒光。凋亡的細胞核濃染，熒光增強，呈致密顆粒和(或)塊狀高熒光。本實驗中，實驗組中亮藍色熒光顯著增加，證實缺氧復(fù)氧可誘導(dǎo)H9c2細胞凋亡，銀杏黃酮低劑量組及銀杏黃酮高劑量組中凋亡細胞比例逐漸下降。

心肌缺血再灌注導(dǎo)致的細胞損傷通過細胞凋亡方式最終導(dǎo)致心肌細胞死亡。Bcl-2在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡反應(yīng)中起重要作用，具有潛在的抗凋亡作用[12]。Bax表達水平的高低直接反應(yīng)細胞凋亡程度，Western blot結(jié)果顯示，實驗組細胞中Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax蛋白表達明顯增加，提示缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)了心肌細胞凋亡，銀杏黃酮通過改變Bcl-2、Bax蛋白的表達發(fā)揮抗細胞凋亡作用，增強損傷心肌組織對缺血、缺氧的耐受。

綜上所述，銀杏黃酮能夠有效抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡，因此我們推測，銀杏黃酮在預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷疾病方面具有一定的應(yīng)用前景。