鯽魚腸道蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特征

陳豐 黃亞冬 孫敬鋒 呂愛軍 胡秀彩 石洪玥 邢克智

摘要：從健康鯽魚（Carassius auratus）腸道中分離純化出1株細(xì)菌，命名為CS4，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性、16S rDNA測序以及系統(tǒng)發(fā)育分析等方法鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），并對其致病性及藥物敏感性等生物學(xué)特征進(jìn)行研究。結(jié)果表明，菌株CS4具有β溶血性（完全溶血），對健康鯽魚感染9 d的半數(shù)致死量為4.6×106 CFU/g。該菌株對復(fù)方新諾明、利福平、呋喃唑酮、頭孢孟多、阿莫西林等16種抗生素耐藥;對紅霉素、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那、林可霉素等17種抗生素敏感。筆者從健康鯽魚腸道中分離到致病性較強(qiáng)的蠟樣芽孢桿菌，表明該菌是一種重要的條件性致病菌，研究結(jié)果對防治由蠟樣芽孢桿菌引起的魚類疾病具有實際意義。

關(guān)鍵詞：鯽魚;蠟樣芽孢桿菌;分離鑒定;致病性;藥敏試驗

中圖分類號： S941.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）18-0191-04

收稿日期：2018-06-04

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31272692）;天津市北辰區(qū)科技創(chuàng)新專項（編號：KJCX-XDZ-KTP-2016-005）;天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：201610061044）。

作者簡介：陳?豐（1993—），男，福建霞浦人，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)動物疾病學(xué)。E-mail：chenfeng08091204@163.com。

通信作者：孫敬鋒，博士，教授，研究方向為水產(chǎn)動物病害及免疫學(xué)。E-mail：sun_jf@163.com。

動物腸道菌群是一個復(fù)雜且龐大的微生態(tài)系統(tǒng)[1]，不同動物腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)多種多樣，并且不同類群的微生物數(shù)量和分布各不相同[2]。在魚體中，腸道菌群既參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與消化，又具有免疫防御、維持機(jī)體健康等功能，對魚類生長發(fā)育起到重要作用[3]。魚類生活的環(huán)境和魚類消化道中存在著大量的微生物，在魚類生長發(fā)育過程中，魚類消化道逐漸形成了一個由好氧菌、兼性厭氧菌和厭氧菌組成的動態(tài)正常菌群。但當(dāng)出現(xiàn)機(jī)體抵抗力下降、餌料或養(yǎng)殖環(huán)境惡化等應(yīng)激狀態(tài)時，腸道微生物區(qū)系平衡被破壞，病原菌或條件致病菌就會異常增殖，導(dǎo)致魚類產(chǎn)生各種疾病[4]。

芽孢桿菌（Bacillus）是魚類腸道正常菌群的重要組成部分，其中一些種類，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）作為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中被廣泛應(yīng)用[5-6]。近年來，蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）作為益生菌的應(yīng)用也逐漸增多[7-9]。然而，不少研究者從患病魚病灶或?qū)嵸|(zhì)內(nèi)臟器官中分離到蠟樣芽孢桿菌，并證明其具有致病性，如陳紅蓮等從斑點(diǎn)叉尾的肝、脾、腎中分離別蠟樣茅孢桿菌[10];賀勝英等從大鯢的鰓、肝、腎中分離到蠟樣芽孢桿菌，并證明是引起發(fā)病的病原菌[11]。目前，也有研究者從魚類腸道中分離到非致病性蠟樣芽孢桿菌菌株，并可作為益生菌應(yīng)用[12]，但未見從魚類腸道中分離到致病性蠟樣芽孢桿菌的報道。本研究從鯽魚腸道中分離出1株致病性蠟樣芽孢桿菌，并對其進(jìn)行分類鑒定及生物學(xué)特征研究。這對蠟樣芽孢桿菌引起的魚類疾病的防治及其作為益生菌時的安全性評估具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

健康鯽魚，體長15 cm，體質(zhì)量450 g，從天津市某大型水產(chǎn)批發(fā)市場購得。用醫(yī)用乙醇棉球擦拭魚體表之后，用無菌解剖器具對魚體進(jìn)行解剖，取魚中后腸，用無菌生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，剪開腸道，刮取腸內(nèi)膜于組織勻漿器中，加入1 mL 無菌生理鹽水進(jìn)行組織勻漿，然后把勻漿液按10-1～10-4稀釋。取100 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，重復(fù)劃線接種培養(yǎng)2～3次，得到純的菌株，使用革蘭氏染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）染色，鏡檢，選取1株具有芽孢的革蘭氏陽性桿菌進(jìn)一步純化保存，命名為CS4。

1.2?生理生化特征

參考文獻(xiàn)[13-14]，對分離菌株進(jìn)行生理生化特征測定，包括明膠液化、尿素、硝酸鹽還原、硫化氫、淀粉水解、甘露醇、果糖、乳糖、木糖、葡萄糖、麥芽糖、伏-普（V-P）試驗等。

1.3?16S rDNA基因序列分析

參考Queipo-Ortuo等的方法[15]提取DNA模板，以細(xì)菌通用引物進(jìn)行16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增。通用引物如下：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1 492R，5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）包括Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，超純水11 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次;72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。測得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）同源性比對分析。利用軟件MEGA 5.0中的鄰接（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4?致病性檢測

1.4.1?溶血性試驗

參考楊志平等的方法[16]對菌株CS4進(jìn)行溶血性試驗。

1.4.2?攻毒試驗