白樺8個(gè)MYB基因的克隆及其序列分析

王蓮萍 王博 楊春雨 國會(huì)艷 任如意

摘要：根據(jù)白樺MYB基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，以白樺的cDNA為模板，擴(kuò)增出8個(gè)MYB基因，純化回收后與T載體進(jìn)行連接并利用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，后經(jīng)PCR檢測成功將8個(gè)MYB基因構(gòu)建到T載體上。對(duì)8個(gè)MYB基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，8個(gè)MYB蛋白質(zhì)的分子量在27.2～38.8 ku之間，等電點(diǎn)在5.38～8.66之間;并且，8個(gè)MYB均為核蛋白質(zhì)，但都沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白質(zhì);系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果預(yù)測8個(gè)MYB基因在植物生長發(fā)育的各個(gè)方面發(fā)揮著重要的作用，為后續(xù)研究8個(gè)MYB基因在白樺中的功能以及通過優(yōu)良基因改良白樺的品質(zhì)性狀提供前期數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：白樺;MYB基因;序列分析

中圖分類號(hào)： S188文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）18-0093-05

收稿日期：2018-05-15

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳項(xiàng)目（編號(hào)：1352MSYYB002）;研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：kjcx2018-80mdjnu）。

作者簡介：王蓮萍（1994—），女，黑龍江省鶴崗人，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)與基因工程研究。E-mail：928718821@qq.com。

通信作者：任如意，博士，教授，主要從事植物分子生物學(xué)與基因工程研究。E-mail：swxrry@126.com。

轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是指能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白質(zhì)之間的相互作用激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄[1]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子保守域可分為很多家族，如bZIP、bHLH、MYB等。

MYB蛋白質(zhì)普遍存在與動(dòng)植物中，是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，它參與植物次生代謝調(diào)控、激素和環(huán)境的應(yīng)答、并對(duì)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、器官的形成以及植物葉片的形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用[2-3]。自Paz-ares等首次報(bào)道玉米轉(zhuǎn)錄因子C1基因的克隆[4]以來，從番茄[5]、月季[6]、水稻[7]等多種植物中都分離克隆了MYB基因，并體現(xiàn)出MYB蛋白質(zhì)功能的多樣性。植物體中大多數(shù)MYB蛋白質(zhì)有2個(gè)重復(fù)MYB結(jié)構(gòu)域（R2、R3），根據(jù)C端保守氨基酸序列的不同R2R3-MYB可分為22個(gè)亞類，同一亞類的基因往往具有相對(duì)保守的功能[8]，有學(xué)者推測在擬南芥中有130多個(gè)R2R3-MYB基因[9]，玉米中至少有80個(gè)MYB基因[10]。MYB家族轉(zhuǎn)錄因子有很多的成員被鑒定為是次生壁合成重要的調(diào)控因子[11]，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答生物脅迫中具有重要的作用，在植物的生長過程中，幾乎參與了植物的發(fā)育和代謝的各個(gè)方面。楊樹的PtrMYB092和PtrMYBJ52基因參與了植物中木質(zhì)素合成的調(diào)控，并能通過激活下游轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵酶基因的表達(dá)提高木質(zhì)素的合成速率，促進(jìn)植物細(xì)胞次生壁發(fā)生木質(zhì)化[12]。有學(xué)者從桉樹克隆到了參與調(diào)控樹木木質(zhì)部形成的關(guān)鍵基因，桉樹中的Eg MYB2基因可以調(diào)控木質(zhì)素合成基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響了桉樹木質(zhì)素和次生壁的形成[13]。Zhong等研究表明擬南芥的AtMYB58和AtMYB63過表達(dá)時(shí)，植物細(xì)胞壁的木質(zhì)素含量顯著增加，而其他細(xì)胞壁成分沒有變化[14]。擬南芥中HbMYB85a/b過表達(dá)都能使導(dǎo)管、木質(zhì)纖維和維管束間纖維的細(xì)胞壁厚度增加，木質(zhì)素含量升高，木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因表達(dá)升高，葉片量加厚，抽薹開花延遲[15]。McCarthy等在楊樹中克隆了MYB46、MYB83的同源基因Ptr MYB3、Ptr MYB20，最后通過功能分析證實(shí)了Ptr MYB3、Ptr MYB20參與了次生木質(zhì)部的合成[16]。小麥中的TaMYB33受ABA介導(dǎo)的逆境響應(yīng)信號(hào)調(diào)控，通過積累滲透壓調(diào)節(jié)物和提高細(xì)胞活性氧清除能力來提高植物對(duì)干旱和鹽的耐受性[17]。Yang等研究發(fā)現(xiàn)OsMYB2過表達(dá)植株中可溶性糖和脯氨酸含量上升，并發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞內(nèi)脯氨酸合成酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等逆境相關(guān)基因表達(dá)量上升，同時(shí)抗氧化酶的活性升高，對(duì)低溫、鹽害和干旱逆境脅迫的耐受性都明顯增強(qiáng)[18]。擬南芥中的MYB68基因在根中柱鞘細(xì)胞中特異型表達(dá)，在高溫脅迫下，根中MYB68表達(dá)會(huì)明顯增強(qiáng)，并且MYB68突變體的生長活力比野生型低，說明MYB68參與了擬南芥高溫脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[19]。水稻Osmyb4基因的過表達(dá)大大提高了轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱、高鹽、紫外輻射等的耐受能力[20]。從以往研究中不難發(fā)現(xiàn)，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中起著關(guān)鍵性作用，但其作用的詳細(xì)分子機(jī)理還沒有被完全闡述清楚，因此，有必要對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能和作用機(jī)制繼續(xù)進(jìn)行深入研究。

白樺（Betula platyphylla Suk.）為樺木屬的落葉喬木，其木材可供一般建筑及制作器具，樹皮可以提煉樺油，樹汁在保健藥用上有抗衰老止咳等功效，植株本身可用于園林景觀。隨著對(duì)白樺不斷深入的研究，它的經(jīng)濟(jì)市場價(jià)值也將不斷地被開發(fā)出來。本研究從白樺轉(zhuǎn)錄組中找到8個(gè)MYB基因，并以白樺cDNA為模板將其克隆出來，與T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。并對(duì)8個(gè)MYB基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)利用試驗(yàn)手段深入研究這8個(gè)MYB基因的功能提供前期依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗(yàn)材料

白樺組培苗，由牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供。

1.1.2?試驗(yàn)試劑

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×Power Taq PCR MasterMIX混合酶（百泰克生物技術(shù)公司）、DL2000 DNA marker。膠回收試劑盒、PMD18-T載體試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3?培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配方。1/2 MS固體培養(yǎng)基：1/2 MS粉（不含瓊脂粉和蔗糖）2.47 g，瓊脂粉8 g，蔗糖30 g，加蒸餾水定容至1 g，調(diào)節(jié)pH值為5.8。LB液體培養(yǎng)基：10 g蛋白胨、10 g NaCl、5 g酵母粉，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.0。

3?結(jié)論與討論

MYB作為最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，根據(jù)所含保守結(jié)構(gòu)域的不同分為1R、2R、3R、4R多個(gè)亞家族，不同的亞家族也具有著不同的結(jié)構(gòu)特征和功能。從白樺轉(zhuǎn)錄組中找到8個(gè)MYB基因，在從白樺的cDNA中克隆出這8個(gè)基因，與擬南芥MYB家族基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，暗示這8個(gè)白樺MYB基因在白樺生長發(fā)育的各個(gè)方面具有不同的功能，但這只是一種預(yù)測，后續(xù)還需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)來證實(shí)，本研究為進(jìn)一步利用試驗(yàn)手段分析MYB基因在白樺中的功能提供前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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