miR-146a及其靶mRNA與初發(fā)Graves病的相關(guān)性研究

許 靜， 李 姍， 蔡俊瑋， 黃成虎， 龔 麗， 李 敏， 李雪鋒

Graves病(Graves′ disease,GD)是一種自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)[1]。由于目前的治療方法均不能針對(duì)其病因進(jìn)行治療，故復(fù)發(fā)率高。因此，有必要進(jìn)一步探索GD的病因及發(fā)病機(jī)制。微小RNA-146a(micro-RNA-146a，miR-146a)與免疫反應(yīng)有關(guān)的靶mRNA包括白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1/2(interleukin-1 receptor-associated kinase 1/2，IRAK1/2)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF-6)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、CC趨化因子配體5/8[chemokine(C-C motif) ligand 5/8，CCL5/8]和Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)等[2-6]。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)初發(fā)GD患者與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miR-146a及其與免疫相關(guān)的靶mRNA的表達(dá)情況，旨在從轉(zhuǎn)錄后水平初步探討miR-146a及其靶mRNA與初發(fā)GD的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2017年9月-2018年8月就診的初發(fā)GD患者30例，男性9例，女性17例，年齡(34.30±11.87)歲(16～62歲)。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)有甲狀腺功能亢進(jìn)(甲亢)的高代謝癥狀和體征；(2)觸診和B超均證實(shí)甲狀腺?gòu)浡阅[大；(3)血清游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(free tetraiodothyronine，F(xiàn)T4)、總?cè)饧谞钕僭彼?total triiodothyronine，TT3)、總四碘甲狀腺原氨酸(total tetraiodothyronine，TT4)均升高，促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)降低；(4)突眼或促甲狀腺激素受體抗體(thyrotropin receptor antibody，TRAb)陽(yáng)性；(5)年齡14～70歲，性別不限；(6)未進(jìn)行任何抗甲亢治療；(7)近期無(wú)感染史；(8)無(wú)甲狀腺危象、甲亢心、淡漠型甲亢、T3型甲狀腺毒癥、妊娠期甲亢等特殊臨床表現(xiàn)及并發(fā)癥；(9)無(wú)其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病或慢性病史。

同期招募年齡、性別與GD組相匹配的來(lái)自體檢中心的健康志愿者26例作為對(duì)照組，男性9例，女性17例，年齡(38.40±15.31)歲(18～69歲)。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)血常規(guī)、肝腎功能、甲狀腺功能及促甲狀腺受體抗體均正常；(2)無(wú)自身免疫性疾病家族史和嚴(yán)重器質(zhì)性疾??；(3)近期無(wú)感染史；(4)未使用任何影響免疫功能的藥物。所有患者和志愿者標(biāo)本采集前均被告知，并簽署知情同意書。兩組的一般臨床資料見表1。

1.2方法

1.2.1主要試劑及儀器 (1)試劑：人外周血淋巴細(xì)胞分離液(LTS1077，中國(guó)天津?yàn)笕A科生物科技有限公司)；Trizol試劑(15596018，美國(guó)Invitrogen公司)；mRNA熒光定量PCR相關(guān)試劑(FSQ-301和QPS-201，日本TOBOYO公司)；miRNA熒光定量PCR相關(guān)試劑(KR211，F(xiàn)P411和E132-01A，中國(guó)TIANGEN公司)；實(shí)驗(yàn)所需mRNA引物采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，miRNA引物由上海生工總公司在線設(shè)計(jì)，所有引物均由上海生工武漢分公司合成(表2)。(2)儀器：超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD，中國(guó)AIRTECH公司)，PCR儀(C1000 TouchTM)及凝膠成像儀(1708195)(美國(guó)BIO-RAD公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudio5，美國(guó)ABI公司)。

表1 研究對(duì)象的一般臨床資料

TSH：促甲狀腺激素；FT3：游離三碘甲狀腺原氨酸；FT4：游離四碘甲狀腺原氨酸；TT3：總?cè)饧谞钕僭彼?；TT4：總四碘甲狀腺原氨酸；TRAb：促甲狀腺激素受體抗體. TRAb取值上限為30. 與對(duì)照組比較，☆☆：P<0.01.

1.2.2標(biāo)本預(yù)處理 收集研究對(duì)象清晨空腹新鮮EDTA-K2抗凝靜脈血10 mL，20 ℃，2 000 r/min離心20 min，分離血漿備用，加入0.01 mol/L的PBS(DEPC水配制并高壓滅菌)，于剩余血細(xì)胞中稀釋補(bǔ)足至總體積20 mL，并上下顛倒充分混勻，按LTS1077說(shuō)明書采用密度梯度離心法分離，獲得較純的PBMC，加入1 mL Trizol試劑，混勻，室溫下裂解5 min，轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶的1.5 mL EP管中，并置于-80 ℃冰箱保存，以備提取RNA之用。

1.2.3提取PBMC總RNA 取出用Trizol均質(zhì)化的PBMC，室溫融化后按Trizol試劑說(shuō)明書提取總RNA。用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度及純度，確保OD260/280為1.8～2.0。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，要求凝膠圖譜中顯示28S，18S及5S 3條帶。檢測(cè)合格的產(chǎn)品立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄或置于-80 ℃冰箱備用。

表2 PCR引物序列

1.2.4miR-146a相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 按KR211說(shuō)明書將檢測(cè)合格的含有miRNA的總RNA先采用加尾法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后以U6為內(nèi)參，以RNase-Free水代替cDNA作為陰性對(duì)照，按FP411說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)miR-146a的相對(duì)表達(dá)量。所有反應(yīng)(包括陰性對(duì)照)均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔以保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應(yīng)體系見表3。miRNA逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min；熒光定量PCR的反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min→5×(94 ℃ 20 s→64 ℃ 30 s→72 ℃ 34 s)→40×[94 ℃ 20 s→60 ℃ 34 s(該過(guò)程收集熒光信號(hào))]→溶解曲線分析。

1.2.5miR-146a靶mRNA的相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) 按照FSQ-301說(shuō)明書將總RNA中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(以5×RT Master Mix Ⅱ no-RT Control代替5×RT Master Mix Ⅱ作為陰性對(duì)照)。然后以β-actin為內(nèi)參，以RNase-Free水及加入5×RT Master Mix Ⅱ no-RT Control的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液代替cDNA作為陰性對(duì)照，按照說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)靶mRNA表達(dá)。所有反應(yīng)(包括陰性對(duì)照)均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔以保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。反應(yīng)體系見表3；反應(yīng)條件如下：mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為RNA變性(65 ℃ 5 min→立即置于冰上冷卻)→去除基因組DNA(37 ℃溫育5 min→立即置于冰上冷卻)→逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(37 ℃ 15 min→50 ℃ 5 min→98 ℃ 5 min→4 ℃ hold)。熒光定量PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min→40×(95 ℃ 15 s→延伸45 s)→溶解曲線分析。延伸溫度可根據(jù)mRNA引物做適當(dāng)調(diào)整，延伸階段采集熒光值。

表3 miRNA或mRNA的逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.2.6RT-PCR相對(duì)定量基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析 采用軟件SDS Relative Quantifacation 7500 software v2.1(美國(guó)Applied Biosystems公司)自動(dòng)計(jì)算RT-PCR相對(duì)定量表達(dá)的平均Ct值及閾值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算分析各檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7甲狀腺功能及TRAb測(cè)量方法 采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。各指標(biāo)的正常值范圍分別是：TSH 0.4～5.0 mIU/L，TT3 0.95～2.60 nmol/L，TT4 0.73～84 nmol/L，F(xiàn)T3 2.76～7.65 pmol/L，F(xiàn)T4 10.29～25.70 pmol/L，TRAb 0～1.5 IU/L。

2 結(jié) 果

2.1PBMC中miR-146a及其靶mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，初發(fā)GD患者的PBMC中，miR-146a，TRAF-6和CCL5的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.01)；IL-8和CCL8的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)；IRAK1，IRAK2及FADD的表達(dá)水平差別則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體見表4。

表4初發(fā)GD和正常人PBMC中miR-146a及其靶mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

Tab 4Relative expression levels of miR-146a and its target mRNA in PBMCs in primary GD patients and healthy controls

檢驗(yàn)指標(biāo)對(duì)照組初發(fā)GD組miR-146a1.01±0.34 0.67±0.19☆I(lǐng)L-80.75(0.30～2.90)2.20(2.04～2.83)☆I(lǐng)RAK11.18(0.45～2.37)0.98(0.74～1.42)IRAK20.99(0.66～1.27)0.81(0.73～0.96)TRAF-61.05±0.340.67(0.53～0.82)☆FADD1.07±0.41 0.94±0.30CCL51.22±0.990.64(0.40～0.86)☆CCL80.85(0.46～3.49)1.90(0.74～5.11)☆

GD:Graves病. 與對(duì)照組比較，☆：P<0.01.

2.2miR-146a表達(dá)水平與IL-8及CCL8相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-146a表達(dá)水平與IL-8顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.294，P<0.05)，與CCL8也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.298，P<0.05)。

2.3miR-146a與IL-8及CCL8的mRNA和各臨床因子間相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，miR-146a，IL-8及CCL8與臨床指標(biāo)(TSH，TT3，TT4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TRAb)間具有明顯相關(guān)性(表5)。miR-146a表達(dá)水平與TSH水平呈正相關(guān)(P<0.01)，與TT3，TT4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4及TRAb呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。IL-8和CCL8的mRNA表達(dá)水平與TSH水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與TT3，TT4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4及TRAb水平呈正相關(guān)(P<0.01)。

表5 miR-146a與IL-8及CCL8水平和臨床各因子間相關(guān)性分析

TSH：促甲狀腺激素；FT3：游離三碘甲狀腺原氨酸；FT4：游離四碘甲狀腺原氨酸；TT3：總?cè)饧谞钕僭彼幔籘T4：總四碘甲狀腺原氨酸； TRAb：促甲狀腺激素受體抗體.

3 討 論

GD是最常見的甲亢，以產(chǎn)生自身抗體TRAb而使促甲狀腺激素分泌過(guò)多導(dǎo)致甲亢、彌漫性甲狀腺腫和Graves眼病(Graves ophthalmopathy，GO)等為特征，嚴(yán)重者甚至可因誘發(fā)甲亢危象或甲亢心而死亡[7]。雖然通過(guò)現(xiàn)有臨床表現(xiàn)、甲狀腺功能和TRAb已可對(duì)GD做出診斷，診斷價(jià)值已很高，但是仍然有必要進(jìn)一步研究探索GD的病因和發(fā)病機(jī)制。

miR-146a是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，可通過(guò)抑制其靶mRNA的表達(dá)或翻譯成蛋白質(zhì)而在TLR-NF-κB信號(hào)通路、FADD介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路以及RIG-1-I型干擾素途徑等信號(hào)途徑中發(fā)揮免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)作用，從而參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥綜合征(sjogren syndrome，SS)、1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)等多種自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程，且其表達(dá)水平及所調(diào)控的靶mRNA在不同疾病中存在差異[2,6,8-12]。而高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-146a在GD的不同組織中均存在差異性表達(dá)現(xiàn)象[13-18]。故推測(cè)miR-146a可通過(guò)差異性表達(dá)及調(diào)控不同的靶mRNA而在GD中發(fā)揮作用。

既往研究顯示，miR-146a在PBMC中的表達(dá)情況存在爭(zhēng)議。楊文娟等研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在GD的PBMC中表達(dá)量降低[18]；但Otsu等研究認(rèn)為，miR-146a在GD的PBMC中表達(dá)量增加[13]。本實(shí)驗(yàn)顯示，初發(fā)GD的PBMC中miR-146a表達(dá)量降低，與楊文娟等的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Otsu等只納入了經(jīng)甲巰咪唑治療后的緩解期GD和TRAb至少5年仍陽(yáng)性的頑固性GD患者，并未納入未進(jìn)行抗甲狀腺治療的初發(fā)GD患者；而楊文娟等納入的研究對(duì)象與本研究的實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)一致，均為未經(jīng)治療的初發(fā)GD患者，且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了楊文娟等的結(jié)論，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-146a的表達(dá)水平與TT3，TT4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4及TRAb水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與TSH水平呈顯著正相關(guān)。同時(shí)研究表明，miR-146a在初發(fā)GD患者的甲狀腺組織、血清中的表達(dá)量也降低[15，17]。故推測(cè)不同組織中表達(dá)量降低的miR-146a可能在初發(fā)GD中發(fā)揮了重要作用，而抗甲狀腺藥物治療GD的機(jī)制可能涉及到增加miR-146a的表達(dá)量。

既往對(duì)GD的研究并未涉及到miR-146a免疫相關(guān)性靶mRNA在GD中的表達(dá)情況。本研究進(jìn)一步測(cè)定了初發(fā)GD患者PBMC中IRAK1/2，TRAF，IL-8，CCL5，F(xiàn)ADD及MCP2的mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，初發(fā)GD患者PBMC中IL-8和CCL8表達(dá)量升高，與miR-146a的表達(dá)水平趨勢(shì)相反，且呈顯著負(fù)相關(guān)。推測(cè)miR-146a可能通過(guò)負(fù)性調(diào)控IL-8和CCL8的表達(dá)水平而在初發(fā)GD中發(fā)揮作用。

IL-8和CCL8均屬于趨化因子家族成員。IL-8即CXC趨化因子配體8[chemokine( C-X-C motif) ligand 8，CXCL8]，在炎性細(xì)胞趨化、血管生成、有絲分裂和細(xì)胞增殖中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用[19]。既往研究表明，GD患者血清miR-146a的表達(dá)水平下降[17,20]，IL-8水平升高，并與TRAb呈正相關(guān)[21]；GO患者脂肪細(xì)胞和眼眶成纖維細(xì)胞中miR-146a表達(dá)量增高[22-23]，人源性單克隆抗IGF-1R阻斷抗體——Teprotumumab可通過(guò)顯著性抑制IL-8的mRNA表達(dá)而抑制眼眶成纖維細(xì)胞中IGF-1誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)[24]。CCL8又稱為單核細(xì)胞趨化蛋白2( monocyte chemotactic protein 2， MCP2)，屬于CC家族成員，可通過(guò)與CCR1，CCR2，CCR3，CCR5及CCR8等結(jié)合，從而在炎癥反應(yīng)、腫瘤免疫等中發(fā)揮作用[25]。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1感染后的人腦小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)的miR-146a可抑制CCL8的表達(dá)，從而抑制CCR5介導(dǎo)的HIV-1感染[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GD患者PBMC中IL-8和CCL8的mRNA表達(dá)水平升高，并與血清TSH呈負(fù)相關(guān)，與TT3，TT4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4及TRAb呈正相關(guān)。故推測(cè)低表達(dá)的miR-146a可通過(guò)靶向升高IL-8和CCL8的mRNA的表達(dá)而在炎性細(xì)胞趨化、細(xì)胞增殖以及血管生成等方面發(fā)揮促進(jìn)作用，從而導(dǎo)致彌漫性甲狀腺腫和自身免疫性炎癥反應(yīng)，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，初發(fā)GD患者PBMC中TRAF-6和CCL5的mRNA表達(dá)量降低，與miR-146a的表達(dá)水平趨勢(shì)一致，且IRAK1/2和FADD水平與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。這些結(jié)果與miR-146a及其靶mRNA在其他自身免疫性疾病(如SS)的PBMC中的表達(dá)結(jié)果不同[17]，進(jìn)一步證實(shí)了miR-146a可能通過(guò)差異性表達(dá)及調(diào)控不同靶mRNA而參與不同自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制這一觀點(diǎn)。但目前并不能說(shuō)明這些靶mRNA與初發(fā)GD無(wú)關(guān)，因?yàn)閙iR-146a還可能通過(guò)抑制這些mRNA翻譯成蛋白質(zhì)而參與GD的發(fā)病，或者還有其他miRNA參與了對(duì)這些靶mRNA的表達(dá)調(diào)控，下一步實(shí)驗(yàn)可通過(guò)測(cè)定GD患者與正常人PBMC中這些靶蛋白的表達(dá)量以及其他與這些靶mRNA相關(guān)的miRNA的表達(dá)量而進(jìn)一步闡釋該觀點(diǎn)。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-146a與GD的發(fā)生密切相關(guān)，其可能通過(guò)抑制其靶基因IL-8和CCL8的mRNA的表達(dá)而參與GD的發(fā)病，雖然其診斷價(jià)值不大，但其表達(dá)水平未來(lái)可能作為預(yù)測(cè)GD發(fā)生的輔助潛在生物學(xué)指標(biāo)，未來(lái)也有可能成為治療GD的生物學(xué)靶點(diǎn)。但由于樣本量有限，還未能完全闡明其具體作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。