胞內(nèi)模式識別受體在抗白色念珠菌感染中的作用研究進展*

余達浪，陳玲霞，謝 璐，劉志春，劉志平

(贛南醫(yī)學院 1.2017級碩士研究生；2.基礎醫(yī)學院， 江西 贛州 341000)

近年來，真菌發(fā)病率特別是白色念珠菌發(fā)病率年年上升，而且致死率也逐年增加[1-4]。免疫缺陷病人增多、抗真菌藥物數(shù)量有限和耐藥是造成播散性念珠菌相關疾病的高發(fā)病率和高死亡率的主要原因[5]。因此，了解宿主免疫系統(tǒng)如何對抗真菌感染對于開發(fā)新的基于免疫應答的療法至關重要。模式識別受體是宿主在漫長種系進化繁衍過程中形成的對抗病原體侵襲的首要防御線[6-7]。當白色念珠菌侵入宿主后,模式識別受體(PRRs)識別并結合白色念珠菌表面的病原體相關分子模式(PAMPs),活化宿主固有免疫,從而發(fā)揮抗真菌作用[8]。宿主主要有兩類PRRs[9]：一類是胞外PRRs,如Toll樣受體(TLRs)和C型凝集素受體(CLRs),通過識別胞外白色念珠菌PAMPs,然后活化細胞內(nèi)信號來激活宿主免疫應答;另一類是胞內(nèi)PRRs,包括NOD樣受體(NLRs)和RIG-I樣受體(RLRs),在白色念珠菌感染的相關疾病中也發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用。本文就胞內(nèi)PRRs的類型及它們在抗白色念珠菌感染中的作用機制進行綜述。

1 胞內(nèi)模式識別受體的類型

目前研究發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)PRRs主要是NLRs和RLRs兩類。在人體內(nèi)已鑒定的NLR家族分子共23種，在小鼠體內(nèi)至少有34種，其中NOD1和NOD2是在NLR家族中最早報道發(fā)現(xiàn)的[10]。NLR家族成員中,有些可直接發(fā)揮作用,有些可以形成多蛋白復合物從而發(fā)揮作用,這種蛋白復合物被稱為炎癥小體(或炎性小體),包括NLRP3、NLRC4、NLRP1等。NLR家族成員中,具有抗白色念珠菌作用的主要有NLRP3、NLRC4和NLRP10。RLRs是胞內(nèi)識別PAMPs的重要分子家族,包括維甲酸誘導基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相關蛋白5(MDA-5)、遺傳學和生理學實驗室蛋白2(LGP2)等分子，但有關胞內(nèi)PRRs在抗白色念珠菌感染作用研究報道較少。

2 胞內(nèi)PRRs在抗白色念珠菌感染中的作用

2.1NLRP3在抗白色念珠菌感染中的作用NLR通過識別白色念珠菌PAMP而活化炎癥小體誘導免疫應答殺滅白色念珠菌，其中目前最廣為研究的炎癥小體是NLRP3[11]。NLRP3炎癥小體分布在免疫細胞的胞漿內(nèi),主要由NLRP3、ASC和Caspase-1連接而成,能活化Caspase-1促進IL-1β和IL-18生成[12-14]，其中IL-1β活化Th17細胞促進炎癥反應[15]，IL-18活化Th1細胞和NK細胞生成IFN-γ[16-17]，二者協(xié)同作用對抗侵襲宿主的白色念珠菌。NLRP3炎癥小體以依賴Caspase-1方式活化NF-κB信號途徑[18]，還能激活P38/MAPK通路和TAK1/JNK途徑,誘導炎癥反應及細胞焦亡[19-20]。

白色念珠菌細胞壁成份如β-葡聚糖、幾丁質(zhì)和甘露聚糖等是引發(fā)宿主固有免疫的誘導物。β-葡聚糖可以激活依賴于Dectin-1/syk通路的NLRP3炎癥小體，誘導IL-1β的產(chǎn)生。宿主細胞依賴真菌葡聚糖誘導產(chǎn)生的ROS，通過NLRP3/ASC/Caspase-1軸誘導IL-1β分泌[21]，破壞溶酶體導致了組織蛋白酶(比如組織蛋白酶 B和組織蛋白酶L等)泄露至胞質(zhì)中，活化NLRP3[22]；另外凝膠多糖(真菌的β-1，3-葡聚糖)還可以刺激宿主B淋巴細胞產(chǎn)生IgM抗體，而NLRP3基因缺陷宿主則不能產(chǎn)生相應抗體[23]，這些提示NLRP3炎癥小體在白色念珠菌細胞壁成份誘導的固有免疫甚至適應性免疫中均發(fā)揮重要的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖或白色念珠菌誘導的宿主細胞的炎癥反應和細胞死亡,是由NLRP3-ASC-Caspase-1通路協(xié)同Dectin-1/CR3/Caspase-8通路共同完成,表明白色念珠菌感染時宿主可能通過多條信號通路針對白色念珠菌細胞壁成份即β-葡聚糖進行應答[24]。

白色念珠菌分泌型天冬氨酰蛋白酶(Sap)，是真菌毒力的重要致病因子,可以分解宿主多種蛋白質(zhì)。正是由于Sap利用分解蛋白質(zhì)功能為白色念珠菌提供營養(yǎng)物質(zhì),并促進白色念珠菌粘附并侵入宿主細胞,造成宿主組織細胞損傷以及協(xié)助白色念珠菌從宿主細胞中逃逸[25]。Sap家族特別是Sap2和Sap6通過NLRP3-ASC-Caspase-1通路活化免疫細胞中的NLRP3炎癥小體,繼而產(chǎn)生IL-1β和IL-18,但經(jīng)過Sap內(nèi)化抑制劑處理后,IL-1β的產(chǎn)生明顯減少,表明炎癥小體的活化依賴網(wǎng)格蛋白誘導的Sap內(nèi)化,以及K+內(nèi)流和ROS的生成[26]。因此,在白色念珠菌感染過程中,Sap能夠提高宿主抗真菌免疫力而不僅僅是協(xié)助真菌逃避免疫。Sap2和Sap6還能夠通過旁路途徑活化炎癥小體。另外,Sap2和Sap6通過I型干擾素活化Caspase-11,后者協(xié)同Caspase-1共同誘導IL-1β和IL-18的分泌[27]。免疫細胞通過Caspase-11和Caspase-1之間的聯(lián)系將炎癥小體的經(jīng)典活化與旁路活化結合起來,對抗白色念珠菌侵襲及其產(chǎn)生的Sap,這也說明宿主對抗白色念珠菌感染及其產(chǎn)生的致病因子應該是不同角度多方位進行應答的。

白色念珠菌具有酵母相和菌絲相兩種存在形態(tài),其中菌絲相是體現(xiàn)白色念珠菌致病能力的一個重要特征。研究表明白色念珠菌依賴NLRP3和Caspase-1誘導巨噬細胞焦亡,并且發(fā)現(xiàn)白色念珠菌菌株形態(tài)是影響焦亡以及IL-1β水平的重要因素[28]。滅活的酵母相白色念珠菌不會觸發(fā)巨噬細胞焦亡,只能誘導低水平的IL-1β產(chǎn)生,而只有白色念珠菌非酵母相才能誘導免疫細胞焦亡,另外,選用在形態(tài)上能形成假菌絲而不能形成真菌絲的克柔念珠菌進行實驗后,發(fā)現(xiàn)克柔念珠菌能夠誘導巨噬細胞焦亡及活化NLRP3產(chǎn)生IL-1β,但產(chǎn)生的IL-1β水平低于白念珠菌實驗組;選用形態(tài)上難以形成菌絲相的光滑念珠菌進行實驗時基本上不觸發(fā)焦亡及IL-1β的產(chǎn)生。另外,白色念珠菌UPC2突變株比未突變株更能誘導巨噬細胞焦亡,且能產(chǎn)生高水平的IL-1β;而白色念珠菌UPC2基因敲除株比未敲除株誘導巨噬細胞焦亡程度減輕,此時對白色念珠菌的菌絲并無明顯影響,提示白色念珠菌所致焦亡也受到轉錄因子UPC2的調(diào)控[28]。綜上所述，菌絲雖然是觸發(fā)NLRP3誘導焦亡的重要因素，但卻不是唯一的條件，因為轉錄因子UPC2也參與焦亡調(diào)控過程。

研究人員把形成菌絲的相關基因敲除后的白色念珠菌感染小鼠陰道,發(fā)現(xiàn)小鼠陰道沖洗液中中性粒細胞、鈣結合蛋白與IL-1β水平,相比野生菌株均明顯降低[29]。實驗發(fā)現(xiàn),白色念珠菌以NLRP3依賴方式誘導巨噬細胞分泌IL-1β,而不能形成菌絲的變異株則不能誘導巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β;另外Nlrp3-/-小鼠感染白色念珠菌后,肝、脾、腎等臟器的真菌負荷明顯高于對照野生型小鼠,說明Nlrp3-/-小鼠對白色念珠菌更加易感[30]。將白色念珠菌感染Nlrp3-/-小鼠的陰道,發(fā)現(xiàn)Nlrp3-/-小鼠陰道沖洗液中中性粒細胞減少,IL-1β、IL-6等炎性因子的分泌明顯降低,此時宿主抗白色念珠菌的能力明顯減弱[31]。這些實驗證明菌絲相的白色念珠菌對于NLRP3炎性小體活化以及IL-1β的分泌相當重要,同時表明在清除白色念珠菌的固有免疫中NLRP3具有非常重要的作用。

白色念珠菌線粒體外膜/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的4種蛋白質(zhì)Mmm1/Mdm10/Mdm12/Mdm34形成的復合物即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)-線粒體鏈(ERMES)對于維持線粒體形態(tài)以及菌體在宿主體內(nèi)的生長非常重要[32]。為了準確觀察巨噬細胞吞噬白色念珠菌后的炎癥小體反應,用活細胞成像技術分析了白色念珠菌激活炎癥小體時ERMES的作用。結果顯示,Mmm1變異株及在NLRP3抑制劑MCC950作用下均使宿主NLRP3炎癥小體活化程度降低和巨噬細胞焦亡程度減輕。ERMES活性喪失會破壞白色念珠菌線粒體形態(tài),導致白色念珠菌菌絲相生長緩慢[32]，提示ERMES與NLRP3炎癥小體活化密切相關,也就是說白色念珠菌對NLRP3炎癥小體的影響離不開自身線粒體形態(tài)的完整及菌絲的正常生長。另外對于平衡宿主炎癥小體過度活化造成的免疫損傷與抗真菌免疫,還需要進一步研究。據(jù)ERMES突變體表型特征,且人體缺乏ERMES[33]，表明ERMES是抗白色念珠菌治療中充滿前景的靶標。

2.2NLRP10在抗白色念珠菌感染中的作用NLRP10是唯一不具有C末端的亮氨酸重復序列(LRRs)結構域的NLR蛋白,主要分布在人和小鼠的腎臟組織、睪丸和結腸組織中。據(jù)推測NLRP10不識別PAMPs,可能在相關通路中僅發(fā)揮調(diào)控作用[34]。NLRP10通過其PYD結構域和ASC結合成復合物,再與Caspase-1活化NLRP3炎癥小體;另外也與RIP2、TAK1和NEMO等蛋白質(zhì)相互作用加強NOD1調(diào)節(jié)的免疫應答反應[35]。通過觀察白色念珠菌感染Nlrp10-/-小鼠和WT小鼠實驗后,發(fā)現(xiàn)Nlrp10-/-小鼠比WT小鼠更易感,且在體內(nèi)并未影響NLRP3炎癥小體的活化,但宿主體內(nèi)細胞因子IFN-γ和IL-17的分泌量明顯降低[36],顯示Th1和Th17特異性應答反應明顯減弱,表明NLRP10在宿主抗白色念珠菌感染的免疫過程中具有重要作用,但是參與宿主抗白色念珠菌感染的確切機制不清楚,有待于進一步的研究。

2.3NLRC4在抗白色念珠菌感染中的作用NLRC4也稱IPAF、Card12以及CLAN，為胞漿內(nèi)受體蛋白NLR家族成員[37]，其C端為亮氨酸重復結構域(LRRs),具有識別PAMPs等配體的作用。中間為NACHT結構域,由NAIP、CIITA、HET-E和TP1組成,可介導NLRC4寡聚反應。N端為效應結構域,含三個Caspase募集結構域(CARD),可連接ASC和效應分子,轉導下游信號。NLRC4發(fā)生多聚化,募集Caspase-1與ASC結合成炎癥小體,誘導IL-1β產(chǎn)生，引起免疫應答[38]。研究發(fā)現(xiàn)正常小鼠口腔感染白色念珠菌后,口腔粘膜細胞中NLRC4、IL-1β、IL-6和IL-17的表達上升,以及舌背上皮中性粒細胞浸潤程度增高,而感染白色念珠菌的Nlrc4-/-小鼠則降低,表明 NLRC4在宿主粘膜組織早期抗白色念珠菌感染中發(fā)揮作用[39]。但是白色念珠菌激活NLRC4炎性小體的具體機制并不清楚,有待今后的研究闡明。

2.4MDA5在抗白色念珠菌感染中的作用MDA5是RIG-I樣受體家族的重要成員,有誘導細胞終端分化作用。N端包括2個相同的CARD,中間為DExD/H解旋酶區(qū),C端是沒有活性的抑制域(RD)。MDA5識別細小RNA病毒,依賴CARD結構域與接頭蛋白IPS-1相互作用,活化IRF-3/IRF-7,激活NF-κB,促進IFN-β的表達,從而引起宿主先天免疫反應[40]。

采用白色念珠菌的酵母相或菌絲相刺激來源于Mda5-/-小鼠的脾細胞后,結果顯示細胞不能產(chǎn)生IFN-β,細胞因子IL-6和IL-10表達水平也較低,同時表明在宿主防御白色念珠菌感染的過程中MDA 5起著重要的作用[41]。Ⅰ型干擾素在抗真菌感染中起重要作用,MDA5可能作為一種受體部分參與了白色念珠菌感染時Ⅰ型干擾素的表達,MDA5突變導致表達或活性的增加,可能會增加IFN的產(chǎn)生[42-43]。I型干擾素的異常產(chǎn)生反過來又會引起免疫反應的不平衡。IfnarI-/-小鼠對系統(tǒng)性念珠菌感染的抵抗力更強[44]，Mda5-/-小鼠對播散性念珠菌病更有抵抗力[41]，提示MDA5在抗白色念珠菌感染過程中起負調(diào)控作用。目前，除了RNAs是MDA5的配體，白色念珠菌感染后特異識別并激活MDA5是否還有其它配體及確切機制尚不清楚，有待進一步研究。

3 結論與展望

胞內(nèi)模式識別受體通過識別白色念珠菌的PAMPs,活化宿主固有免疫,繼而啟動適應性免疫,啟動機體抗白色念珠菌感染的免疫反應(圖1)。但是胞內(nèi)模式受體識別配體、活化下游信號通路以及胞內(nèi)模式受體間的確切機制仍然不是很清楚,還需深入探究。以NLRP3、ASC和Caspase-1為核心的NLRP3炎癥小體,參與了人類眾多疾病的發(fā)生發(fā)展[45-47]。小分子抑制劑(CY-09)能夠抑制NLRP3炎癥小體的活化和IL-1β的產(chǎn)生[48]，在NLRP3相關的炎癥型疾病動物模型中，曲尼斯特能夠治療NLRP3驅動的相關炎癥性疾病[49]，提示胞內(nèi)模式識別受體可作為一種潛在的藥物靶標。目前抗真菌感染的藥物大多具有毒性，在臨床應用方面這些藥物又有其局限性,且隨著抗真菌藥物的大量應用,不斷出現(xiàn)真菌耐藥性,抗真菌治療也變得舉步維艱。胞內(nèi)模式識別受體及其信號通路相關分子可作為潛在的藥物靶點，為抗白色念珠菌感染的藥物開發(fā)和真菌病的治療提供新的思路和路徑。

圖1 模式識別受體在抗白色念珠菌感染中的作用