響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取女貞子中熊果酸工藝

(淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,淮北師范大學(xué)信息學(xué)院,資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽淮北 235000)

女貞子是木犀科植物女貞(LigustrumlucidumAit)的成熟果實(shí),性味甘、苦、涼,歸肝、腎經(jīng),具有補(bǔ)益肝腎、滋陰清熱、明目烏發(fā)等功效,能治療慢性支氣管炎、骨質(zhì)疏松癥[1-2]、急性黃疽型肝炎和慢性病毒性肝炎,具有提高機(jī)體免疫力[3]、抗衰老[4]、降血糖[5-6]、調(diào)血脂[6]、抗肥胖[7]、抗腫瘤[3,8]、保肝[9]等作用。熊果酸(Ursolic Acid,UA)和齊墩果酸(Oleanoic Acid,OA)是女貞子發(fā)揮藥理作用的主要有效成分之一[10]。

熊果酸傳統(tǒng)的提取方法有浸提和索氏提取[11]。近年來,超臨界CO2流體萃取[12]、微波提取[13-14]、超聲提取[15]等新技術(shù)應(yīng)用在熊果酸提取及分離純化上。超臨界CO2流體萃取具有選擇性好、提取時(shí)間短、提取效率高、產(chǎn)品雜質(zhì)少、萃取劑無毒無害、溶劑用量少、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),但提取條件要求較高、成本高、高溫高壓,存在安全隱患[16]。超聲提取是利用空化作用導(dǎo)致細(xì)胞破裂,增加溶劑的傳質(zhì),具有提取時(shí)間短、提取溫度低及溶劑用量少等特點(diǎn),但仍存在一些問題而難以大規(guī)模工業(yè)化推廣[17]。微波提取具有時(shí)間短、能耗低、效率高、選擇性強(qiáng)、溶劑用量少、環(huán)境污染小等特點(diǎn)[18-20]。一般采用正交設(shè)計(jì)或響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取熊果酸工藝。因此,本研究以女貞子為原料,以女貞子中熊果酸提取量為評價(jià)指標(biāo),在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化分析,從而確定微波輔助提取女貞子中熊果酸的工藝,以期為女貞子深入研究及熊果酸工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

女貞子 采收于淮北師范大學(xué)校區(qū),經(jīng)薛建平教授鑒定為木犀科植物女貞的成熟果實(shí),干燥后經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎備用;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(含量94.7%) 中國藥品生物制品檢定所;無水乙醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛等 均為國產(chǎn)分析純。

CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀 上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司;FDV 型超微粉碎機(jī) 北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司;DU 700 型紫外/可見分光光度計(jì) 美國貝克曼公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 女貞子中熊果酸提取方法 分別稱取5.00 g女貞子粉,加入一定濃度的乙醇溶液在一定微波功率下浸提一定時(shí)間,靜置冷卻,抽濾后,用85%的乙醇溶液定容至250 mL得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.2 女貞子中熊果酸提取單因素研究

1.2.2.1 乙醇濃度的選擇 稱取5.00 g女貞子,按料液比1∶20 g/mL加入65%、70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液,在微波功率400 W,萃取180 s后,冷卻、抽濾定容得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.2.2 微波功率的選擇 稱取5.00 g女貞子,按料液比1∶20 g/mL加入85%的乙醇溶液,分別在100、200、300、400、500、600 W的微波功率下,萃取180 s后,冷卻、抽濾定容得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.2.3 料液比的選擇 稱取5.00 g女貞子,按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL的料液比分別加入85%的乙醇溶液,在微波功率400 W下,萃取180 s后,冷卻、抽濾定容得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.2.4 浸提時(shí)間的選擇 稱取5.00 g女貞子,按料液比1∶20 g/mL加入85%的乙醇溶液,在微波功率400 W下,分別萃取60、90、120、150、180、210、240、270 s后,冷卻、抽濾定容得含有熊果酸的待測溶液。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 采用Minitab 15軟件中的Box-Behnken方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以乙醇濃度(X1)、微波功率(X2)、液料比(X3)、提取時(shí)間(X4)為自變量,以女貞子中熊果酸提取量(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1。

表1 Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in theBox-Benhnken experimental design

表中各自變量編碼值與真實(shí)值之間的關(guān)系分別為:x1=(X1-85)/5,x2=(X2-400)/100,x3=(X3-20)/5,x4=(X4-150)/30。

1.2.4 熊果酸含量的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的熊果酸標(biāo)品10.00 mg,用無水乙醇溶解并定容至100 mL,得濃度為100 μg/mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分別置于試管,在85 ℃水浴鍋中揮干溶劑后,加入5%香草醛醋酸溶液0.50 mL及高氯酸1.00 mL搖勻,將試管置于60 ℃水浴中保溫15 min,冷卻至室溫,加入冰醋酸5.0 mL,搖勻后放置15 min顯色,在546 nm波長處測定吸光度[21]。以熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品含量(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得線性回歸方程:A=0.0072C-0.0461,R2=0.9997。

1.2.4.2 女貞子中熊果酸含量的測定 取女貞子提取液1.00 mL置于試管中,在85 ℃水浴鍋中揮干溶劑后,加入5%香草醛醋酸溶液0.50 mL及高氯酸1.00 mL搖勻,將試管置于60 ℃水浴中保溫15 min,冷卻至室溫,加入用冰醋酸5.0 mL,搖勻后放置15 min顯色,在546 nm波長處測定吸光度。根據(jù)線性回歸方程換算成提取液中的熊果酸含量,并按下式計(jì)算其熊果酸提取量。

式中:c為提取液中熊果酸含量(mg/mL);V為提取液的總體積(mL);m為女貞子質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗(yàn)均重復(fù)3次,利用Minitab 15和Excel 2007統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對女貞子中熊果酸提取效果的影響

不同乙醇濃度對女貞子中熊果酸提取量的影響結(jié)果如圖1。由圖1可知,女貞子中熊果酸提取量隨乙醇濃度的增大而增加,乙醇濃度為85%時(shí),熊果酸提取量最大,為4.373 mg/g。且根據(jù)相似相溶原理,85%乙醇水溶液的極性與女貞子中熊果酸的極性最接近,所以選取85%為自變量乙醇濃度的零水平。

圖1 乙醇濃度對熊果酸提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentrationon the extraction yield of ursolic acid

2.2 微波功率對女貞子中熊果酸提取效果的影響

不同微波功率對女貞子中熊果酸提取量的影響如圖2。由圖2可知,微波功率低于400 W時(shí),熊果酸提取量隨著微波功率的增大而提高;當(dāng)微波功率超過500 W,熊果酸提取量隨著微波功率的升高而降低。通過對400 W與500 W功率條件下熊果酸提取量的顯著性分析,發(fā)現(xiàn)差異不顯著,因此選取400 W為自變量微波功率的零水平。

圖2 微波功率對熊果酸提取量的影響Fig.2 Effect of microwave poweron the extraction yield of ursolic acid

2.3 料液比對女貞子中熊果酸提取效果的影響

不同料液比對女貞子中熊果酸提取量的影響見圖3。由圖3可知,料液比在1∶10～1∶20 g/mL范圍內(nèi),熊果酸提取量隨料液比的增大而顯著提高(P<0.05),當(dāng)料液比超過1∶20 g/mL時(shí),熊果酸提取量增加的趨勢變緩,這是由于女貞子中熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)是一定的。綜合考慮提取溶劑的成本及熊果酸提取液真空濃縮的效率等問題,其料液比控制1∶20 g/mL左右為宜。

圖3 料液比對熊果酸提取量的影響Fig.3 Effect of solid-to-solvent ratioon the extraction yield of ursolic acid

2.4 浸提時(shí)間對女貞子中熊果酸提取效果的影響

不同浸提時(shí)間對女貞子中熊果酸提取量的影響見圖4。由圖4可知,隨微波時(shí)間的增加,熊果酸提取量呈先迅速增加后緩慢降低的趨勢。是因?yàn)殡S微波時(shí)間增加的過程中,女貞子細(xì)胞破裂加劇,熊果酸溶出率提高[22]。當(dāng)浸提時(shí)間150 s時(shí),熊果酸提取量達(dá)到最大,所以,選取150 s為自變量時(shí)間的零水平。

圖4 浸提時(shí)間對熊果酸提取量的影響Fig.4 Effect of extraction timeon the extraction yield of ursolic acid

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化女貞子中熊果酸的提取工藝

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及回歸模型建立 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and correspondingresults for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

注:*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01);表4同。

表4 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test of regression coefficients in regression model

2.5.2 方差分析 表3的方差分析表明,該模型極顯著(P<0.01),而失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),表明響應(yīng)值熊果酸提取量實(shí)際值與預(yù)測值之間具有較好的相關(guān)性。由表4可知,一次項(xiàng)X1、X2、X3和X4極顯著(P<0.01),說明乙醇濃度、微波功率、液料比和浸提時(shí)間對女貞子中熊果酸提取量的影響是極顯著的。交互項(xiàng)X3X4極顯著(P<0.01),說明料液比和浸提時(shí)間交互項(xiàng)對女貞子中熊果酸提取量極顯著影響,交互項(xiàng)X1X3和X2X4顯著(P<0.05),說明乙醇濃度和料液比及微波功率和浸提時(shí)間交互項(xiàng)對女貞子熊果酸提取量的影響顯著。二次項(xiàng)X12、X22、X32和X42對女貞子中熊果酸提取量的影響也極顯著(P<0.01)。

2.5.3 響應(yīng)面分析 微波輔助提取女貞子中熊果酸的響應(yīng)面和等高線見圖5,從圖5A可知,曲面比較陡峭,說明乙醇濃度、微波功率對熊果酸提取量影響顯著,但兩者的交互作用不顯著(P=0.514),等高線圖接近圓形。從圖5B可知,曲面比較陡峭,同時(shí)等高線是橢圓形,說明乙醇濃度、料液比及交互作用對熊果酸提取量影響顯著。從圖5C可知,乙醇濃度與浸提時(shí)間對熊果酸提取量影響顯著,但兩者的交互作用不顯著(P=0.148),等高線圖接近圓形。從圖5D可知,料液比與微波功率對熊果酸提取量影響顯著,但兩者的交互作用不顯著(P=0.067),其等高線圖接近圓形。從圖5E和圖5F可知,曲面比較陡峭,等高線呈橢圓形,說明微波功率、浸提時(shí)間與料液比及它們交互作用對熊果酸提取量影響顯著。

圖5 熊果酸響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for ursolic acid

2.5.4 女貞子中熊果酸最佳提取工藝條件的確定和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 利用Minitab 15軟件對試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析,獲得熊果酸提取工藝最佳參數(shù):乙醇濃度為88.5%、微波功率為479 W、料液比為1∶23.4 g/mL、微波浸提時(shí)間為166 s,女貞子中熊果酸提取量預(yù)測值為4.681 mg/g。考慮到實(shí)際操作的便利,確定女貞子中熊果酸微波輔助提取的工藝參數(shù)為:乙醇濃度為88%、微波功率為480 W、料液比為1∶23 g/mL、微波浸提時(shí)間為166 s。為證實(shí)預(yù)測的結(jié)果,用試驗(yàn)中得到的最佳提取工藝參數(shù)做3次平行實(shí)驗(yàn),其熊果酸平均提取量為(4.653±0.087) mg/g,與預(yù)測值相對誤差為0.47%,說明該方程預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相吻合。與鄭艷等[23]研究結(jié)果相比,女貞子熊果酸提取量相近,但提取時(shí)間由120 min縮短為166 s,因此具有較好應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以熊果酸提取量為響應(yīng)值,利用Minitab 15軟件優(yōu)化分析,各因素對女貞子中熊果酸提取量的影響大小順序?yàn)?乙醇濃度>浸提時(shí)間>微波功率>液料比,其中料液比與浸提時(shí)間交互作用極顯著,料液比與乙醇濃度及浸提時(shí)間與微波功率交互作用顯著。優(yōu)化后的女貞子中熊果酸提取藝條件為:乙醇濃度88%、微波功率480 W、料液比1∶23 g/mL、微波浸提時(shí)間166 s。在此優(yōu)化條件下,女貞子中熊果酸提取量為(4.653±0.087) mg/g。