高效液相色譜-熒光法測(cè)定油炸型膨化食品中4種多環(huán)芳烴

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(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東濟(jì)南 250101;2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一類(lèi)廣泛存在的致癌、致畸、致突變的環(huán)境污染物,包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán),主要來(lái)源于有機(jī)物的不完全燃燒[1-2]?？諝庵械腜AHs主要通過(guò)呼吸道進(jìn)入人體,而水體、食品中的PAHs則通過(guò)飲食進(jìn)入人體[3-4]。PAHs具有親脂性的特點(diǎn),在食用油、熏燒烤肉及水產(chǎn)品等食品中均有檢出。苯并[a]蒽(BaA)、(CHR)、苯并[b]熒蒽(BbF)和苯并[a]芘(BaP)是毒性較強(qiáng)的4種PAHs[5-6],其中BaP被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸為1類(lèi)致癌物,其余三種歸為2B類(lèi)致癌物[7]。因此,國(guó)內(nèi)和國(guó)際上對(duì)PAHs規(guī)定了限量要求。我國(guó)《食品安全安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》(GB 2762-2017)中規(guī)定了谷物及其制品、熏燒烤肉類(lèi)和熏烤水產(chǎn)品中BaP的限量為5.0 μg/kg,油脂及其制品中BaP的限量為10 μg/kg。2015年歐盟委員會(huì)規(guī)定出口歐盟的部分食品中4種PAHs的總量不得超過(guò)50 μg/kg[8]。因此,建立能夠快速同時(shí)測(cè)定4種PAHs含量的方法具有重要意義。

目前報(bào)道的PAHs的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[9-13]和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[14-17]。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法靈敏度高,穩(wěn)定性好,但是對(duì)樣品的凈化效果要求比較高。食品基質(zhì)比較復(fù)雜,易受雜質(zhì)干擾,因此必須對(duì)樣品進(jìn)行前處理。常見(jiàn)的前處理方法主要有索式提取法[18]、液-液萃取法[9]、超聲提取法[19]、固相萃取法[11-12]和凝膠滲透色譜[20]。其中,固相萃取法由于簡(jiǎn)單、節(jié)約溶劑、重現(xiàn)性好得到廣泛的應(yīng)用。

油炸型膨化食品由于食用方便、香酥可口、口味多樣受到眾多消費(fèi)者的歡迎,其主要成分包括碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等。因膨化食品屬于高油脂、高熱量的食品,而多環(huán)芳烴屬于環(huán)境污染物,具有親脂性的特點(diǎn),有可能會(huì)遷移到食品中。油炸型膨化食品在加工過(guò)程中會(huì)有煎炸工藝,有研究[21]表明油脂煎炸過(guò)程中會(huì)引起多環(huán)芳烴的變化,因此,2017年國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局將油炸型膨化食品中BaA、CHR、BbF和BaP列入食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)計(jì)劃。目前對(duì)膨化食品中多環(huán)芳烴的檢測(cè)少有報(bào)道。

本文采用高效液相色譜法,系統(tǒng)考察了提取方式、提取溶劑種類(lèi)、提取次數(shù)、凈化方式等對(duì)油炸型膨化食品中BaA、CHR、BbF、BaP提取和分離的影響,并考察了流動(dòng)相及色譜柱種類(lèi)對(duì)分離的影響,以期建立油炸型膨化食品中4種多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈、正己烷、二氯甲烷 色譜純,德國(guó)Merck公司;乙醚、石油醚、氯化鈉 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%,濃度100 mg/L)、苯并[a]蒽(純度99.0%,濃度100 mg/L)、苯并[b]熒蒽(純度99.1%,濃度100 mg/L)、苯并[a]芘(純度99.5%,濃度100 mg/L) 美國(guó)o2si公司;Cleanert BAP-3固相萃取柱(500 mg/6 mL) 艾杰爾;色譜柱PAH C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國(guó)Waters公司;實(shí)驗(yàn)用膨化食品(薯片、蝦條、鍋巴) 購(gòu)自濟(jì)南市當(dāng)?shù)爻小?/p>

Waters 2695型高效液相色譜儀(配備2475熒光檢測(cè)器) 美國(guó)Waters公司;3-18K臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;BT 125D電子天平 德國(guó)Sartorius公司;MS3型旋渦混合器 德國(guó)IKA公司;SB-800DTD超聲清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;HGC-24型氮吹儀 恒奧科技有限公司;GM-300型粉碎機(jī) 德國(guó)萊馳公司;Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確移取4種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1 mL于同一10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成濃度為1 mg/L的多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)實(shí)際需要移取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液液用乙腈進(jìn)行稀釋,得到濃度分別為0.5、1、4、20、40 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品制備 將實(shí)驗(yàn)所用薯片、蝦條、鍋巴分別于粉碎機(jī)中以10000 r/min轉(zhuǎn)速下粉碎,充分混勻,儲(chǔ)存于潔凈的容器中,4 ℃保存。

1.2.3 樣品前處理 提取:準(zhǔn)確稱(chēng)取1.2.2中制備的樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管A中,加入5 mL飽和氯化鈉溶液分散均勻,再加入10 mL正己烷,渦旋混合3 min,40 kHz頻率下常溫超聲提取15 min,室溫下8000 r/min離心5 min,取上層正己烷層于50 mL具塞離心管B中,離心管A中的溶液用10 mL正己烷重復(fù)提取一次,正己烷層合并于50 mL離心管B中,取10 mL于15 mL離心管中,作為待凈化液。凈化:依次用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化BAP-3固相萃取柱,將待凈化液全部轉(zhuǎn)移至SPE柱,5 mL正己烷淋洗,7 mL二氯甲烷洗脫,40 ℃下將洗脫液氮吹濃縮至干,最后用1 mL乙腈復(fù)溶,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,待HPLC-FLD檢測(cè)。同時(shí)做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

1.2.4.1 提取方式的選擇 考察了索式提取、超聲提取和液液萃取-超聲提取三種提取方式對(duì)目標(biāo)物的提取效率。

索式提取:稱(chēng)取1.2.2中制備的樣品2 g于索式提取器中,加入120 mL乙醚/石油醚混合液(體積比1∶1),連續(xù)提取4 h,經(jīng)濃縮后,用5 mL正己烷復(fù)溶,作為待凈化液。凈化方法同1.2.3中的凈化方法。

超聲提取:除不加飽和氯化鈉溶液外,其余步驟同1.2.3。

液液萃取-超聲提取:步驟同1.2.3。

1.2.4.2 提取溶劑種類(lèi)的選擇 根據(jù)多環(huán)芳烴親脂性特點(diǎn),本研究考察了正己烷、乙醚、乙腈三種提取溶劑目標(biāo)物的提取效率,其它步驟和條件同1.2.3。

1.2.4.3 提取次數(shù)的優(yōu)化 考察了正己烷為萃取溶劑,對(duì)樣品分別提取1、2、3次時(shí),4種多環(huán)芳烴的回收率,其它步驟和條件同1.2.3。

1.2.4.4 凈化條件的選擇 考察了中性Al2O3柱(22 g/60 mL,艾杰爾)、Cleanert BAP-3固相萃取柱(500 mg/6 mL,艾杰爾)和Florisil固相萃取柱(500 mg/3 mL,艾杰爾)對(duì)樣品的凈化效果。樣品提取步驟和條件同1.2.3。

1.2.5 液相色譜條件 色譜柱:Waters PAH C18反相鍵合固定相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃;進(jìn)樣量20 μL;流速:1.5 mL/min;流動(dòng)相:乙腈和水;檢測(cè)器:熒光檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)見(jiàn)表1;梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表1 4種多環(huán)芳烴的熒光檢測(cè)參數(shù)Table 1 Fluorescence detection program of 4 PAHs

表2 HPLC梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program for HPLC separation

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與儀器配套的Empower 3色譜數(shù)據(jù)處理軟件完成數(shù)據(jù)采集與處理,以及Microsoft Excel進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化分析

2.1.1 提取條件的選擇

2.1.1.1 提取方式 針對(duì)食品基質(zhì)中PAHs的提取方式主要有液液萃取(Liquid-liquid Extraction,LLE)[9]、索式提取(Soxhlet Extraction,SE)[18]和超聲萃取(Ultrasonic Extraction,UE)[19]和超臨界流體萃取(Supercritical Fluid Extraction,SFE)[22]。實(shí)驗(yàn)中考察了SE、UE、LLE-UE三種萃取方式對(duì)加標(biāo)量為25 μg/kg的薯片樣品中4種PAHs提取效率的影響(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明,以上三種提取方式的回收率均在80%以上,滿足實(shí)驗(yàn)要求,但SE耗時(shí)、溶劑消耗量大,因此不是資源節(jié)約、環(huán)境友好型方法的首選。LLE-UE相對(duì)于UE多了液液萃取步驟,能更好地分散樣品,起到一定程度的除雜效果,綜合考慮選擇LLE-UE作為樣品萃取處理方式。

圖1 提取方式對(duì)4種PAHs回收率的影響Fig.1 Effects of different extraction methodson the recoveries of the four kinds of PAHs

2.1.1.2 提取溶劑種類(lèi) 本研究比較了正己烷、乙醚、乙腈三種提取溶劑對(duì)薯片中4種PAHs提取效率的影響(見(jiàn)圖2)。乙醚和正己烷的提取效率相當(dāng),乙腈的提取效率稍低,這主要?dú)w因于物質(zhì)間的相似相溶原理。PAHs組分為非極性或弱極性物質(zhì),分散到溶液中的PAHs更容易被弱極性的乙醚或正己烷萃取出來(lái)。乙醚屬于易制毒試劑且極易揮發(fā),正己烷屬于低毒試劑,因此選擇正己烷為提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了水和飽和氯化鈉溶液分別作為分散劑時(shí)對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以水為分散劑時(shí),用正己烷萃取易產(chǎn)生乳化層,導(dǎo)致回收率偏低;以飽和氯化鈉溶液為分散劑時(shí)可避免乳化層的產(chǎn)生。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇了飽和氯化鈉溶液為分散劑。

圖2 提取溶劑對(duì)4種PAHs回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solventson the recoveries of the four kinds of PAHs

2.1.1.3 提取次數(shù) 提取次數(shù)對(duì)4種PAHs回收率的影響見(jiàn)圖3。對(duì)樣品只提取1次,各目標(biāo)物的回收率在71.0%～76.7%之間;提取2次,回收率在90.6%～96.2%之間;之后再增加提取次數(shù),回收率沒(méi)有明顯增加,因此,選擇提取次數(shù)為2次。

圖3 提取次數(shù)對(duì)4種PAHs回收率的影響Fig.3 Effects of different extraction numberson the recoveries of the four kinds of PAHs

2.1.2 凈化條件的選擇 油炸型膨化食品基質(zhì)比較復(fù)雜,含有大量的油脂等干擾物,而目標(biāo)物含量較低,因此需要在前處理過(guò)程中對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行凈化和富集。文獻(xiàn)報(bào)道的常見(jiàn)的凈化方式有皂化反應(yīng)[13]、凝膠滲透色譜[20]和固相萃取[11-12]等。皂化反應(yīng)往往需要較高的溫度和長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng),且皂化后需要進(jìn)一步富集;凝膠滲透色譜法儀器成本高,且溶劑使用量大。固相萃取由于簡(jiǎn)單、快速、節(jié)約溶劑等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于PAHs的凈化。

表3 3種小柱凈化樣品的條件及4種PAHs的回收率Table 3 SPE conditions and recoveries of four PAHs in samples

本實(shí)驗(yàn)考察了中性Al2O3柱(22 g/60 mL,艾杰爾)、Cleanert BAP-3固相萃取柱(500 mg/6 mL,艾杰爾)和Florisil固相萃取柱(500 mg/3 mL,艾杰爾)對(duì)薯片樣品的凈化效果。3種小柱的凈化方法及化合物的回收率見(jiàn)表3,凈化后的色譜圖見(jiàn)圖4。結(jié)果表明,樣品經(jīng)過(guò)三種固相萃取柱凈化后,回收率無(wú)明顯差異,但是經(jīng)過(guò)中性氧化鋁柱和弗羅里硅土柱凈化后,仍有雜質(zhì)峰影響的分離,而經(jīng)過(guò)BAP-3凈化后,雜質(zhì)峰消失。這主要是因?yàn)锽AP-3固相萃取柱是苯并芘分子印跡柱,對(duì)結(jié)構(gòu)相近的、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘等重質(zhì)PAHs可以選擇性的保留。另外,中性氧化鋁柱需要80 mL洗脫溶劑,溶劑消耗量較大;弗羅里硅土柱需要在上樣時(shí)開(kāi)始接液,氮吹時(shí)間較長(zhǎng)。綜合考慮,選擇BAP-3固相萃取柱作為凈化柱。

表4 4種PAHs的回歸方程、線性范圍、r及LOQTable 4 Linear equations,linearity range,r and LOQ of 4 PAHs

圖4 加標(biāo)樣品經(jīng)過(guò)凈化柱后的色譜圖Fig.4 Chromatograms of spiked samplesunder different clean-up condition注:A:Al2O3柱;B:Florisil柱;C:BAP-3;1:BaA;2:CHR;3:雜質(zhì)峰;4:BbF;5:BaP。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 BaA與CHR結(jié)構(gòu)相近,互為同分異構(gòu)體,分離較為困難。本實(shí)驗(yàn)比較了Waters XBridge C18(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)、Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Waters PAH C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)三種不同的色譜柱對(duì)目標(biāo)物的分離效果。在Waters XBridge C18和Symmetry C18色譜柱上BAP與CHR完全重合,無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離,而在Waters PAH C18柱上兩種組分可以得到完全分離,分離度為1.81(見(jiàn)圖5)。因此本實(shí)驗(yàn)采用了Waters PAH C18色譜柱進(jìn)行分離分析。

圖5 4種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.5 The HPLC chromatogram of four standards of PAHs注:1:BaA;2:CHR;3:BbF;4:BaP。圖6同。

2.2.2 流動(dòng)相與流速的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水和乙腈-水分別作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)目標(biāo)物的色譜保留行為的影響。當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)峰形展寬,出峰時(shí)間較晚,分離度較差;而用乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)峰寬變窄,峰形變好,出峰時(shí)間適中,這主要?dú)w因于反相色譜中乙腈的洗脫能力大于甲醇的洗脫能力。當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí),BAP的出峰時(shí)間在25 min之后,出峰時(shí)間較晚;當(dāng)流速為2.0 mL/min時(shí),柱壓升高,影響色譜柱的使用壽命,綜合考慮選擇1.5 mL/min的流速為本次實(shí)驗(yàn)的最終流速。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系與檢出限 將濃度分別為0.5、1.0、4.0、20.0、40.0 μg/L的PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)工作液注入液相色譜儀,按儀器設(shè)定的條件進(jìn)行測(cè)定,以各物質(zhì)的峰面積(y,微伏*秒)為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)(r)(見(jiàn)表4)。以10倍基線噪音確定方法的定量限(LOQ),方法的LOQ為0.3～0.5 μg/kg?？瞻资砥瑯悠泛图訕?biāo)樣品(1 μg/kg)譜圖見(jiàn)圖6。

表5 4種PAHs的回收率和精密度(n=6)Table 5 Recovery and relative standard deviation of 4 PAHs(n=6)

表6 本方法與GB 5009.265-2016在實(shí)際樣品檢測(cè)中獲得4 種PAHs結(jié)果的比較(n=6)Table 6 Comparison of results of 4 PAHs obtained by GB 5009.265-2016 and the method in this paper in actual sample

圖6 空白樣品(A)和加標(biāo)樣品(B)的4種PAHs色譜圖Fig.6 Chromatograms showing the blank sample(A)and spiked sample(B)for four kinds of PAHs

2.3.2 回收率與精密度 向空白樣品中分別進(jìn)行低(1 μg/kg)、中(5 μg/kg)、高(25 μg/kg)三水平的加標(biāo),每種加標(biāo)樣品平行測(cè)定6份,考察方法的回收率與精密度。方法的平均回收率在90.3%～107.4%之間,精密度在6.5%以下,符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗(yàn)》中檢驗(yàn)方法確認(rèn)對(duì)回收率和精密度的要求,具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

2.4 方法對(duì)比

將樣品按優(yōu)化好的方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.265-2016高效液相色譜法測(cè)定PAHs的結(jié)果比較,如表6所示。GB 5009.265-2016高效液相色譜法對(duì)油脂含量較高的食品采用乙腈提取目標(biāo)物,正己烷除脂后旋蒸濃縮,再過(guò)弗羅里硅土柱凈化,樣品處理復(fù)雜,效率低,不適用于大批量樣品的處理。本方法前處理步驟簡(jiǎn)單,重現(xiàn)性好,適合BaA、CHR、BbF和BaP的檢測(cè)。

2.5 實(shí)際樣品分析

按照實(shí)驗(yàn)選擇的最優(yōu)條件對(duì)濟(jì)南市各大超市采購(gòu)的25批次油炸型膨化食品進(jìn)行分析,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7。實(shí)際樣品中檢出的BaP的最高含量為3.1 μg/kg,4種PAHs含量之和最高為4.2 μg/kg。參照我國(guó)和歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn),膨化食品中的4種PAHs的含量均滿足限量要求。

表7 膨化食品中4種PAHs的含量Table 7 The test results of fourkinds of PAHs in expanded foods

注：ND:未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-熒光法測(cè)定油炸型膨化食品中4種多環(huán)芳烴的分析方法。通過(guò)提取條件和凈化條件的優(yōu)化,有效地去除了基質(zhì)干擾。通過(guò)色譜條件的優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了4種PAHs的基線分離,且方法的回收率和精密度均滿足GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗(yàn)》中檢驗(yàn)方法確認(rèn)要求。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高、精密度好,可應(yīng)用于油炸型膨化食品中多環(huán)芳烴的日常分析檢測(cè)。