自然發(fā)酵泡菜中高體外抗氧化活性乳酸菌的篩選及其對模擬胃腸道環(huán)境的耐受性

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(1.徐州工程學院食品(生物)工程學院,江蘇徐州 221018;2.徐州工程學院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室,江蘇徐州 221018;3.山東省棗莊市市中區(qū)環(huán)保局環(huán)境監(jiān)測站,山東棗莊 277100)

乳酸菌是發(fā)酵類食品中最為常見的微生物之一,在發(fā)酵食品的品質(zhì)形成中具有重要作用。此外,其越來越多的生理功能和特性也逐漸被學者們發(fā)現(xiàn),抗氧化特性就是其中一種。乳酸菌在體外具有類似抗氧化劑的活性,可調(diào)節(jié)機體胃腸道、降低血清膽固醇、抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長繁殖和腐敗產(chǎn)物的產(chǎn)生等功效[1]。乳酸菌發(fā)酵對食品抗氧化能力的具有提升和改善作用,經(jīng)乳脂亞種腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroidessubsp.cremoris),詹氏乳酸桿菌(Lactobacillusjensenii)ATCC25258和嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)ATCC 4356發(fā)酵后,發(fā)酵蔬菜制品的自由基清除能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力得到了明顯的提高[2]。

現(xiàn)有抗氧化特性的乳酸菌主要分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品、宿主胃腸道系統(tǒng)和自然環(huán)境等,具有十分復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)的菌相組成[3]。利用體外氧化脅迫耐受(過氧化氫、超氧陰離子等)、脂質(zhì)過氧化抑制、自由基清除、螯合金屬離子、抗氧化酶活力等方法可以評價乳酸菌的抗氧化活性[4-5]。經(jīng)過分離篩選得到的乳酸菌加入到傳統(tǒng)發(fā)酵食品中,不僅可以得到抗氧化特性更高的食品,還可以提升發(fā)酵食品的優(yōu)良風味[6]。

中國傳統(tǒng)泡菜中含有大量的乳酸菌,四川、新疆等地的泡菜中均具有較高體外抗氧化活性的乳酸菌[7],然而高抗氧化活性的乳酸菌雖然重要,但如果該類型的菌種能夠通過腸胃消化系統(tǒng),定植在人體的腸道中并持續(xù)發(fā)揮其抗氧化作用,才能真正的實現(xiàn)益生功效。因此,本研究以自然發(fā)酵泡菜為原料,篩選具有抗氧化活性及還原活性和亞鐵離子螯合能力的菌株,并對其在胃腸模擬消化環(huán)境中的表現(xiàn)進行初步探索,以期為抗氧化乳酸菌的腸道定植研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為后續(xù)開發(fā)功能性微生態(tài)制劑及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白菜、蘿卜、細蔥、蝦醬、魚露、等腌制泡菜所用的原輔料 徐州大潤發(fā)超市;MRS肉湯培養(yǎng)基和革蘭氏染色試劑盒 北京陸橋技術(shù)有限公司;細菌DNA提取試劑盒、Premix taq聚合酶 大連寶生物工程有限公司;實驗所用的化學試劑 均為國產(chǎn)分析純。

醇美系列腌泡箱 美國Tupperware Brands公司;Mastercycler pro PCR儀、5810 R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Experion電泳儀、Molecular Imager? Gel DocTMXR+System凝膠成像系統(tǒng) 美國BioRad公司;400 P拍擊式均質(zhì)器 法國Interscience公司;Synergy 2多功能酶標儀 美國BioTek公司;Bioruptor?UCD200超聲波破碎儀 美國Diagenode公司;2.5 L、7 L密封培養(yǎng)罐、厭氧產(chǎn)氣袋 日本三菱公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 泡菜的發(fā)酵 選取綠葉白菜均分4瓣,每層葉片涂鹽后放入密封箱壓實6 h,控凈水分;將白糖、辣椒面、蝦醬和魚露汁按照質(zhì)量以2∶5∶40∶20比例混勻,取蘿卜、蘋果和鴨梨(5∶1∶1,質(zhì)量比)洗凈切絲混勻;姜和蒜適量去皮切碎,韭菜和細蔥分別切成段;上述調(diào)料混合拌勻后加入食鹽(2%,質(zhì)量比);均勻鋪在每層白菜葉片,放入潔凈無油的醇美腌泡箱,用手輕輕壓緊,封蓋,25 ℃發(fā)酵7 d,每日定時排氣約1 min。

1.2.2 抗氧化活性乳酸菌初篩 在超凈臺內(nèi)稱取25 g泡菜(含湯料,按照發(fā)酵成品的菜湯質(zhì)量比)于無菌均質(zhì)菌袋中,加入1 mol/L,pH7.4的磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)100 mL置于均質(zhì)儀拍打15 min;PBS稀釋均質(zhì)液至10-1～10-6倍。將稀釋液涂布于含1 mmol/L的終濃度的過氧化氫(H2O2)的MRS固體平板中,放入MGC密封培養(yǎng)罐,37 ℃厭氧條件培養(yǎng)48 h。挑取單菌落進行過氧化氫酶和革蘭氏染色實驗,革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性的菌落選為初篩菌株。單菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基,統(tǒng)計可生長的菌落,并作為初篩菌株在已滅菌的MRS甘油保存液中-80 ℃保存。

1.2.3 抗氧化活性乳酸菌菌株復(fù)篩

1.2.3.1 菌株細胞懸液和無細胞提取物的制備 參考Lin等[8]的方法,并稍作改進。制備乳酸菌的完整細胞懸液(intactcells,IC):將初篩菌株二次傳代培養(yǎng)活化,以1%接種量(v/v)接種于MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃溫度下培養(yǎng)16～18 h,1 mL菌液4 ℃,6000 r/min離心10 min,收集菌體細胞沉淀,用pH7.4的PBS緩沖液洗滌沉淀兩次后重懸,調(diào)細胞終濃度為109CFU/mL。

獲得的IC用超聲波破碎儀破碎細胞,280 W,30 s/30 s,10 min冰浴破碎處理。顯微鏡觀察確定破碎完全后,4 ℃ 8000 r/min離心10 min,收集上清液,即為乳酸菌無細胞提取物(intracellular cell-free extracts,CFE)。

1.2.3.2 DPPH·自由基清除能力的測定 參照文獻Lin等人[8]的方法對菌株清除DPPH·自由基能力進行測定。分別取800 μL菌株IC、CFE樣品與1 mL的新配制DPPH溶液(0.2 mmol/L無水乙醇)于2 mL棕色離心管中混合均勻,室溫避光反應(yīng)30 min后,6000 r/min離心10 min,取上清檢測517 nm處的吸光度平行測3次。清除清除能力的測定公式(1)如下:

DPPH自由基清除能力(%)=(1-(A517(sample))/(A517(blank))×100

式(1)

式中:A517(sample)表示樣品的吸光度值,A517(blank)表示空白的吸光度值。

1.2.3.3 羥自由基(HO·)清除能力的測定 參考Jeong等[9]的方法,略微的修改。100 μL 5 mmol/L的硫酸亞鐵,500 μL去離子水,100 μL水楊酸鈉(5 mmol/L無水乙醇)和200 μL菌株的IC、CFE,最后加入100 μL的H2O2(3 mmol/L)制成1 mL反應(yīng)混合物。37 ℃孵育15 min,510 nm處檢測吸光度。數(shù)據(jù)測3次平行。羥自由基清除能力計算為如下(2):

羥自由基清除能力(%)=(As-Ac)/(Ab-Ac)×100

式(2)

式中:As代表樣品的吸光度,Ac表示用去離子水代替樣品反應(yīng)體系僅含有水楊酸鈉、硫酸銅和過氧化氫的對照組的吸光度,Ab表示空白溶液的吸光度。

1.2.3.4 還原活性的測定 參照徐爽等[10]的方法,略有修改。各取0.5 mL制備的不同乳酸菌IC、CFE,0.5 mL各濃度的L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液(標準溶液),0.5 mL去離子水(空白)為三組不同反應(yīng)體系,分別向其中加入0.5 mL PBS(0.02 mol/L)和0.5 mL鐵氰化鉀溶液(1% m/v)。上述三組反應(yīng)體系同時置于50 ℃金屬水浴鍋中水浴20 min后迅速冷卻至室溫,加入0.5 mL三氯乙酸(TCA,10%),3000 r/min離心5 min,取1.5 mL上清液,加入0.2 mL三氯化鐵(0.1%),震蕩混勻,室溫孵育10 min后在波長700 nm測定反應(yīng)體系的吸光值。L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液測定標準曲線為Y=683.92X+88.31,R2=0.9981,測定范圍50～300 μmol/L。

1.2.3.5 螯合亞鐵離子的測定 參考徐爽等[10]的方法,略微修改:0.5 mL乳酸菌無細胞提取物、0.1 mL抗壞血酸(0.1 g/L)、0.1 mL硫酸亞鐵溶液(0.04 g/L)和1 mL的NaOH(0.2 mol/L),混合均勻,加入0.2 mL的TCA(10%),37 ℃水浴20 min。3000 r/min離心10 min,上清加0.5 mL鄰菲羅啉(1 g/L)反應(yīng)10 min,測量波長在510 nm的吸光度。

1.2.4 環(huán)境耐受性實驗

1.2.4.1 酸耐受性 參考黃燕燕等[11]人的方法,略微修改:將上述篩選所得具有較強自由基清除能力的乳酸菌菌株二次活化,5%接種到含酸化至pH3.5的MRS肉湯培養(yǎng)基和非酸化MRS肉湯培養(yǎng)基的96孔細菌培養(yǎng)板中,置于37 ℃下厭氧培養(yǎng)3 h。采用酶標儀(BioTek/USA)測定兩組96孔板中細菌生長的情況(OD600 nm)。按照公式(3)計算菌株耐酸性:

耐酸性(%)=OD600 nm(pH3.5)/OD600 nm(pH6.8)×100

式(3)

1.2.4.2 膽鹽耐受性 參考黃燕燕等[11]人的方法,二次活化菌株5%接種于含0.3%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h,無膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基為對照組。涂布于平板,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。按公式(4)計算菌株的膽鹽耐受性:

膽鹽耐受性(%)=VS/Vb×100

式(4)

式中:VS、Vb分別代表測試樣品和對照樣品中的活菌數(shù)(CFU/mL)。

1.2.4.3 人工胃液和腸液耐受性 取二次活化菌液2 mL,12000 r/min離心2 min,收集菌體,加入2 mL的無菌生理鹽水重懸,1%接種于人工模擬胃、腸液和無菌生理鹽水中,37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)4 h。各取20 μL含菌處理液接種到200 μL的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃下180 r/min培養(yǎng)8 h,測600 nm處吸光值,按照公式(5)計算存活率,以保加利亞乳桿菌存活率為對照。

存活率(%)=(B/A)×100

式(5)

式中:A、B分別代表生理鹽水吸光度值和各處理液吸光度值。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析 提取菌株DNA,采用PCR用細菌通用引物(27F,1492R):27F:5′-AGA GTT TGA TCG TGG CTC AG-3′和1492R:3′-GCT TAC CTT GTT ACG ACT T-5′擴增16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系為:Premix Ex Taq加入10 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O 8 μL,DNA模板1 μL,總體積20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性 30 s,58 ℃引物退火30 s,72 ℃延伸2 min,并冷卻至4 ℃保存。擴增產(chǎn)物純化后送至上海生工進行序列測序,將獲得的序列利用BLAST在National Center for Biotechnology Information(NCBI)服務(wù)器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blastn)上進行相似序列的比對。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品設(shè)置三個重復(fù),數(shù)據(jù)用平均值±標準差的形式表示。實驗數(shù)據(jù)處理和圖表制作采用Excel 2013軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性乳酸菌初篩

H2O2是機體中形成的初始的極性活性氧分子,具有良好的擴散性和持續(xù)的作用時間。由于具有良好的體外穩(wěn)定型,且大量研究表明體外耐受H2O2的乳酸菌也具有潛在的抗氧化能力[12]。為了提高抗氧化活性的菌種的篩選效率,從數(shù)量較大的菌株中篩選具有抗氧化性的乳酸菌,本研究以1 mmol/L H2O2為篩選指標,選取在固體平板上可生長的菌落,且為革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性,初步確定75株為具有抗氧化活性的菌株。

2.2 抗氧化活性乳酸菌復(fù)篩

首先采用DPPH自由基清除率作為篩選指標進行菌株復(fù)篩,對篩選得到的高DPPH·自由基清除能力菌株進行羥自由基清除能力、還原能力和螯合亞鐵離子(Fe2+)能力分別進行測定,從而確定各項抗氧化能力均較為突出的菌株。

2.2.1 高DPPH自由基清除能力菌株復(fù)篩 利用DPPH自由基清除能力作為菌株抗氧化活性篩查,更為簡單、快捷、靈敏且重復(fù)性好,是評估抗氧化能力的方法最廣泛被使用的。乳酸菌菌株的DPPH自由基清除率(包括DPPH-IC和DPPH-CFE)>30%被認為高DPPH活性乳酸菌[13]。因此,為了優(yōu)化抗氧化能力乳酸菌的篩選流程,本研究初篩得到的75株乳酸菌菌株IC的DPPH自由基的清除率(DPPH-IC值)。測定的數(shù)據(jù)進行了排序處理發(fā)現(xiàn):75株乳酸菌菌株的DPPH-IC值范圍為2.57%～59.64%之間,在這些菌株中,其中有5株(6.7%)的DPPH-IC自由基清除率超過50%,9株(12%)的DPPH-IC的值在30%～50%,其余61株(81.3%)的DPPH-IC值低于30%。對14株DPPH-IC>30%的菌株進行DPPH-CFE值檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),DPPH-CFE值則在10.09%～52.33%的范圍內(nèi),其中有1株(7.1%)的DPPH-CFE自由基清除率超過50%,3株(21.4%)的DPPH-CFE的值在30%～50%,詳情見表1。

本研究中多數(shù)菌株的DPPH-IC值明顯高于DPPH-CFE值,這與新疆和四川等地的泡菜中分離得到的抗氧化活性乳酸菌的結(jié)果保持一致[7]。自制泡菜中乳酸菌的DPPH自由基清除能力整體上較地方傳統(tǒng)泡菜中的低,徐爽等從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選得到29株乳酸菌株的DPPH-IC在30%以上[10],但與發(fā)酵乳清粉中分離得到的乳酸菌菌株的DPPH自由基清除能力相似[14]。此外,不同種類的乳酸菌其DPPH自由基清除率得到結(jié)果也不完全相同,DPPH-IC的范圍為43.2%(長雙歧桿菌Bifidobacteriumlongum)到52.1%(嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus),以及DPPH-CFE的范圍為20.8%(B.longum)到41.6%(L.acidophilus)[8]。

表1 初篩得到的14株乳酸菌的菌株信息和DPPH-IC、DPPH-CFE值(IC>30%)Table 1 The information and DPPH-IC,DPPH-CFE value of isolated lactic acid bacteria(IC>30%)

表2 4株乳酸菌菌株的抗氧化能力Table 2 Antioxidant capacities of 4 LAB strains

2.2.2 乳酸菌分離株羥自由基清除能力的測定 羥基自由基被認為是最具有反應(yīng)活性氧自由基,它可以作用于活細胞中誘導所有生物大分子發(fā)生反應(yīng)而嚴重損壞細胞,但乳酸菌會在自由基與機體內(nèi)的發(fā)分子發(fā)生鏈式反應(yīng),提前終止自由基的生成[15-16]。本實驗測定了被認為高DPPH活性乳酸菌(DPPH-IC和DPPH-CFE>30%)的IC和CFE對羥自由基的清除能力。如表2所示,4株高DPPH活性乳酸菌菌株所測定的OH自由基清除率,其IC測定結(jié)果的范圍為42.58%～80.01%,CFE測定結(jié)果的范圍為58.66%～89.97%,一般來說,菌株的OH-CFE值高于OH-IC值。在本實驗中測定的4株乳酸菌菌株中,Kc13比其他菌株表現(xiàn)出更高的OH-CFE值和OH-IC值,分別是80.01%和89.97%。

其他乳酸菌同樣被報道具有顯著的清除羥基自由基的能力,且IC和CFE之間的清除能力各有不同。從傳統(tǒng)發(fā)酵奶中篩選的干酪乳桿菌LactobacilluscaseiSY13 的OH-CFE值為31.19%,德氏乳桿菌LactobacillusdelbrueckiiLJJ的OH-CFE值為10.01%[17]。Ren等[18]測定了9株乳桿菌的無細胞懸液的羥基自由基的清除率的范圍在10.37%～94.26%之間,其中菌株CGMCC 1.557 的OH-IC值最高為94.26%,其次是菌株CICC 23174的OH-IC值為73.19%。

在評估乳酸菌菌株對自由基的清除能力包括DPPH自由基和羥基自由基的測定體外實驗中,這些表現(xiàn)顯著的自由基清除能力的乳酸菌被認為可以下降體外活性氧積累的風險[10]。在本實驗中,菌株Kc 1、Kc 6、Kc 8和Kc 13表現(xiàn)出顯著的DPPH自由基清除能力和顯著的清除羥基自由基的能力,表明這些菌株可以降低體外活性氧積累的風險。

2.2.3 乳酸菌分離株還原能力的測定 有機化合物的還原活性與抗氧化性之間存在著一定的相關(guān)性,其還原能力的測定可以作為一個重要的指標用來評價其潛在的抗氧化能力降低功率的化合物[19]。如表2所示,4株乳酸菌菌株所測定的還原能力(reducing activity,RA),其IC測定結(jié)果的范圍為65.74～214.52 μmol/L cysteine,而CFE測定結(jié)果的范圍為14.73～66.34 μmol/L cysteine。在這4株乳酸菌菌株中,Kc 13(RA-IC值和RA-CFE值分別是214.52、66.34 μmol/L cysteine),相比其他菌株表現(xiàn)出更高的還原能力,與內(nèi)蒙古自然泡菜中分離得到乳酸菌結(jié)果類似[20]。一般來說,菌株的RA-CFE值高于RA-IC值,而這些還原能力較高的菌種也被證明具保護細胞免受氧化損傷的作用[21]。

2.2.4 乳酸菌分離株螯合亞鐵離子(Fe2+)能力的測定 過渡金屬離子如Fe2+可以催化活性氧的產(chǎn)生,例如,羥自由基和超氧自由基,這些活性氧又會氧化的不飽和脂肪酸[22]。在很多金屬離子都可以催化氧化反應(yīng)造成機體氧化損傷,其中鐵是最豐富并且是最容易與活性氧發(fā)生反應(yīng),如過氧化氫或超氧陰離子離子與鐵離子發(fā)生芬頓反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基[23]。因此,本研究測定了4株乳酸菌菌株的無細胞提取物的螯合亞鐵離子的能力的測定結(jié)果在8.97～47.31 mg/L范圍之間。其中Kc 6菌株表現(xiàn)出顯著的螯合亞鐵離子能力,達47.31 mg/L。Lin 等[8]測定19株乳酸菌的無細胞提取物的亞鐵離子的金屬螯合能力,發(fā)現(xiàn)2株長雙歧桿菌B.longumB6和B.longum15708對亞鐵離子螯合量分別為40.7、26.6 mg/L。Lee 等[7]測定了3株短乳酸桿菌對亞鐵離子的螯合能力,其范圍為1.22～13.6 mg/L。Su等[19]測定了19株酒球菌的亞鐵離子螯合能力,其中最高的螯合量為34.66 mg/L。本研究中部分菌株表現(xiàn)出顯著的亞鐵離子的螯合能力,這可能是乳酸菌的螯合能力與其細胞無細胞提取物中生理螯合劑有關(guān),如乙二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸、青霉胺和去鐵胺,這些物質(zhì)可以捕獲金屬離子,防止氧化反應(yīng)[24-25]。

2.3 環(huán)境耐受性實驗

2.3.1 酸和膽鹽耐受性 選取上述2株表現(xiàn)出顯著的螯合亞鐵離子能力的菌株(Kc 6和Kc 13)進行環(huán)境耐受性實驗,在pH3.5的酸溶液中,Kc 6和Kc 13均可生長,存活率達到71%和89%(見圖1)。人進食后胃液的pH在3.0～3.5左右,而益生菌理應(yīng)具有較高的耐酸性才能隨食物通過胃并到達小腸,Kc 6和Kc 13具有較高的耐酸性。

在無膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基中,具有酸耐受性的2株菌株的生長狀況良好,菌體濃度可達1.45×108CFU/mL。乳酸菌要到達并定植于腸道,必須對膽鹽有一定的耐受性,否則膽鹽在細胞外產(chǎn)生高滲透壓,對菌體細胞造成影響[11]。0.3%膽鹽溶液培養(yǎng)3 h后,2株菌株的菌體濃度依然可維持在60%(菌體濃度在107CFU/mL以上),高于菌體發(fā)揮功能特性的活菌數(shù)臨界值[26]。由此表明,此2株菌株理論上可耐受消化道的高膽鹽環(huán)境,順利通過小腸到達大腸,用于進行下步實驗。

2.3.2 人工模擬胃液和腸液耐受性 人體胃蛋白酶在酸性環(huán)境中被激活,會殺死進入胃中的細菌[27]。人工胃液耐受性結(jié)果表明,Kc 6和Kc 13存活率分別為73%和61%;在人工模擬腸液中,Kc 6和Kc 13存活率分別為96%和82%(見圖1)。由此可見,Kc 6和Kc 13可耐受人工胃腸液,理論上可定植于腸道,發(fā)揮抗氧化等益生功效。

圖1 Kc 6和Kc 13的環(huán)境耐受性Fig.1 The environmental tolerance of Kc 6 and Kc13

2.4 菌株鑒定

經(jīng)16S rRNA測序及BLAST比對,2株待測菌株的均隸屬于植物乳桿菌Lactobacillusplantarum,相似度達99%。植物乳桿菌在自制發(fā)酵果蔬、中國傳統(tǒng)泡菜和韓式泡菜中均被檢測到做為功能性乳酸菌的存在[7,28]。

3 結(jié)論

本研究從自然發(fā)酵泡菜中經(jīng)過氧化氫初篩,DPPH自由基清除活性復(fù)篩,羥自由基清除能力、還原活性和二價鐵螯合能力的終篩,得到了4株抗氧化能力較高的菌株;經(jīng)胃腸模擬環(huán)境耐受性的檢測,最終篩選得到2株理論上可通過胃腸環(huán)境定植于腸道的植物乳桿菌(L.plantarum)。本研究對可定植胃腸環(huán)境的功能乳酸菌資源開發(fā)提供了參考和理論數(shù)據(jù),以期提高乳酸菌類產(chǎn)品的市場競爭力。