紅景天苷對急性胰腺炎大鼠胰腺損傷的影響及其機制

趙琳，陳莎燕，蔡旺，張愛民，常艷敏

(天津市南開醫(yī)院，天津300010)

急性胰腺炎(AP)是一種由于胰酶在胰腺內(nèi)被激活而引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應(yīng)性疾病。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β1是啟動胰腺損傷修復(fù)的重要細胞因子[1]，但大量的TGF-β1將導(dǎo)致胰腺組織纖維化[2]。研究證實，TGF-β1必須與其特定細胞膜受體TGF-β1Ⅱ型受體(TβRⅡ)和TGF-β1Ⅰ型受體(TβRⅠ)結(jié)合，形成TβRⅡ-TGFβ1-TβRⅠ三聚體復(fù)合物，進一步激活位于胞質(zhì)的Smads。Smads進入細胞核內(nèi)與靶基因上特異性反應(yīng)元件結(jié)合，啟動相應(yīng)靶基因如Ⅰ型膠原(ColⅠ)的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮組織修復(fù)功能[3]。傳統(tǒng)中藥紅景天有益氣活血、通脈平喘、清熱解毒等作用，在臨床多用于心腦血管疾病的輔助治療[4]。紅景天苷是紅景天的主要活性成分，已有研究證實，紅景天苷能改善大鼠AP早期胰腺微循環(huán)、降低胰酶水平、清除炎癥因子[5]，但其作用機制有待進一步闡明。2018年9月～2019年3月,本研究制作了AP大鼠模型，觀察紅景天苷對胰腺損傷的影響并從TGF-β1/Smad3信號通路角度探討作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 SPF級雄性Wistar大鼠144只，體質(zhì)量(220±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。?；悄懰徕c購自美國Sigma公司。紅景天苷購自上海麥克林生物科技公司。ColⅠ ELISA檢測試劑盒購自美國Uscnlife公司?？俁NA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time Master Mix購自北京Tiangen公司，待測基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量PCR檢測系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 動物分組、模型制作、給藥及標本獲取 144只大鼠隨機分為對照組、模型組、治療組，每組48只。模型組和治療組大鼠采用膽胰管逆行注射2.0%?；悄懰徕c建立AP模型：術(shù)前禁食、不禁水12 h，麻醉、腹部剪毛備皮，于腹壁正中作長約2 cm切口；入腹后沿幽門找到十二指腸，尋找膽胰管在十二指腸開口(乳頭處)，用5號針頭穿刺胰膽管開口對側(cè)十二指腸壁后，持靜脈留置針導(dǎo)管逆行插入膽胰管內(nèi)1.0 cm，接勻速注射器，以0.15 mL/min速度注射2.0%?；悄懰徕c(0.1 mL/100 g)，在此期間用無損傷小血管夾夾閉胰膽管近肝端暫時阻斷膽汁流出；觀察胰腺水腫、充血等改變，然后去血管夾、拔管；無損傷線縫扎十二指腸穿刺口的漿肌層，十二指腸復(fù)位，縫合切口，關(guān)腹。對照組開腹、置管操作同上，改為注入生理鹽水。治療組造模后即刻經(jīng)腹腔注射紅景天苷4.0 mg/kg、2次/d，模型組和對照組分別靜脈注射等量生理鹽水。每組分別于造模后6、12、24、48、72、96 h各取8只大鼠，消毒麻醉后打開腹腔，經(jīng)腹主動脈取血，1 000 g離心15 min，留取血清，-80 ℃保存；切取造模后6 h胰腺組織行HE染色，其余于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清淀粉酶水平檢測 采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清淀粉酶水平。

1.4 胰腺組織病理學(xué)觀察 各組胰腺組織用4.0%甲醛固定，石蠟包埋，3 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜組織病理改變，并根據(jù)Spormann標準[7]進行組織病理學(xué)評分。

1.5 胰腺組織中ColⅠ檢測 取各組凍存胰腺組織100 mg，加入裂解液1 mL，勻漿后采用ELISA法按試劑盒說明檢測ColⅠ。

1.6 胰腺組織中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA檢測 取各組胰腺組織80 mg加入1 mL TRIzol勻漿，按試劑盒說明提取總RNA。經(jīng)純度鑒定和濃度測定后，取1.0 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄。取1.0 μL的cDNA進行PCR反應(yīng)。TGF-β1mRNA上游引物序列為5′-CTCAACACCTGCACAGCTCC-3′，下游引物序列為5′-AGTTGGCATGGTAGCCCTTG-3′；TβRⅡ mRNA上游引物序列為5′-CCCTACTCTGTCTGTGGATGA-3′，下游引物序列為5′-GACGTCATTTCCCAGAGTAC-3′；Smad3 mRNA上游引物序列為5′-AGCGAGTTGGGGAGACAT-3′，下游引物序列為5′-AGTTGGGAGACTGGACGA-3′；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5′-TTGTATAACCAACTGGGACGATATGG-3′，下游引物序列為5′-GACTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組血清淀粉酶水平比較 模型組造模后12 h淀粉酶水平到達最高值，各時點淀粉酶水平均高于對照組(P均<0.05)。治療組造模后6、12、24、48 h高于對照組，造模后各時點淀粉酶水平均低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠造模后不同時點血清淀粉酶水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05，與模型組比較，▲P<0.05。

2.2 各組胰腺組織病理學(xué)評分比較 造模后6 h，模型組大鼠胰腺組織可見明顯間質(zhì)水腫、炎細胞浸潤、腺泡細胞壞死，治療組組織病理改變較模型組減輕。見圖1。治療組、模型組、對照組組織病理學(xué)評分分別為(8.1±2.8)、(12.7±2.4)、(1.4±0.2)分，治療組和模型組高于對照組，治療組低于模型組(P均<0.05)。

圖1 三組大鼠造模后6 h胰腺組織病理情況(HE染色，200×)

2.3 各組胰腺組織中ColⅠ含量比較 模型組ColⅠ含量于造模后12 h升高，24 h一過性下降，在48 h再次升高，至96 h仍保持升高狀態(tài)，造模后各時點胰腺組織中ColⅠ含量均高于對照組(P均<0.05)。治療組造模后6、12、24、48、72 h ColⅠ含量高于對照組，造模后12、48、72、96 h ColⅠ含量低于模型組(P均<0.05)。見表2。

2.4 各組胰腺組織中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表達比較 模型組胰腺組織中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表達于造模后12 h升高，24 h下降，48 h再次升高并保持高水平，造模后12、24、48、72、96 h TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。治療組造模后12、24、48、72 h胰腺組織中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA相對表達量高于對照組，造模后12、48、72、96 h TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA相對表達量低于模型組(P均<0.05)。詳見表3。

表2 三組大鼠造模后不同時點胰腺組織中ColⅠ含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，▲P<0.05。

3 討論

AP后胰腺修復(fù)機制尚不清楚，大多數(shù)學(xué)者認為胰腺損傷和修復(fù)同時存在。在各種致病因素導(dǎo)致胰腺損傷時，腺泡細胞、炎癥細胞、胰腺星狀細胞等分泌TGF-β1、血小板來源生長因子BB(PDGF-BB)、TNF-α、和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)等細胞因子，激活TGF-β1/Smad3、MAPK信號通路，上調(diào)ColⅠ、Ⅲ型膠原、纖連蛋白等基因表達，促進細胞外基質(zhì)的合成和分泌，參與胰腺損傷的修復(fù)。但如果持續(xù)分泌大量的細胞因子，將導(dǎo)致胰腺纖維化[8～10]。

TGF-β1/Smad3信號通路在啟動胰腺修復(fù)損傷、胰腺纖維化過程中起重要作用[11]。在AP早期，TGF-β1/Smad3信號通路即被激活，合成細胞外基質(zhì)，參與胰腺損傷的修復(fù)；如果損傷因素持續(xù)存在，TGF-β1/Smad3信號通路就會持續(xù)處于激活狀態(tài)，此時胰腺損傷與修復(fù)并存。本研究觀察到AP模型組大鼠胰腺組織TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表達有兩次升高，一次在造模后12 h短暫升高即下降，另一次是在造模后48 h并保持高水平狀態(tài)。這種變化趨勢與胰腺組織中ColⅠ含量變化趨勢一致，而不同于血清淀粉酶水平的變化趨勢，提示激活TGF-β1/Smad3信號通路，促進膠原蛋白等細胞外基質(zhì)合成，有助于胰腺組織損傷修復(fù)，從而減少了腺泡細胞的持續(xù)破壞。但本研究尚不能解釋TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表達有兩次升高這一現(xiàn)象。

表3 三組大鼠造模后不同時點胰腺組織中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表達比較

注：與同時點對照組比較，*P<0.05，與同時點模型組比較，▲P<0.05。

紅景天為景天屬植物，屬藥食同源，在臨床應(yīng)用上有著悠久的歷史?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中將紅景天列為上品：“治大熱，火瘡，身熱煩，邪惡氣”[12]。紅景天苷是紅景天的主要活性成分，近年研究證實紅景天藥理作用廣泛，有抗炎、抗腫瘤、減輕心臟損傷和腎臟損傷等功效[13～16]。還有研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能降低低氧性肺動脈高壓大鼠的肺動脈壓及頸動脈壓，下調(diào)肺組織中IL-6、TNF-α等炎癥因子表達，減輕肺組織病理損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在AP模型制備后72 h，紅景天苷治療組大鼠淀粉酶水平已恢復(fù)正常，治療組胰腺組織病理評分和ColⅠ含量低于模型組。這提示紅景天苷能促進胰腺損傷修復(fù)，減輕胰腺腺泡破壞。本研究對紅景天苷的作用機制進行了初步探討，結(jié)果顯示，治療組造模后12、48、72、96 h TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA相對表達量低于模型組，推測紅景天苷的作用與抑制TGF-β1/Smad3信號通路過度激活有關(guān)。目前大多數(shù)研究認為，TGF-β1/Smad3信號通路過度激活除可導(dǎo)致胰腺纖維化，還是導(dǎo)致肝臟、肺臟等器官纖維化的重要原因[18]。紅景天苷可能通過調(diào)控TGF-β1/Smad3信號通路來抑制器官纖維化，但這一作用有待進一步證實。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可減輕AP大鼠胰腺損傷，并有助于損傷修復(fù)，作用機制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號通路持續(xù)激活有關(guān)。