萊菔硫烷對單側輸尿管梗阻所致小鼠腎纖維化的干預作用及其機制

郭莉，龔幼蘭，李晶，任茜，郝捷

(1河北大學附屬醫(yī)院，河北保定071000；2保定市第二醫(yī)院)

慢性腎臟病(CKD)的特征是過量成纖維細胞活化及增殖，隨后腎臟中細胞外基質(ECM)過度積累，改變腎臟結構，導致腎功能障礙并最終引起腎衰竭。許多細胞因子和生長因子可調節(jié)間質纖維化的進展。有證據(jù)表明，轉化生長因子β(TGF-β)是高度有效的纖維化細胞因子[1,2]。TGF-β的下游信號轉導包括細胞質Smad2/3磷酸化、與Smad4的復合物形成及隨后易位至細胞核[3,4]。此外，TGF-β也被認為可誘導上皮-間質轉化(EMT)程序[5]。多項研究表明在腎纖維化中拮抗TGF-β途徑可獲得積極的治療效果[6,7]。植物衍生產品及其活性成分是各種疾病藥理學干預的重要潛在來源[8]。萊菔硫烷是存在于十字花科蔬菜中的硫基異硫氰酸酯化合物。最近人體研究表明，萊菔硫烷有助于降低某些惡性腫瘤、糖尿病的發(fā)病率[9，10]，并可抑制血小板活化以預防動脈血栓形成[11]。既往萊菔硫烷相關研究主要集中在抗癌和抗腫瘤轉移方面。2018年10月～2019年5月，本研究觀察了萊菔硫烷對腎纖維化小鼠模型的抗纖維化作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 雄性瑞士白化小鼠，鼠齡8～10周，體質量25～30 g，飼養(yǎng)于動物護理設施中，室溫(25±2)℃，保持12 h黑暗/光照循環(huán)。給動物食用水和正常顆粒飼料，適應性喂養(yǎng)至少1周。萊菔硫烷(S6317)購自Sigma公司?？辜拥鞍住ⅵ?SMA、膠原蛋白Ⅰ、p-Smad2/3、t-Smad2/3、結締組織生長因子(CTGF)、TGF-β抗體購自Santa Cruz公司。本研究方案獲得動物倫理委員會批準。

1.2 腎纖維化模型制作及分組、給藥方法 將小鼠隨機分為Sham組、Sham+SFN組、UUO組、UUO+SFN組，每組8只。用氯胺酮60 mg/kg、甲苯噻嗪16 mg/kg腹膜內注射麻醉小鼠。UUO組、UUO+SFN組制作腎纖維化模型，進行UUO手術，將左輸尿管與絲線縫合，同時保持右腎不受影響。Sham組、Sham+SFN組進行手術但不結扎輸尿管。手術后第2天UUO+SFN組、Sham+SFN組腹膜內注射萊菔硫烷25 mg/(kg·d)，Sham組、UUO組分別給予同等劑量的生理鹽水，持續(xù)給藥至第14天[12]。實驗第14天心臟穿刺取血并分離血清。

1.3 血肌酐、BUN檢測 根據(jù)試劑盒說明書檢測小鼠血肌酐和BUN，在M5酶標儀上讀取數(shù)據(jù)。

1.4 腎臟質量及腎臟指數(shù)測算 于實驗第14天用頸椎脫臼法處死小鼠并收集腎組織，PBS洗滌，去除腎周脂肪后稱重。將腎臟組織-80 ℃儲存，將一小塊腎臟組織保持在4%中性甲醛中固定過夜。分級脫水后將組織包埋在石蠟中，切成5 μm的切片，并用HE染色。根據(jù)腎臟纖維化損傷近端小管的分級量表(0～4級)進行組織病理學評估[13]。

1.5 腎損傷及腎纖維化程度觀察 使用切片機切取5 μm厚的腎標本切片，隨后進行HE染色，并進行損傷評分[13,14]，從0(無傷害)到3(嚴重傷害)劃分等級。Masson三色染色法測算腎間質纖維化面積。采用PSR染色評價間質膠原沉積情況，IHC染色聯(lián)合Image J軟件觀察并分析膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白表達。

1.6 腎組織中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF檢測 采用Western blotting法檢測，使用Image J軟件對顯影的印跡進行光密度定量，用肌動蛋白標準化后表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組血肌酐、BUN水平比較 UUO組小鼠血肌酐、BUN水平高于Sham組，UUO+SFN組血肌酐、BUN水平低于UUO組(P均<0.01)。見表1。

表1 各組血肌酐、BUN水平比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與UUO組相比，#P<0.01。

2.2 各組腎臟質量、腎臟指數(shù)比較 UUO組腎臟質量和腎臟指數(shù)低于Sham組，UUO+SFN組腎臟質量和腎臟指數(shù)高于UUO組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腎臟質量和腎臟指數(shù)比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與UUO組相比，#P<0.05。

2.3 各組腎損傷及腎纖維化程度比較 HE染色顯示UUO組小鼠腎小管萎縮，刷狀緣喪失，UUO+SFN組較UUO組上皮細胞空泡化改善。UUO組腎小管損傷評分高于Sham組，UUO+SFN組腎小管損傷評分低于UUO組(P均<0.01)。Masson三色染色顯示，UUO組纖維化面積高于Sham組，UUO+SFN組纖維化面積低于UUO組(P均<0.01)。見圖1、表3。PSR染色顯示UUO組間質膠原沉積顯著，UUO+SFN組膠原沉積明顯減少。UUO組PSR陽性面積、膠原蛋白Ⅰ及纖連蛋白表達高于Sham組，UUO+SFN組PSR陽性面積、膠原蛋白Ⅰ及纖連蛋白表達低于UUO組(P均<0.01)。見圖2、表3。

注：A為HE染色顯微鏡下圖片；B為Masson三色染色顯微鏡下圖片。

圖1各組小鼠腎組織HE染色、Masson三色染色鏡下顯示圖像

圖2 各組小鼠腎小管間質纖維化、膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白表達情況

表3 各組腎小管損傷評分、纖維化面積、PSR陽性面積、膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白表達比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與UUO組相比，#P<0.01。

2.4 各組腎組織中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF表達比較 UUO組TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相對表達量高于Sham組，UUO+SFN組TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相對表達量低于UUO組(P均<0.01)。見圖3、表4。

圖3 各組腎組織中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF表達情況

3 討論

腎纖維化的特征在于ECM的過量產生導致腎功能逐漸受損。雖然纖維化疾病的發(fā)病率呈上升趨勢，但目前仍然沒有藥物有效干預其進展。腎臟中過量基質沉積產生機械拉伸，滲透壓應力，募集炎癥細胞并增強導致腎損傷和纖維化的不同信號級聯(lián)。多項證據(jù)表明，萊菔硫烷是一種抗癌化合物[19, 20]。萊菔硫烷是一種天然存在的異硫氰酸鹽，在某些十字花科蔬菜中含量很高。L-萊菔硫烷是具有生物活性的異構體，而D，L-萊菔硫烷是L-萊菔硫烷的合成外消旋類似物。同時，萊菔硫烷是一種具有細胞保護作用和抗癌特性的抗氧化劑，已被證明可誘導Ⅱ期酶的活性，如血紅素加氧酶1(HO-1)、醌還原酶、谷胱甘肽S-轉移酶和谷胱甘肽還原酶[10]。據(jù)報道，萊菔硫烷還可以通過誘導轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2)依賴性Ⅱ期酶的活化來保護腎臟和大腦免受缺血性損傷[11]。然而，目前對萊菔硫烷的腎臟保護活性及抗腎纖維化活性研究較少。

表4 各組腎組織中TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF表達比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與UUO組相比，#P<0.01。

UUO誘導的腎纖維化動物模型是一種成熟且經過驗證的模型。本研究制作了UUO誘導的腎纖維化小鼠模型，并給予萊菔硫烷治療，結果顯示，UUO組腎臟質量和腎臟指數(shù)低于Sham組，UUO+SFN組腎臟質量和腎臟指數(shù)高于UUO組；UUO組小鼠血肌酐、BUN水平高于Sham組，UUO+SFN組血肌酐、BUN水平低于UUO組。肌酐清除率是反映腎功能的最重要參數(shù)之一，血清BUN水平升高表明腎功能降低。本研究結果表明，使用萊菔硫烷后，腎纖維化小鼠腎功能受損減輕，證實了萊菔硫烷對腎臟的保護作用。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，UUO組腎小管損傷評分、纖維化面積、PSR陽性面積、膠原蛋白Ⅰ及纖連蛋白表達高于Sham組，UUO+SFN組上述指標均低于UUO組，提示萊菔硫烷有助于減輕小鼠腎纖維化和腎小管損傷。

有學者發(fā)現(xiàn)TGF-β在誘導纖維化信號轉導中起著重要作用[1]。此外，TGF-β在腎小管細胞EMT中也起關鍵作用[16]。由于TGF-β廣泛參與多項生理功能，尚未發(fā)現(xiàn)直接抑制TGF-β可以有效治療纖維化。然而，有研究表明，抑制活化的TGF-β信號轉導有益于延緩不同條件下的纖維化[17,18]。本研究試圖從TGF-β信號轉導和EMT方面分析萊菔硫烷的作用機制，實驗結果顯示，UUO組TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相對表達量高于Sham組，UUO+SFN組TGF-β、p-Smad、t-Smad、CTGF相對表達量低于UUO組，提示萊菔硫烷對腎纖維化的干預作用可能與抑制TGF-β通路信號轉導有關。