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    羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖修飾的艾塞那肽固體脂質(zhì)納米粒的制備及轉(zhuǎn)運能力評價

    2019-11-28 02:32:40董晶劍沈斌肖艷萍曹青日施麗麗
    山東醫(yī)藥 2019年32期
    關(guān)鍵詞:艾塞那懸液多肽

    董晶劍,沈斌,肖艷萍,曹青日,施麗麗,

    (1嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江嘉興314001;2蘇州大學(xué)藥學(xué)院)

    艾塞那肽是第一個人工合成的腸降血糖素類似物,由39個氨基酸組成[1]。艾塞那肽能促使葡萄糖依賴的胰島素分泌,延緩胃排空,改善胰腺β細(xì)胞功能[2,3],治療2型糖尿病療效顯著,展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景[4]。作為多肽類藥物,艾塞那肽體內(nèi)穩(wěn)定性差,半衰期短,口服生物利用度低,目前臨床采用皮下注射給藥,然而頻繁注射造成患者順應(yīng)性差,且皮下注射難以達(dá)到持續(xù)激活胰高血糖素1(GLP-1)受體的作用[5],療效不持久。因此,研發(fā)長效口服制劑意義重大。由于口服吸收過程存在層層屏障,將艾塞那肽制成普通口服制劑缺乏可行性。將多肽類藥物包裹于納米給藥系統(tǒng)內(nèi),可增強(qiáng)其在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性,顯著促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞對多肽類藥物的攝取,從而提高口服生物利用度[6,7]。固體脂質(zhì)納米粒(SLNs)作為常用的納米給藥系統(tǒng),具有生物相容性好、保護(hù)藥物免受胃腸道酶降解、促進(jìn)藥物口服吸收等優(yōu)勢,已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點[8]。已有研究表明,固體納米??擅黠@增強(qiáng)胰島素在胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性,提高其口服生物利用度[9,10]。2017年10月~2019年4月,本研究將艾塞那肽包裹于SLNs,以羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(HACC)進(jìn)行修飾,通過體外細(xì)胞實驗對其轉(zhuǎn)運能力進(jìn)行初步評價。

    1 材料與方法

    1.1 主要實驗材料 超聲波細(xì)胞粉碎儀(JY96-11N型,寧波新芝生物科技公司),高分辨透射電鏡(TecnaiG220型,美國FEI公司),激光粒度分析儀(HPP5001型,英國馬爾文公司),超速離心機(jī)(OPTIMAL-90K型,美國BECKMAN公司),跨膜電阻測定儀(Millicell-ERS型,美國密理博公司)。艾塞那肽[批號P141017-3-LP052143,吉爾生化(上海)有限公司],單硬脂酸甘油酯(化學(xué)純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),大豆磷脂(S100,上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司),二氯甲烷(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),HACC(南通綠神生物工程有限公司),聚乙烯醇(Sigma公司)。人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞株Caco-2及人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞株Raji B購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

    1.2 納米粒制備 采用復(fù)乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒。內(nèi)水相:將30 mg艾塞那肽溶于1 mL水中。油相:20 mg大豆磷脂S-100溶于加有2 mL二氯甲烷的西林瓶內(nèi),70 ℃水浴下將60 mg單硬脂酸甘油酯盛于西林瓶內(nèi),將上述兩個西林瓶內(nèi)油相混合得到均一油相。將水相快速加至油相,200 W超聲60 s得到初乳,將初乳迅速轉(zhuǎn)移到20 mL外水相(1% PVA)中,攪拌得復(fù)乳,室溫持續(xù)攪拌5 h去除有機(jī)溶劑,得到納米?;鞈乙?Exenatide-SLNs)。在納米?;鞈乙褐芯徛渭?.1% HACC水溶液,使Exenatide-SLNs混懸液與0.1% HACC修飾液體積比為1∶4[11,12],200 W超聲90 s,室溫攪拌3 h,得到HACC修飾的艾塞那肽SLNs(HACC-Exenatide-SLNs)。

    1.3 納米粒理化性質(zhì)及載藥量檢測 取納米粒懸液,滴至覆有支持膜的銅網(wǎng)上,于紅外燈下烘干,采用高分辨透射電鏡觀察其形態(tài)。取適量納米粒懸液,以蒸餾水進(jìn)行稀釋,激光粒度儀測其粒徑及表面電位。取0.1 mL納米粒懸液于2 mL EP管內(nèi),加入適量甲醇破乳,高速離心取上清,以HPLC法測定上清液中的艾塞那肽,即為W總。取0.1 mL納米粒懸液,外水相稀釋10倍后超速離心45 000 r/min、45 min。以HPLC法測定上清液中游離的艾塞那肽,即為W游離。按公式[13]計算載藥量。載藥量=(W總-W游離)/W載體×100 %。其中,W總為艾塞那肽總量,W游離為未載入納米粒的艾塞那肽,W載體為載體質(zhì)量。

    1.4 黏膜濾泡相關(guān)上皮(FAE)單層細(xì)胞模型建立 按文獻(xiàn)方法培養(yǎng)Caco-2、Raji B細(xì)胞并建立FAE模型[14]。FAE模型具體制作過程:Caco-2單層細(xì)胞培養(yǎng)13 d后,按1×106/mL在Millipore跨膜小室的BL側(cè)(基底側(cè))加入Raji B細(xì)胞,AP側(cè)(腸腔側(cè))每日更換培養(yǎng)基,BL側(cè)每日半量更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至第19天,測定跨膜電阻值(TEER)[15]并檢測M細(xì)胞特異表達(dá)的UEA-1蛋白[16]。Caco-2單層細(xì)胞TEER>500 Ω/cm2,加入Raji B細(xì)胞后TEER約為Caco-2單層的60%,單層細(xì)胞表達(dá)UEA-1蛋白,表明已分化出M細(xì)胞,F(xiàn)AE模型建立成功。

    1.5 藥物轉(zhuǎn)運率測算 PBS輕輕洗滌符合轉(zhuǎn)運條件的FAE模型,于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中平衡0.5 h,吸走PBS;在供給池分別加入0.5 mL的艾塞那肽溶液(艾塞那肽溶液組)、Exenatide-SLNs混懸液(Exenatide-SLNs組)、HACC-Exenatide-SLNs混懸液(HACC-Exenatide-SLNs組);在接收池中加入1.5 mL的HBSS溶液,孵育4 h;從供給池取0.1 mL樣品,接收池取0.2 mL樣品,進(jìn)行液相分析。按照文獻(xiàn)方法計算藥物轉(zhuǎn)運率[17]。

    1.6 緊密連接蛋白Claudin-1檢測 上述“1.5”藥物轉(zhuǎn)運實驗結(jié)束后,去除轉(zhuǎn)運液,F(xiàn)AE單層細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次,加入適量裂解液,冰上裂解,12 000 r/min、4 ℃條件離心30 min,取上清,BCA法蛋白定量,用PBS調(diào)整各樣品濃度,沸水浴進(jìn)行蛋白變性。隨后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(80 V、1 h,120 V、2 h),電泳結(jié)束后將進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(300 mA,1.5 h),封閉1 h(5%脫脂奶粉),TBST洗滌。加入多克隆兔抗Claudin-1于4 ℃過夜,TBST洗滌,加入山羊抗兔IgG,室溫下孵育1 h,TBST洗滌,掃描成像。以GAPDH為內(nèi)參,未進(jìn)行轉(zhuǎn)運實驗的FAE細(xì)胞單層作為空白對照(Control)。使用Image J分析蛋白條帶灰度值,表示目的蛋白相對表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1 納米粒形態(tài)及理化性質(zhì) 電鏡觀察發(fā)現(xiàn),Exenatide-SLNs形態(tài)近圓形(圖1A);HACC-Exenatide-SLNs表面變粗糙,有殼聚糖鏈纏繞(圖1B)。HACC-Exenatide-SLNs組粒徑低于Exenatide-SLNs組,表面電位由負(fù)電位變?yōu)檎娢唬d藥量略低于Exenatide-SLNs組(P均<0.05)。見表1。

    圖1 Exenatide-SLNs、HACC-Exenatide-SLNs電鏡下觀察形態(tài)

    納米粒粒徑(nm)表面電位(mV)載藥量(%)Exenatide-SLNs226.3±19.8-24.2±2.53.1±0.2HACC-Exenatide-SLNs330.0±16.720.2±1.92.5±0.2

    2.2 各組藥物轉(zhuǎn)運率 艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組、HACC-Exenatide-SLNs組藥物轉(zhuǎn)運率分別為0.27%±0.07%、1.35%±0.11%、2.05%±0.08%,Exenatide-SLNs組、HACC-Exenatide-SLNs組藥物轉(zhuǎn)運率高于艾塞那肽溶液組,且HACC-Exenatide-SLNs組高于Exenatide-SLNs組(P均<0.01)。

    2.3 各組細(xì)胞中緊密連接蛋白表達(dá)比較 艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組、HACC-Exenatide-SLNs組細(xì)胞中Claudin-1相對表達(dá)量分別為1.100 5±0.088 2、1.001 7±0.153 8、0.628 4±0.043 9,HACC-Exenatide-SLNs組Claudin-1相對表達(dá)量低于艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組(P均<0.05)。

    3 討論

    艾塞那肽是一種蛋白多肽類藥物,具有很好的治療2型糖尿病的前景。如何選擇合適、高效的給藥途徑是蛋白多肽類藥物開發(fā)過程中至關(guān)重要的問題。目前蛋白多肽的給藥方式主要是注射給藥,然而頻繁注射給患者帶來諸多不便及痛苦。將蛋白多肽類藥物制成口服制劑,可避免注射給藥的痛苦。但蛋白多肽類藥物分子量大,脂溶性低,物理穩(wěn)定性差,難以透過腸道細(xì)胞膜,且易被胃腸道內(nèi)酸和消化酶分解,吸收后易受肝臟首過效應(yīng),因而將蛋白多肽藥物制備成普通口服制劑無法發(fā)揮療效。SLNs具有穩(wěn)定性高、適用于多種給藥途徑、具有淋巴吸收可避開首過效應(yīng)等優(yōu)勢,將蛋白多肽類藥物制備成口服SLNs具有廣闊的開發(fā)前景。

    本研究制備了艾塞那肽SLNs,并用HACC對其進(jìn)行表面修飾。HACC能溶于任意pH值水溶液[18],由于小分子季銨鹽的存在,HACC具有較強(qiáng)的質(zhì)子化能力、黏膜黏附性能及打開緊密連接的能力。本課題組前期實驗從SLNs混懸液與HACC修飾液的比例、超聲時間及修飾后攪拌時間三個方面優(yōu)化了HACC修飾工藝。體積比對粒徑有一定影響;超聲可降低粒徑,可能與超聲促使殼聚糖鏈相互纏繞而緊密包裹于SLNs周圍相關(guān);攪拌過程對經(jīng)HACC修飾的SLNs粒徑有微小的影響,殼聚糖長鏈的纏繞及解聚是一個動態(tài)平衡過程。

    FAE是體外模擬小腸的一種細(xì)胞模型,是將Caco-2細(xì)胞與Raji B細(xì)胞共孵育,繼而分化出M細(xì)胞所得。與Caco-2細(xì)胞模型相比,F(xiàn)AE模型中M細(xì)胞頂端缺乏黏液層,有利于外源物質(zhì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。Shi等[13]將低生物膜透過性藥物扎那米韋包裹于以單硬脂酸甘油酯為類脂質(zhì)的SLNs中,旨在提高其口服生物利用度,但研究結(jié)果表明該納米粒較難通過Caco-2單層膜,認(rèn)為Caco-2單層膜模擬小腸具有一定局限性。因此,有必要使用FAE模型研究納米給藥系統(tǒng)的吸收作用。本研究采用FAE模型對艾塞那肽納米粒轉(zhuǎn)運能力進(jìn)行初步評價。結(jié)果顯示,將艾塞那肽制備成SLNs可明顯促進(jìn)其跨FAE單層的轉(zhuǎn)運能力,SLNs表面吸附HACC,藥物的轉(zhuǎn)運量進(jìn)一步增加。分析其原因,HACC具有黏膜黏附性能,可延長藥物與細(xì)胞的接觸時間,促進(jìn)藥物跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運;同時HACC具有打開細(xì)胞緊密連接的功能,因此能從細(xì)胞旁路途經(jīng)促進(jìn)藥物的轉(zhuǎn)運。緊密連接是由一系列蛋白組成的復(fù)合物,緊密連接的打開有助于促進(jìn)藥物從旁路途徑的轉(zhuǎn)運[19,20]。本研究結(jié)果顯示,HACC-Exenatide-SLNs組Claudin-1相對表達(dá)量低于艾塞那肽溶液組、Exenatide-SLNs組,表明HACC修飾的納米??纱龠M(jìn)細(xì)胞旁路途徑轉(zhuǎn)運。

    SLNs可增加藥物跨膜能力,這對艾塞那肽口服制劑的開發(fā)具有重要價值。然而,本研究僅從體外對納米粒的性質(zhì)、轉(zhuǎn)運能力進(jìn)行觀察,缺乏對其體內(nèi)應(yīng)用效果的評價,后續(xù)將通過動物模型評價艾塞那肽SLNs的體內(nèi)降糖效果,為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

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