污水地下滲濾系統(tǒng)微生物代謝組學(xué)分析

楊 蕾,李英華,李海波,蘇 菲

污水地下滲濾系統(tǒng)微生物代謝組學(xué)分析

楊 蕾,李英華*,李海波,蘇 菲

(東北大學(xué)資源與土木工程學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110000)

應(yīng)用超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-MS),基于代謝組學(xué)方法,篩選不同進(jìn)水有機(jī)負(fù)荷下地下滲濾系統(tǒng)潛在生物標(biāo)志物.采用偏最小二乘法(PLS-DA)和主成分分析(PCA)模式識(shí)別方法對(duì)樣品進(jìn)行分型處理,根據(jù)模型的變量重要性因子(VIP值)篩選潛在生物標(biāo)志物,分析代謝產(chǎn)物蘊(yùn)含的生物學(xué)信息,研究代謝通路,通過RDA分析探索代謝產(chǎn)物與環(huán)境因子之間的相關(guān)性.PLS-DA模型結(jié)果表明,當(dāng)進(jìn)水有機(jī)負(fù)荷為250mg/L、400mg/L、500mg/L時(shí),同一高度層代謝產(chǎn)物間存在顯著性差異,共篩選出VIP值大于1.5的230種差異代謝物,以有機(jī)酸為主;同時(shí)也存在一些醇類、酚類等微生物代謝中間產(chǎn)物.此外,微生物代謝產(chǎn)物與模擬土柱高度有顯著對(duì)應(yīng)性.在水力負(fù)荷為0.14m3/(m2·d),COD污染負(fù)荷為400mg/L條件下,3個(gè)高度層H2(500mm)、H4(1000mm)、H6(1500mm)篩選出53種VIP值大于1.5的差異代謝物,以酸類、酮類物質(zhì)為主.RDA分析表明,隨著有機(jī)負(fù)荷波動(dòng)和剖面高度的變化,代謝產(chǎn)物受到氧化還原環(huán)境(ORP)與硝態(tài)氮(NO3-)的影響較大,呈負(fù)相關(guān).

地下滲濾系統(tǒng)；代謝組學(xué)；微生物；潛在生物標(biāo)志物

污水地下滲濾系統(tǒng)(SWIS)是一種由非均勻介質(zhì)組成多相共存的污水生態(tài)處理技術(shù),具有運(yùn)行費(fèi)用低,處理效果好,維護(hù)管理簡(jiǎn)單,生態(tài)效益明顯等優(yōu)點(diǎn)[1],其理論研究和工程應(yīng)用受到廣泛關(guān)注.

近年來,傳統(tǒng)平板法、變性梯度凝膠電泳(PCR- DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)等傳統(tǒng)生物技術(shù)被廣泛應(yīng)用于SWIS微生物種群結(jié)構(gòu)分析.通常認(rèn)為利用微生物的時(shí)空協(xié)調(diào)性指示SWIS是否健康更具說服力,通過精準(zhǔn)診斷微生物結(jié)構(gòu)和豐度來判定微生物協(xié)作關(guān)系,一直被學(xué)界廣為接受[2].然而,微生物空間分布雖然能夠反映一段時(shí)間內(nèi)基質(zhì)層的菌群協(xié)作狀態(tài),但當(dāng)系統(tǒng)因擾動(dòng)偏離健康軌跡時(shí),微生物群落并不能快速做出調(diào)整,反饋在出水上即不會(huì)立刻出現(xiàn)水質(zhì)惡化的現(xiàn)象[3].因此,利用DNA分子標(biāo)記、基因序列分析與核酸分子雜交等方法研究SWIS菌群結(jié)構(gòu)變化僅對(duì)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)有意義,對(duì)多因素?cái)_動(dòng)的系統(tǒng),所獲得的生物學(xué)信息僅能標(biāo)定相對(duì)狹窄的時(shí)段,用以表征系統(tǒng)健康度,必要但不充分[4].例如,通過對(duì)水力負(fù)荷波動(dòng)條件下SWIS多剖面PCR-DEEG分析,發(fā)現(xiàn)在低水力負(fù)荷(8cm/d)狀態(tài)下獲取的微生物空間結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)僅能指示不超過24h的種群特征,當(dāng)水力負(fù)荷在±2cm/d范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí),同一層DNA數(shù)據(jù)變化較大[5-6].即使進(jìn)一步采用DNA指紋和Real-time熒光定量技術(shù)分析,也只是在穩(wěn)態(tài)下才能獲得ANO、qnorB等優(yōu)勢(shì)硝化基因群落富集于上升流區(qū), amoA、narG等優(yōu)勢(shì)反硝化基因群落富集于重力流區(qū)的結(jié)論.而當(dāng)擾動(dòng)發(fā)生時(shí)(即使不劇烈),同樣發(fā)現(xiàn)同一流區(qū)基因空間分布相對(duì)紊亂(上升流區(qū)出現(xiàn)amoA)[7].因此,以往研究表明,利用微生物結(jié)構(gòu)-水質(zhì)的響應(yīng)關(guān)系表征SWIS健康度在理論上存在缺陷.

高通量測(cè)序具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度、低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì),可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究以及功能基因組學(xué)研究.高通量測(cè)序技術(shù)基于轉(zhuǎn)錄組分析,可以從大量轉(zhuǎn)錄組信息中發(fā)掘差異基因,快速判斷核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵候選基因,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子功能的進(jìn)一步分析.但由于基因的補(bǔ)償作用,某個(gè)基因的缺失會(huì)使得其他基因的存在而得到補(bǔ)償,最后的反應(yīng)凈結(jié)果為零,基因組的變化不一定能夠得到表達(dá).而代謝組學(xué)可對(duì)生物體內(nèi)所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析,小分子的產(chǎn)生和代謝能夠準(zhǔn)確反映生物體系的狀態(tài).

微生物代謝組學(xué)是一種理解細(xì)胞功能至關(guān)重要的功能基因組學(xué)的技術(shù),是對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)的直接反映,也可較為詳細(xì)地反映土壤微生物多樣性[8].微生物代謝組學(xué)能夠逆向推理微生物的代謝途徑及代謝方式,在微生物種類極其繁多的現(xiàn)實(shí)條件下,利用該方法對(duì)微生物代謝途徑進(jìn)行研究,具有精準(zhǔn)性和靶向性優(yōu)勢(shì).本研究利用微生物代謝組學(xué)的宏觀性,通過超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)分析技術(shù)對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,經(jīng)預(yù)處理、統(tǒng)計(jì)分析、生物學(xué)解釋獲得大量數(shù)據(jù),表達(dá)為特定的代謝指紋圖譜,篩選潛在生物標(biāo)志物[9];探究代謝產(chǎn)物蘊(yùn)含的生物學(xué)信息,研究其代謝通路,分析代謝產(chǎn)物與環(huán)境因子的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用如圖1所示的模擬裝置1#、2#、3#進(jìn)行研究.裝置主體尺寸為180cm×30cm(高×直徑).所填充的基質(zhì)從下往上依次為5cm 厚的礫石、3cm厚的細(xì)砂、以及140cm厚的混合基質(zhì).混合基質(zhì)由沙、爐渣和農(nóng)田土按體積比10%:25%:65%混合而成,孔隙度0.55,滲透系數(shù)范圍為4.167×10-5~1.389× 10-3cm/s.由蠕動(dòng)泵泵送進(jìn)水,并通過“十字”型穿孔布水管(表層土壤下65cm處)散水.每套設(shè)置沿縱向剖面設(shè)6組土壤取樣口(從上至下依次編號(hào)為H1、H2、H3、H4、H5、H6),平時(shí)密封,只有采樣時(shí)短暫開啟.各取樣口距離裝置底部的距離及取樣口編號(hào)如表1所示.

圖1 SWIS模擬裝置

表1 地下滲濾系統(tǒng)取樣口編號(hào)、高度及分區(qū)

1.2 試驗(yàn)過程

以葡萄糖(C6H12O6)、氯化銨(NH4CL)、硝酸鉀(KNO3)、亞硝酸鈉(NaNO2)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)按照所需比例配制成生活污水,在水力負(fù)荷為0.14m3/(m2·d)的條件下,控制有機(jī)污染負(fù)荷為250mg/L、400mg/L、500mg/L,干濕交替運(yùn)行,控制布水期(12h)和落干期(12h)時(shí)間.根據(jù)前期研究結(jié)論,SWIS氧化還原電位(ORP)大于300mV時(shí)可認(rèn)為是好氧環(huán)境,小于300mV時(shí)則為缺氧或厭氧環(huán)境,小于-200mV為完全厭氧環(huán)境[10].經(jīng)連續(xù)監(jiān)測(cè),H1(300mm)、H2(500mm)處氧化還原電位ORP均值分別為300mV,450mV;H3(750mm)、H4(1000mm)處分別為150mV,50mV;H5(1250mm)、H6(1500mm)處ORP值均低于-380mV.因此,隨著進(jìn)水-落干的交替運(yùn)行,H1、H2高度以上區(qū)域?yàn)楹醚醐h(huán)境,H3、H4區(qū)域環(huán)境則缺氧-厭氧變化,H5、H6區(qū)域始終處于厭氧環(huán)境[11].因此為了減少樣品分析工作量,待系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后,分別從H2、H4、H6高度的土壤取樣口取5g土壤于5mL離心管中,每一高度取樣口所取土壤均制成2個(gè)平行樣,樣品處理完后將所有樣本立即置于-80℃冰箱中保存.同時(shí),采集出水水樣并測(cè)定常規(guī)的理化指標(biāo).

1.3 樣品預(yù)處理

將采集到的土壤樣品,迅速用液氮滅活,用純甲醇提取劑進(jìn)行溶液提取,提取液體積10mL,提取3次,合并提取液,真空旋干,用1mL甲醇復(fù)溶,13000r/min離心機(jī)離心10min,吸取上清,裝入1.5mL進(jìn)樣小瓶,放置于4℃冰箱,待上機(jī)檢測(cè).

1.4 試驗(yàn)條件

土壤樣品測(cè)定采用美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)1260Infinity-6420液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀.測(cè)定條件為:流動(dòng)相由A相(甲酸:水=0.1:100)和B相(乙腈)組成,流速0.2mL/min,柱溫30℃.梯度洗脫條件為:0min,15%B;10min,65%B;15min,80%B; 30min, 95%B;38min,99%B;55min,99%B;56min,15%B;69min, 15%B;質(zhì)譜采用ESI離子源,在正離子模式下采集數(shù)據(jù),離子采集范圍是50~1800m/z.

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用UPLC-MS全掃描方式分析微生物代謝產(chǎn)物,將得到的數(shù)據(jù)文件以簡(jiǎn)單模式進(jìn)行AMDIS分析,進(jìn)而對(duì)代謝產(chǎn)物的總離子流圖進(jìn)行色譜峰識(shí)別與峰匹配,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)模式識(shí)別對(duì)操作條件進(jìn)行差異判別分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 SWIS代謝組學(xué)檢測(cè)方法

表2 檢測(cè)到的部分化合物

2.1.2 數(shù)據(jù)采集 由于土壤微生物代謝產(chǎn)物成分較復(fù)雜,大多數(shù)化合物為堿性化合物,TIC在ESI+模式下的響應(yīng)比較好,大部分代謝產(chǎn)物能夠在此模式下出峰[14].且正離子模式下,檢測(cè)到的峰譜較集中,檢測(cè)時(shí)間較短.對(duì)于SWIS代謝產(chǎn)物的檢測(cè),適合在質(zhì)譜正離子模式(ESI+)下分析.圖2是SWIS土壤樣品經(jīng)UPLC-MS分析得到的典型代謝指紋圖譜.

圖2 正離子模式識(shí)別色譜

2.1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理 應(yīng)用一系列的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法將色譜質(zhì)譜中的波譜信號(hào)為數(shù)據(jù)信息[15],包括:去除奇異點(diǎn),濾除噪音,峰識(shí)別,重疊峰分析,峰對(duì)齊,峰匹配,標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化等.

2.1.4 統(tǒng)計(jì)分析 經(jīng)過預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析,多元統(tǒng)計(jì)量的主要手段是模式識(shí)別技術(shù).模式識(shí)別可分為非監(jiān)督有監(jiān)督方法[16],非監(jiān)督方法中主成分分析(PCA)和監(jiān)督方法中偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)是代謝組學(xué)研究中最常用的模式識(shí)別方法,這兩種方法通常以得分圖獲得對(duì)樣品分類的信息,載荷圖對(duì)分類有貢獻(xiàn)變量及其貢獻(xiàn)大小,從而用于篩選生物標(biāo)志物.

2.2 不同有機(jī)負(fù)荷下生物標(biāo)志物的篩選

圖3 不同有機(jī)負(fù)荷波動(dòng)下PCA

橫縱軸代表兩個(gè)能最大程度反映方差的兩個(gè)特征值,圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本,形狀則代表不同柱子分組,即圓圈代表柱1樣本、方框代表柱2樣本、三角形代表柱3樣本(下同);越相似的樣本在圖中的距離越近,反之距離越遠(yuǎn)的樣本差異越大;圈外的點(diǎn)代表離散點(diǎn),誤差較大

根據(jù)模式識(shí)別模型的VIP值篩選潛在標(biāo)志物.通過分析不同樣品的組成可以反映樣品間的差異和距離,PCA運(yùn)用方差分解,將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上,坐標(biāo)軸為能夠最大程度反映方差的兩個(gè)特征值[17].如圖3所示,圖中每一個(gè)顏色代表一個(gè)模擬柱,即樣本點(diǎn)分組,相同分組的點(diǎn)以橢圓標(biāo)出,可以看出樣本組與組之間存在一定的距離,這說明樣本組之間的距離越大,對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物差異越大;而圖中樣本點(diǎn)接近或重合的部分,則表示微生物代謝產(chǎn)物差異不明顯.這說明在無監(jiān)督模式識(shí)別情況下,有機(jī)負(fù)荷為250mg/L、400mg/L、500mg/L的3個(gè)模擬柱之間微生物代謝產(chǎn)物存在差異.

從PCA模型看出,3組地下滲濾系統(tǒng)模擬柱微生物代謝產(chǎn)物之間雖存在差異,但不明顯,模型只解釋了45%的原始數(shù)據(jù),需要采用更加適合的模型來表征代謝指紋.PLS-DA是以偏最小二乘法回歸模型為基礎(chǔ),作為一種有監(jiān)督的模式識(shí)別的方法,根據(jù)給定的樣本分組信息,對(duì)群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行判別分析[18].從PCA圖中可以看到樣本的原始狀態(tài),而PLS-DA看到的是樣本的分組效果.通過PLS-DA模型圖找到造成組間差異的物質(zhì).為此,采用PLS-DA方法來區(qū)分3個(gè)模擬柱微生物代謝產(chǎn)物差異,篩選潛在標(biāo)志物.PLS-DA在PCA分析的基礎(chǔ)上,使得組分之間的區(qū)分效果更明顯,具有導(dǎo)向性.

圖4 不同有機(jī)負(fù)荷波動(dòng)下PLS-DA

形狀相同的點(diǎn)屬于同一分組,如果屬于同一分組的樣本之間的距離越近,同時(shí)不同分組的樣本之間的距離越遠(yuǎn),說明分類模型效果越好

如圖4所示,屬于同一橢圓內(nèi)的樣本之間某種程度上聚合,不同分組的樣本之間的距離區(qū)分比較明顯,這充分說明不同有機(jī)負(fù)荷的微生物代謝產(chǎn)物之間存在差異.實(shí)驗(yàn)?zāi)M柱中的裝填基質(zhì)土和取樣時(shí)間點(diǎn)相同,而3個(gè)模擬柱有機(jī)負(fù)荷進(jìn)水濃度逐漸增加,這說明進(jìn)水濃度與模擬柱之間的微生物代謝產(chǎn)物差異存在相關(guān)性.

在污水地下滲濾系統(tǒng)中,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是影響微生物生長(zhǎng)分布的主要因素之一,有機(jī)物的降解主要依靠土壤等基質(zhì)過濾吸附和微生物作用,污水與基質(zhì)不斷接觸的過程中,污水中大部分有機(jī)物被土壤膠體物質(zhì)吸附,繼而在微生物氧化作用下分解去除[19].不同有機(jī)負(fù)荷的進(jìn)水條件為微生物的生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),有機(jī)負(fù)荷不同,相對(duì)應(yīng)的微生物結(jié)構(gòu)及代謝途徑存在差異,進(jìn)而微生物代謝產(chǎn)物之間存在顯著性差異.

2.2.1 潛在標(biāo)志物識(shí)別 經(jīng)過PLS-DA分析得到所有磷脂分子的變量投影重要值(VIP值)排列圖,代謝差異化合物篩選的一般原則是在兩組(分批過程和連續(xù)過程組)PLS模型中的VIP值大于1[20].通過模擬柱不同有機(jī)負(fù)荷的PLD分析,找到VIP 值大于1的有500多個(gè)化合物,VIP大于1.5的化合物有230個(gè).在此挑選具有代表性的差異物,選取1.5作為篩選的臨界值.VIP值從0~2之間波動(dòng),VIP值大于2的潛在標(biāo)志物約為8.4%,1.5

表3 不同有機(jī)負(fù)荷條件下的潛在標(biāo)志物

注:1)Var ID代表一個(gè)物質(zhì);2)以序列號(hào)為例,1253.8s代表處理時(shí)間,292.23代表化合物的分子量, 2.93324代表VIP值.

表4 有機(jī)負(fù)荷波動(dòng)下SWIS生物代謝產(chǎn)物定性分析

2.2.2 代謝途徑分析 基于上述理論,將推定的鑒定化合物提交KEGG途徑數(shù)據(jù)庫(kù).代謝通路圖可以直觀的展示產(chǎn)物代謝過程中的相互作用,可以表現(xiàn)受體結(jié)合的活動(dòng),蛋白質(zhì)復(fù)合物,磷酸化反應(yīng),酶的活化等,將通路與生物學(xué)注釋連接在一起,使得產(chǎn)物的代謝途徑更加清晰.

圖5為Gingerglycolipid C 結(jié)構(gòu)示意圖.糖脂是糖通過半縮醛羥基以糖苷鍵與脂類連接的化合物.由于脂類部分不同,糖脂可分為鞘糖脂、甘油糖脂和類固醇衍生糖脂.根據(jù)化合物結(jié)構(gòu),Gingerglycolipid C屬于鞘糖脂,是細(xì)胞膜脂的主要成分.鞘糖脂分子中神經(jīng)酰胺羥基被甲基取代.脂類代謝產(chǎn)生長(zhǎng)鏈脂肪酸,長(zhǎng)鏈脂肪酸首先被轉(zhuǎn)化成脂酰輔酶CoA,經(jīng)輔酶AveA、AveE、AveF催化,在脂肪酸氧化酶作用下脫氫,脫下的氫和O2結(jié)合成H2O2,進(jìn)一步反應(yīng)釋出較短鏈脂肪酸,生成“B1b”.圖6為Gingerglycolipid C代謝通路圖.通過Gingerglycolipid C代謝通路圖,可以逆推Gingerglycolipid C是脂類物質(zhì)代謝產(chǎn)物,而分解代謝的初步階段是將蛋白質(zhì)、多糖以及脂類等大分子物質(zhì)降為氨基酸、單糖及脂肪酸等小分子物質(zhì),這充分說明Gingerglycolipid C是微生物的代謝產(chǎn)物.通過已知的代謝通路逆推找出化合物和調(diào)節(jié)酶,完成微生物代謝機(jī)理研究.

圖5 Gingerglycolipid C結(jié)構(gòu)示意

圖6 Gingerglycolipid C代謝通路

2.3 不同高度生物標(biāo)志物的篩選

在水力負(fù)荷為0.14m3/(m2·d),有機(jī)污染負(fù)荷為400mg/L的條件下,采用PCA分析法對(duì)模擬柱高度H2、H4、H6微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,土壤樣品微生物代謝產(chǎn)物的PCA圖如圖7所示.可以看出,模擬柱相同基質(zhì)層高度的樣本點(diǎn)距離相近,高度聚合,不同基質(zhì)層高度樣本代謝產(chǎn)物信息分離比較清晰明顯.這說明模擬柱高度層之間代謝產(chǎn)物存在差異,這與高度層之間的耗氧量存在相關(guān)性[21].在SWIS中溶解氧含量是影響微生物生長(zhǎng)分布的主要因素之一,土柱H2高度的ORP值為450mV,處于好氧區(qū),區(qū)域內(nèi)以好氧微生物為主;相對(duì)而言,土柱中層H4的OPR值為50mV,處于兼性厭氧區(qū);下層H6的ORP值在-380mV波動(dòng),氧氣含量逐漸減少,以厭氧微生物為主;土柱中氧氣含量劃分為H2好氧區(qū)~ H4兼性厭氧區(qū)~H6厭氧區(qū),硝化反應(yīng)主要發(fā)生在滲濾土層的上部好氧區(qū),說明好氧條件刺激了好氧微生物分泌初級(jí)代謝產(chǎn)物;反硝化則發(fā)生在土層的下部厭氧區(qū),刺激了厭氧微生物分泌了大量特異性代謝產(chǎn)物[22].氧氣含量沿縱向高度發(fā)生變化,相對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物也發(fā)生變化,存在顯著差異,與結(jié)果反映的信息一致.

圖7 不同高度微生物代謝產(chǎn)物PCA

橫縱軸代表兩個(gè)能最大程度反映方差的兩個(gè)特征值,圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本,形狀則代表不同高度分組,即方框代表高度H2樣本、三角代表高度H4樣本、圓圈代表高度H6樣本(下同).PCA圖中的大橢圓形區(qū)域稱作95%置信區(qū)間,處于大橢圓圈內(nèi)的樣本點(diǎn),具有可信性,處于圈外的樣本點(diǎn)稱作離散點(diǎn).越相似的樣本在圖中的距離越近,反之距離越遠(yuǎn)的樣本差異越大

圖8是有機(jī)負(fù)荷為400mg/L,不同高度層土壤樣品微生物代謝產(chǎn)物的PLS-DA圖.PLS-DA方法是發(fā)現(xiàn)、提取、統(tǒng)計(jì)微生物代謝產(chǎn)物差異的有力途徑之一[23].從圖中看出,模擬柱相同高度樣本點(diǎn)聚合,不同高度組分間區(qū)分效果明顯,說明同一高度層代謝產(chǎn)物差異較小,不同高度層代謝產(chǎn)物差異較大.表明PLS-DA穩(wěn)定且具有很好的解釋能力.因此,采用PLS-DA分析對(duì)本研究進(jìn)行結(jié)果分析具有可靠性、導(dǎo)向性.適合采用PLS-DA分析進(jìn)行差異代謝物的篩選.

圖8 不同高度 PLS-DA

每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本,每個(gè)形狀代表一個(gè)高度;如果屬于同一分組的樣本之間的距離越近,同時(shí)不同分組的樣本之間的距離越遠(yuǎn),說明分類模型效果越好

2.3.1 潛在標(biāo)志物識(shí)別 潛在生物標(biāo)志物的識(shí)別是代謝組學(xué)研究的核心內(nèi)容和目的之一.本研究以PCA分析為基礎(chǔ),通過PLS-DA圖對(duì)應(yīng)VIP值(VIP>1的變量表示它對(duì)模型分組的貢獻(xiàn)高于平均水平)找到潛在標(biāo)志物.后期可以通過ANOVA分析(方差分析,t-test,<0.05)識(shí)別出不同組別的土壤微生物代謝產(chǎn)物含量有顯著差異的代謝產(chǎn)物,進(jìn)一步篩選潛在生物標(biāo)志物[24].SWIS有機(jī)負(fù)荷為400mg/L,不同高度層土壤樣品微生物代謝產(chǎn)物經(jīng)PLS-DA分析得到VIP>1.5的代謝產(chǎn)物部分?jǐn)?shù)據(jù),如表5所示.模擬柱高度潛在標(biāo)準(zhǔn)物有53個(gè),VIP>2的有5個(gè)化合物.VIP值越大,對(duì)模型的分類貢獻(xiàn)越大,可作為篩選差異代謝物的指標(biāo)之一.采用METLIN代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在標(biāo)志物進(jìn)行分子式推斷、定性,得到部分的化合物如表6所示.

表5 不同高度潛在標(biāo)志物

表6 不同高度變化下SWIS微生物代謝產(chǎn)物定性分析

2.3.2 代謝途徑分析 代謝途徑作為一種平衡生物合成進(jìn)程的機(jī)能,它主要負(fù)責(zé)揭示物質(zhì)的生長(zhǎng)過程.研究代謝產(chǎn)物在代謝途徑中的作用已經(jīng)成為目前的一大熱點(diǎn).為利于微生物代謝途徑的系統(tǒng)性分析,本研究采用UPLC-MS的方法在生物系統(tǒng)中對(duì)特異性代謝物進(jìn)行鑒定和精確定量.Soraphen A結(jié)構(gòu)圖如圖9所示.經(jīng)鑒定結(jié)果分析,Soraphens是從一種黏細(xì)菌Sorangium cellulosum的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到的一類聚酮類化合物.脂肪酸經(jīng)?-氧化會(huì)產(chǎn)生大量乙酰輔酶,部分輔酶被轉(zhuǎn)化成酮體.葡萄糖供應(yīng)充足時(shí),糖分解代謝旺盛,供能充分,脂肪酸氧化分解減少,酮體生成被抑制;葡萄糖供應(yīng)不足時(shí),脂肪酸氧化分解增加,生成輔酶增加,酮體生成增多. Soraphen A代謝路徑圖如圖10所示,在輔酶SorM和SorB的催化作用下,-CH3被氧化,經(jīng)脫氫后生成酮體.經(jīng)過代謝的轉(zhuǎn)錄和翻譯,機(jī)體產(chǎn)生的代謝物可以成為識(shí)別代謝途徑異常的關(guān)鍵指標(biāo).通過顯著性代謝產(chǎn)物分析,探索何種代謝通路在該環(huán)境條件下占主導(dǎo)作用,實(shí)現(xiàn)SWIS微生物代謝產(chǎn)物對(duì)操作參數(shù)等響應(yīng)的定性跟蹤,從而通過代謝物的變化來改變環(huán)境干預(yù)條件,保持地下滲濾系統(tǒng)的穩(wěn)定、高效運(yùn)行.

圖9 Soraphen A 結(jié)構(gòu)示意

圖10 Soraphen A代謝通路

2.4 SWIS差異性代謝產(chǎn)物與環(huán)境因子的冗余分析(RDA)

RDA是基于對(duì)應(yīng)分析發(fā)展而來的一種排序方法,將對(duì)應(yīng)分析與多元回歸分析相結(jié)合,每一步計(jì)算均與環(huán)境因子進(jìn)行回歸,又稱多元直接梯度分析. RDA分析是一種排序分析,即在一個(gè)可視化的低維空間(二維)重新排列樣本,使得樣本之間的距離最大程度地反映出平面散點(diǎn)圖內(nèi)樣本之間的關(guān)系,直觀的看出樣本分布和環(huán)境因子間的關(guān)系[25].

圖11 SWIS差異性代謝產(chǎn)物與環(huán)境因子的RDA分析

圖中藍(lán)色箭頭代表不同的環(huán)境因子,紅色箭頭代表不同的代謝產(chǎn)物.環(huán)境因子之間的夾角為銳角時(shí),表示兩個(gè)環(huán)境因子之間正向關(guān),鈍角為負(fù)相關(guān).環(huán)境因子的射線越長(zhǎng),說明該影響因子的影響程度越大.圖中代謝產(chǎn)物名字均采用英文縮寫表示

從代謝產(chǎn)物與環(huán)境因子之間的夾角可以看出(圖11),環(huán)境因子NH4+、NO2-與大部分代謝產(chǎn)物呈顯著正相關(guān)關(guān)系,NO3-、ORP、COD、鹽度與大部分代謝產(chǎn)物呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.從環(huán)境因子之間的夾角可以看出,NO3-、ORP、COD、鹽度兩兩之間呈正相關(guān);NO2-與NH4+、COD都呈負(fù)相關(guān).環(huán)境因子射線的長(zhǎng)度表明,NO3-和COD對(duì)代謝產(chǎn)物影響較大.同時(shí)RDA排序圖反映出不同微生物代謝產(chǎn)物對(duì)環(huán)境因子的適應(yīng)性不同,即代謝產(chǎn)物在RDA排序圖中的位置越接近,表示其對(duì)環(huán)境適應(yīng)性越相似.RDA分析結(jié)果表明,在SWIS中,環(huán)境因子對(duì)微生物代謝產(chǎn)物存在影響,隨著有機(jī)負(fù)荷波動(dòng)和不同高度剖面的變化,代謝產(chǎn)物受到ORP與NO3-的影響較大,呈負(fù)相關(guān).

3 結(jié)論

3.1 本研究通過PLS-DA模型分析了SWIS微生物代謝組學(xué)在不同有機(jī)負(fù)荷、不同剖面的變化,建立了一套基于UPLC- MS技術(shù)的SWIS微生物代謝組學(xué)研究方法.通過篩選生物標(biāo)志物,分析了差異性產(chǎn)物的代謝通路,利用RDA分析探索了該代謝產(chǎn)物與主要環(huán)境因子(COD,NH4+,ORP等)的相關(guān)性.

3.2 在有機(jī)負(fù)荷波動(dòng)條件下(COD=250-500mg/L),微生物代謝產(chǎn)物因進(jìn)水營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同存在差異性.其中,在中等負(fù)荷下(COD=400mg/L),微生物代謝產(chǎn)物與基質(zhì)層高度顯著相關(guān), 共篩選到53個(gè)潛在生物標(biāo)志物, 定性得到12種化合物,包括:葡萄糖醛酸苷(19-Norandrosterone glucuronide)、戊烯二酸(Glutaconic acid)、杯莧甾酮(cyasterone)等. 同時(shí), ORP與NO3-對(duì)微生物代謝產(chǎn)物存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系.

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Microbial metabolomics analysis of subsurface wastewater infiltration system.

YANG Lei, LI Ying-hua*, LI Hai-bo, SU Fei

(School of Resources and Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang 110000, China)., 2019,39(11)：4812~4822

Based on metabolomics method, ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) was used to screen potential biomarkers of subsurface infiltration systems under different organic loads. The samples were typed by partial least squares (PLS-DA) and principal component analysis (PCA) pattern recognition methods, and potential biomarkers were screened according to the model's variable importance factor (VIP). Furthermore, biological information involved in metabolites and metabolic pathways were revealed. Finally, correlation between metabolites and environmental factors was explored by RDA analysis. The results of PLS-DA model showed that when the influent organic load gradually increased from 250mg/L to 400mg/Land 500mg/L, there was a significant difference between the metabolites in the same soil profile. A total of 230differential metabolites with a VIP value greater than 1.5 were screened out, which were mainly composed of organic acids, such as lactic acid, tartronic acid, dioleoylphosphatidic acid. The microbial metabolites had a significant correspondence with the soil profile. Under the condition of hydraulic load 0.14m3/(m2·d) and COD 400mg/L, 53metabolites with a VIP value greater than 1.5 were screened out from H2 (500mm), H4 (1000mm) and H6 (1500mm), respectively, which was mainly composed of acid and ketone substances, such as 6-Hydroxyondansetron sulfate, 19-Norandrosterone glucuronide and Methylcarbamyl PAF C-8. The results of RDA suggested that with the variation of pollution load and substrate profile, metabolites were negatively influenced by oxidation reduction potential (ORP) and nitrate (NO3-).

subsurface wastewater infiltration system；metabolomics；microorganism；potential biomarke

X523

A

1000-6923(2019)11-4812-11

楊 蕾(1995-),女,遼寧莊河人,東北大學(xué)碩士研究生,主要研究方向?yàn)槲鬯鷳B(tài)處理技術(shù).發(fā)表論文3篇.

2019-04-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41571455,51578115)

* 責(zé)任作者,教授, liyinghua@mail.neu.edu.cn