動(dòng)物成肌分化及非編碼RNA 調(diào)控研究進(jìn)展

李秦瑾，陳小冬

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070）

隨著人們生活水平的不斷提高，畜禽集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，提高肌肉的產(chǎn)量和質(zhì)量成為畜牧工作者的首要任務(wù)之一。就畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)學(xué)意義而言，促進(jìn)成肌分化、提高骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育及畜禽肌肉產(chǎn)量至關(guān)重要。從醫(yī)學(xué)角度來看，目前肌肉肥大或萎縮等疾病的發(fā)病率較高，已給人類健康帶來了嚴(yán)重危害。本文從動(dòng)物胚胎成肌分化和調(diào)控、個(gè)體發(fā)育完成后衛(wèi)星細(xì)胞的分化和調(diào)控、microRNA 和lncRNA 與肌肉形成關(guān)系等方面進(jìn)行綜述，為深入理解畜禽胚胎期肌細(xì)胞和個(gè)體發(fā)育完成后衛(wèi)星細(xì)胞的分化過程及調(diào)控機(jī)理提供參考,也為提高畜禽肉產(chǎn)量和肉品質(zhì)提供一定的科學(xué)理論指導(dǎo)。

1 胚胎期成肌分化

1.1 胚胎期成肌過程 畜禽的肌肉產(chǎn)量取決于肌纖維數(shù)量和截面直徑，其中肌纖維數(shù)量由胚胎期所決定[1]。動(dòng)物妊娠初期形成內(nèi)胚層、中胚層和外胚層3 個(gè)胚層。脊椎動(dòng)物的肌肉分化源于胚胎的中胚層細(xì)胞，側(cè)板中胚層形成體節(jié)。除了頭部部分肌肉來源于近軸頭中胚層和脊索前中胚層，四肢、軀干和頭部其他肌肉都來源于體節(jié)細(xì)胞[2]。

1.2 胚胎成肌分化的調(diào)控 肌細(xì)胞分化是一個(gè)由多種功能性因子協(xié)同調(diào)控的復(fù)雜過程。成肌決定因子家族（Myoblast Determination Genes Family，MyoD family）包含4 個(gè)成員，即生肌調(diào)控因子4（Myogenic Regulatory Factor 4，MRF4）、生肌決定因子（Myoblast Determination Protein，MyoD）、肌細(xì)胞生成素（Myogenin，MyoG）和生肌因子5（Myogenic factor 5，Myf5），該家族成員也稱為生肌調(diào)控因子（Myogenic Regulatory Factors，MRFs）[3]，共同參與整個(gè)成肌分化和肌纖維形成的過程，其中MyoD 和Myf5主要決定成肌細(xì)胞的形成，MyoG 和MRF4 則主要決定肌細(xì)胞分化和肌管/肌纖維形成（圖1）。成對(duì)的框轉(zhuǎn)錄因子3（The Paired Box Transcription Factor 3，PAX3）、成對(duì)的框轉(zhuǎn)錄因子7（The Paired Box Transcription Factor 7，PAX7）和原始肌源細(xì)胞標(biāo)志因子Myf5 在生皮肌節(jié)細(xì)胞中表達(dá)[4]，其中PAX3 和PAX7 作用于下游的MRFs，PAX3和PAX7的表達(dá)是胚胎細(xì)胞向肌祖細(xì)胞分化的標(biāo)志[5]，而Myf5 可平行于PAX3、PAX7 影響下游MyoD的表達(dá)。小鼠缺失MyoD或Myf5不影響肌肉的形成，只有當(dāng)兩者同時(shí)缺失時(shí)才會(huì)導(dǎo)致肌肉缺失[6]。這些因子在胚胎期成肌分化的不同時(shí)期表達(dá)，貫穿了成肌分化的整個(gè)過程，并對(duì)肌細(xì)胞分化和肌纖維形成發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

圖1 肌管發(fā)育從胚胎到成熟過程中重要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)時(shí)間[7]

除了以上經(jīng)典的成肌分化的調(diào)節(jié)因子，近些年來的研究還發(fā)現(xiàn)許多新的參與調(diào)控成肌分化的因子。蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白1（Ninjurin1）在主動(dòng)脈狹窄患者的肥厚性心臟中表達(dá)增加，這是一種細(xì)胞表面的跨膜蛋白，參與細(xì)胞黏附和神經(jīng)修復(fù)，Ninjurin1 能通過N-糖基化的Ninjurin1-24 介導(dǎo)促進(jìn)橫紋肌的生長(zhǎng)和分化[8]。作為一種轉(zhuǎn)錄輔助因子，Vgll3（Vestigial-like factor 3）能夠與TAED 家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合下調(diào)Hippo 通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響骨骼肌的生成[9]。有研究報(bào)道，甲基化修飾也對(duì)成肌分化有重要影響，早期肌源性基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的去甲基化和肌源性基因的高甲基化是引起小型豬肌源性基因早期表達(dá)的主要原因，其中DNA 去甲基化酶Tet1 參與肌源蛋白啟動(dòng)子的去甲基化，促進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）的永生化和豬胚胎肌原細(xì)胞的分化[10]。骨骼肌中含有大小不同、收縮速度不一的異質(zhì)肌纖維，其中Ⅱb 型肌纖維最大、收縮速度最快。研究發(fā)現(xiàn)一種非組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Mettl21e 能夠?qū)Ψ核?蛋白酶系統(tǒng)的關(guān)鍵因子含纈氨酸蛋白（Vcp/p97）甲基化，從而抑制蛋白酶體介導(dǎo)的降解過程來維持肌纖維的大小[11]。

1.3 胚胎期成肌分化的信號(hào)通路 胚胎期成肌分化受到周圍環(huán)境信號(hào)通路調(diào)節(jié)，如外胚層和神經(jīng)管分泌的Wnt家族蛋白（Wingless and INT-1 proteins，Wnts）、神經(jīng)管和脊索釋放的音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）以及側(cè)板中胚層生成的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMPs）[12]。

Wnt 家族蛋白在生皮肌節(jié)和肌節(jié)的形成以及肌發(fā)生過程中起著重要的作用。Wnt1 突變?nèi)笔У男∈髸?huì)引起生皮肌節(jié)部分減少并且下調(diào)PAX3 和 Myf5 的表達(dá)量[13]。在體節(jié)中，Wnt1 與受體Fzd1/Fzd6 結(jié)合激活β-catenin 途徑提高M(jìn)yf5的表達(dá)，而Wnt7a 與受體Fzd7 結(jié)合后通過激活蛋白激酶C（PKC）促進(jìn)MyoD的表達(dá)。β-catenin 能促進(jìn)MyoD 與肌源性位點(diǎn)的結(jié)合從而廣泛協(xié)調(diào)肌源性基因網(wǎng)絡(luò)，β-catenin-TCF/LEF 復(fù)合物可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)控制β-catenin 水平，從而防止早熟或過度的成肌細(xì)胞融合[14]。

Shh 蛋白是一種廣泛表達(dá)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在生皮肌節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧」?jié)細(xì)胞過程中必不可少，生皮肌節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌節(jié)細(xì)胞后會(huì)高量表達(dá)MyoD/Myf5，但低水平表達(dá)PAX3/7。T 細(xì)胞因子（T Cell Factor，TCF）和Hedgehog 信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子GLI（Glioma-Associated Oncogene Homoglog）在Myf5基因上有結(jié)合位點(diǎn)，因此Shh 才可能與Wnt 協(xié)同地激活Myf5表達(dá)[15]。

BMPs 能夠抑制某些成肌分化基因的表達(dá)，如Bmp4 可延遲Myf5和MyoD的表達(dá)，同時(shí)保持PAX3的表達(dá)，從而使肌祖細(xì)胞維持一種不分化狀態(tài)[16]。這表明在啟動(dòng)肌細(xì)胞分化之前，BMPs 對(duì)肌祖細(xì)胞的增殖有重要作用。

在成肌分化過程中Notch 信號(hào)通路作也有重要意義。生皮肌節(jié)細(xì)胞上的Jagged 配體短暫地與相鄰細(xì)胞的Delta1 接觸，從而激活Notch 信號(hào)通路，激活的Notch 信號(hào)與RPB-J 蛋白以及轉(zhuǎn)錄抑制因子Hes1 結(jié)合進(jìn)而下調(diào)MyoD表達(dá)[17]。

2 衛(wèi)星細(xì)胞分化與調(diào)控

胚胎發(fā)育完全后的個(gè)體在疾病或受傷時(shí)需要衛(wèi)星細(xì)胞大量地再生肌肉。除了頭部某些肌肉外，成年個(gè)體衛(wèi)星細(xì)胞可由體節(jié)中能夠表達(dá)PAX3 和PAX7 的細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。衛(wèi)星干細(xì)胞激活后可通過有絲分裂增殖來增加細(xì)胞數(shù)目，這些衛(wèi)星干細(xì)胞其中一部分維持原有的干性，另一部分則通過上調(diào)MyoD表達(dá)誘導(dǎo)定向成肌分化[18]。MyoD 誘導(dǎo)成肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，并刺激成肌細(xì)胞表達(dá)MRF4、MyoG 等肌細(xì)胞特異性因子。隨后PAX7 表達(dá)量下調(diào)，成肌細(xì)胞退出增殖周期并開始與其他成肌細(xì)胞融合形成肌管[19]。

衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目保持常數(shù)才能使肌細(xì)胞維持再生能力。目前有2 種保持衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)的設(shè)想模式：一是隨機(jī)模式即衛(wèi)星細(xì)胞分裂成2 個(gè)相同的子代細(xì)胞，其中一個(gè)維持衛(wèi)星細(xì)胞干性特質(zhì)，另一個(gè)分化為成肌細(xì)胞；二是不對(duì)稱分裂模式即衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)生2 個(gè)不同的子代細(xì)胞，DNA 共分離進(jìn)入子細(xì)胞誘導(dǎo)分化，原來的細(xì)胞保持不變[20]。研究者利用Myf5-Cre-stop-flox-YFP 報(bào)告系統(tǒng)證明了衛(wèi)星細(xì)胞是通過不對(duì)稱分裂的方式保持自我更新和分化[16]。

衛(wèi)星干細(xì)胞的靜息、激活、自我更新和分化等過程受到所處環(huán)境的許多信號(hào)調(diào)控[16]。在成體肌肉中，衛(wèi)星細(xì)胞通常處于靜息狀態(tài)不進(jìn)行有絲分裂，M-鈣粘蛋白是靜息衛(wèi)星細(xì)胞和活化生肌前體細(xì)胞的標(biāo)志物。衛(wèi)星細(xì)胞在靜息狀態(tài)下表達(dá)肌生成抑制蛋白（Myostatin），這種負(fù)調(diào)節(jié)因子既抑制衛(wèi)星細(xì)胞增殖又抑制其分化[21]。衛(wèi)星細(xì)胞受刺激后會(huì)引起NO 的合成，進(jìn)而引發(fā)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）的釋放，然后由肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體c-Met 介導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞的激活[22]。衛(wèi)星細(xì)胞激活后會(huì)啟動(dòng)增殖和分化程序，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）來源于細(xì)胞外基質(zhì)，能夠結(jié)合受體促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖并抑制其分化[23]；胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）利用多條信號(hào)通路，如3-羥基-磷酸肌醇激酶（PI-3K）和有絲分裂原激酶（MAPK），促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化。Notch 和Wnt 信號(hào)通路都參與衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化，當(dāng)Notch 信號(hào)通路被激活時(shí)，GSK3β被磷酸化并處于激活狀態(tài)，Wnt 信號(hào)通路被抑制，PAX3 的表達(dá)量增加從而促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖；衛(wèi)星細(xì)胞分化的起始是由于Notch 與Wnt 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)化和過渡，骨骼肌內(nèi)Wnt 信號(hào)直接作用于衛(wèi)星細(xì)胞使衛(wèi)星細(xì)胞由增殖向分化階段轉(zhuǎn)變[24]。

3 MicroRNAs 與肌肉發(fā)生

MicroRNAs（miRNAs）是一種高度保守的非編碼小RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 廣泛作用于控制細(xì)胞成肌分化的關(guān)鍵基因，對(duì)成肌分化產(chǎn)生重要影響。根據(jù)表達(dá)的特異性不同，miRNAs 可分為肌肉組織特異性的miRNAs 和非肌肉組織特異性兩類。各種miRNA 對(duì)成肌分化調(diào)控作用見表1。miRNAs 不僅參與調(diào)節(jié)骨骼肌和心肌的發(fā)育、生長(zhǎng)、再生以及成肌細(xì)胞的增殖和分化，并可能與多種肌肉相關(guān)的疾?。ㄈ邕M(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良、心肌梗死、心肌肥大等）有關(guān)。

4 LncRNA 與肌肉發(fā)育

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs，lncRNAs）廣泛存在于哺乳動(dòng)物中。LncRNAs 具有多種生物學(xué)功，其中在肌肉發(fā)育過程中也具有重要的調(diào)控作用，可通過靶向肌細(xì)胞分化和骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子參與調(diào)控成肌分化的各個(gè)環(huán)節(jié)。

LncRNAs 是調(diào)控肌細(xì)胞分化的重要調(diào)控因子。作為哺乳動(dòng)物中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的lncRNA，H19 一方面能順式調(diào)控Igf2 進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的肌源性發(fā)生和分化，另一方面可以反式調(diào)控靶基因，包括海綿化let-7、miR-106 或miR-29 介導(dǎo)心肌細(xì)胞的增殖和葡萄糖攝取以及肌腱修復(fù)，并通過結(jié)合MBD1 修飾染色質(zhì)促進(jìn)胚胎發(fā)育和肌肉再生，因此其在肌肉中的功能引起了廣泛關(guān)注[31]。MyoD1基因上游30 kb 處能夠轉(zhuǎn)錄出來lncMyoD。MyoD 能夠結(jié)合到lncMyoD 啟動(dòng)子上，進(jìn)而增強(qiáng)lncMyoD 與IMP2 的結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)周期蛋白的表達(dá)使細(xì)胞處于細(xì)胞周期來間接抑制成肌細(xì)胞的分化[32]。

表1 miRNAs 對(duì)成肌分化調(diào)控作用

目前l(fā)ncRNA 調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的研究還處于初始階段。有研究表明，linc-RAM（linc-RNA Activator of Myogenesis）通過直接結(jié)合MyoD 調(diào)控肌源性基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MyoD-Baf60c-Brg1 復(fù)合物在靶基因調(diào)控元件上的組裝來激活骨骼肌的生成[33]。lncRNA Irm 通過直接與MEF2D 結(jié)合促進(jìn)MyoD/MEF2D 在靶基因調(diào)控元件上的組裝從而調(diào)控肌源性基因的表達(dá)[34]。Zhu 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA lnc-mg 調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育，它可通過作為microRNA-125b 的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA（ceRNA），控制胰島素樣生長(zhǎng)因子2 的蛋白豐度，促進(jìn)骨骼肌生成。研究發(fā)現(xiàn)肌源蛋白啟動(dòng)子相關(guān)的lncRNA Myoparr 能夠抑制肌肉萎縮的抑制因子GDF5，并且下調(diào)BMP 信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)肌肉萎縮[36]。lncRNA Kcnqlot1 能通過促進(jìn)H3K27me3積累到MyoD 結(jié)合區(qū)來控制肌細(xì)胞中p57的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控成肌分化[37]。Li 等[38]新鑒定出一種lncRNA 能通過海綿miR-15 家族來激活I(lǐng)GF1-PI3K/AKT 通路，從而促進(jìn)骨骼肌肌肉生成和控制肌肉萎縮。

5 總結(jié)與展望

近年來，隨著各種研究技術(shù)手段的發(fā)展，胚胎干細(xì)胞成肌分化及骨骼肌發(fā)育方面取得了一系列的重要進(jìn)展，控制成肌分化和肌肉發(fā)育的重要基因和調(diào)控途徑也相繼揭示。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析（RNA-seq）進(jìn)一步鑒定出大批調(diào)控干細(xì)胞成肌分化和骨骼肌生成相關(guān)的miRNAs 和lncRNAs，并對(duì)它們的功能及調(diào)控靶點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證，然而大部分研究集中在嚙齒模式動(dòng)物上，大量數(shù)據(jù)在畜禽動(dòng)物上尚未得到驗(yàn)證。目前，阻礙畜禽胚胎干細(xì)胞成肌分化和骨骼肌發(fā)育研究取得重大突破性進(jìn)展因素主要有3 個(gè)方面：一是對(duì)畜禽骨骼肌發(fā)育的特點(diǎn)及分子機(jī)制的理解不夠；二是對(duì)畜禽不同品系骨骼肌發(fā)育差異的表觀遺傳學(xué)解析不夠；三是對(duì)畜禽胚胎干細(xì)胞研究的技術(shù)還不夠成熟。突破這些問題將有利于畜禽肉品質(zhì)的改良及我國(guó)畜禽資源的有效利用。因此，未來幾年，可借助于干細(xì)胞技術(shù)、各種組學(xué)研究技術(shù)、表觀遺傳學(xué)及miRNAs 和lncRNAs 等手段，通過比較生物學(xué)研究策略，探究和挖掘控制畜禽胚胎干細(xì)胞成肌分化、骨骼肌發(fā)育及骨骼肌損傷修復(fù)等相關(guān)的重要功能基因及調(diào)控機(jī)制。