白藜蘆醇對綿羊卵母細胞體外成熟的影響

努日比婭姆·麥麥提托合提，張 博，趙 茜，阿爾曼·海熱，宋玉坤，劉國世，阿布力孜·吾斯曼*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院動物胚胎工程實驗室，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193）

隨著哺乳動物體外受精-胚胎移植、轉基因、細胞漿內單精子顯微注射等技術的不斷發(fā)展，對高質量卵母細胞及胚胎的需求日益增加，體內排出卵母細胞供不應求[1]。未成熟卵母細胞體外成熟（IVM）是提高胚胎體外生產(chǎn)效果的關鍵一步。卵母細胞在體外成熟過程中易受外界環(huán)境影響，其中活性氧（ROS）造成的損傷是降低細胞成熟質量的主要原因，并可引起胚胎發(fā)育停滯[2]。向培養(yǎng)基中添加適量抗氧化劑能夠改善體外培養(yǎng)微環(huán)境，是促進卵母細胞成熟獲得高質量細胞的重要途徑之一[3]。白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種天然的高效抗氧化劑，能夠避免過多ROS 引起的氧化損傷，促進卵母細胞體外成熟與胚胎體外發(fā)育[4]。豬卵母細胞IVM 液中添加RES能夠維持其氧化還原平衡，促進細胞體外成熟[5]。山羊卵母細胞IVM 液中添加RES 顯著提高細胞內谷胱甘肽（GSH）水平，最終改善孤雌生殖和手工克隆胚胎發(fā)育潛力[6]。綿羊[7]、牛[8]卵母細胞IVM 液中分別添加RES 能夠促進細胞體外成熟，提高受精率、囊胚率及囊胚平均細胞數(shù)。目前，在國內尚未報道RES 對綿羊卵母細胞核質成熟的影響。因此，本實驗旨在研究不同濃度RES 對綿羊卵丘細胞擴展和卵母細胞第一極體排出及細胞質內ROS 和GSH 水平的影響，探究RES 卵母細胞抵抗氧化應激能力，促進卵母細胞體外成熟的調控機制，為卵母細胞體外成熟的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、雌二醇（E2）、無脂肪酸-BSA、肝素鈉、透明質酸酶等購自Solarbio 公司；RES、TCM199、聚乙烯醇（PVA）、HEPES、HEPES-Na、酚紅、NaHCO3、葡萄糖、乳酸鈉、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素、礦物油、無機鹽等均購自美國Sigma 公司；CMF2HC，H2DCFDA 購自Invitrogen 公司。

1.1.3 試劑配制 采卵液：9.5 g/L TCM199，4 g/L BSA，2500 U/L 肝素鈉，5 mmol/L NaHCO3，0.01 g/L 酚紅，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L HEPES-Na，100 mg/L青霉素，100 mg/L 鏈霉素，4℃保存。

體外成熟基礎液：9.5 g/L TCM199，6 g/L BSA，500 U/L FSH,500 U/L LH，1 mg/L E2，25 mmol/L NaHCO3，5.5 mmol/L 乳酸鈉，2 mmol/L 丙酮酸鈉，1.5 mmol/L葡萄糖，0.1 g/L 青霉素，0.1 g/L 鏈霉素。用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，4℃保存。

0.1% 透明質酸酶：1 g/L 透明質酸酶，9.5 g/L TCM199，2.1 g/L NaHCO3，-20℃保存。

DPBS：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.05 g/L KH2PO4，2.17 g/L Na2HPO4·7H2O，0.13 g/L CaCl2·2H2O，0.1 g/L MgCl2·6H2O；pH 調至7.2～7.4，在4℃保存。

Tyrodes medium：8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，0.2 g/L CaCl2·2H2O，0.1 g/L MgCl2·6H2O，0.05 g/L NaH2PO4，1 g/L NaHCO3，4℃保存。

DPBS-PVA：1 g PVA 熱溶于1 L DPBS 中。

熒光染色工作液：10 μmol/L H2DCFDA（ROS），10 μmol/L CMF2HC（GSH），現(xiàn)配現(xiàn)用。

配制RES 濃度：對照組為基礎培養(yǎng)液；實驗組在基礎培養(yǎng)液中添加0.5、2.0、5.0 μmol/L RES 配成不同RES 濃度的IVM 液，4℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 卵母細胞收集及體外培養(yǎng) 將采自新疆烏魯木齊市新華凌羊屠宰場的綿羊卵巢裝在含雙抗38.5℃的生理鹽水中，在2～4 h 內運送到實驗室，用生理鹽水輕緩清洗3 遍。將38.5℃預熱的適量采卵液倒入90 mm 的塑料培養(yǎng)皿中，將清洗完的卵巢（5～10 個）放置此培養(yǎng)皿中，用眼科鑷和23 號的手術刀片進行卵泡輕柔緊密割卵，從而使卵母細胞流入采卵液。在體視顯微鏡下，挑選出卵丘顆粒細胞緊密包圍和細胞質均勻的卵母細胞。用洗卵液清洗3 次，移入已預熱70 μL 的成熟培養(yǎng)滴中，在38.5℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中進行體外成熟24 h。

1.3 實驗設計

1.3.1 添加不同濃度RES 對體外成熟綿羊卵丘擴展率和卵母細胞核成熟的影響 使用含有不同濃度RES（0、0.5、2.0、5.0 μmol/L）的IVM 培養(yǎng)基成熟綿羊卵母細胞24 h，并觀察卵丘擴展率情況，統(tǒng)計第一極體形成率。將收集的卵母細胞隨機分為4 組，分別進行3 次重復。

1.3.2 添加不同濃度RES 對體外成熟綿羊卵母細胞細胞質中ROS 和GSH 含量的影響 使用含不同濃度RES（0、0.5、2.0、5.0 μmol/L）的IVM 培養(yǎng)基成熟綿羊卵母細胞24 h，透明質酸酶去除顆粒細胞后，H2DCFDA（檢測ROS）或CMF2HC（檢測GSH）進行細胞質染色，在熒光倒置顯微鏡下采集綠、藍色熒光圖像，采用Image-pro plus 軟件進行分析其積分光密度（IOD）和熒光 面積（AREA），計 算平均密度（MOD，MOD=IOD/AREA），即為平均熒光強度。平均熒光強度值反映細胞內ROS 和GSH 水平。將卵母細胞隨機分為4 組，分別進行5 次重復。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 觀察卵丘細胞擴展情況 卵母細胞IVM 24 h 后，在體式顯微鏡下直接觀察拍照。采用Vanderhyden B C[9]的分級方法，將卵丘細胞擴展分為G1、G2、G3、G4 級。G1 級：沒有擴展，通常卵丘細胞已經(jīng)貼壁，卵母細胞已經(jīng)發(fā)黑；G2 級：最外1～2 層顆粒細胞有擴展；G3 級：卵丘細胞呈蓬松狀態(tài)，外側的幾層細胞擴展，開始呈放射冠，部分未擴展；G4：包括放射冠在內全部擴展開來，細胞間粘性較弱，而且外周部分細胞已開始脫落。并把G3，G4 級擴展定為卵丘擴展狀態(tài)；G1、G2 級擴展定為卵丘未擴展狀態(tài)。擴展率為G3，G4 級擴展細胞個數(shù)占總細胞個數(shù)的百分率。

1.4.2 觀察第一極體的排出情況 將IVM 24 h 以后的卵母細胞在0.1%的透明質酸酶里用移液槍反復吹打，脫掉卵丘和顆粒細胞，吹打時間控制在30s 內，脫完顆粒的卵母細胞用洗卵液洗3 次，在體視顯微鏡下觀察第一極體排出情況。

1.4.3 卵母細胞胞質內ROS 和GSH 的檢測 通過H2DCFDA和CMF2HC 熒光染料檢測細胞內ROS 和GSH 水平。將成熟24 h 后脫去顆粒細胞的卵母細胞用PVA-DPBS洗滌，然后放入含有10 μmol/L H2DCFDA（檢測ROS）或10 μmol/L CMF2HC（檢測GSH）的染色液中，并在37℃避光染色30 min。染色后適當洗滌，然后放入10 μL的PBS 液滴中，在裝有藍光/ 紫外線濾光片的熒光倒置顯微鏡上觀察熒光及采集圖像，所有拍照曝光時間參數(shù)為2.696 s（ROS）和1.493 s(GSH)。通過Image-pro plus 軟件進行熒光強度分析。

1.5 統(tǒng)計分析 利用Image-pro plus 軟件檢測細胞內ROS 和GSH 熒 光 強 度，運 用Excel 和SPASS 23.0 的LSD 法進行單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準，結果采用平均數(shù)±標準誤差表示。

2 結果

2.1 添加不同濃度RES 對卵丘細胞擴展率的影響 如表1 所示，與對照組相比，添加0.5 μmol/L RES 卵丘細胞擴展率有提高的趨勢（P>0.05），濃度增至5.0 μmol/L RES時會顯著降低卵丘擴展率。因此，添加0.5 μmol/L RES并不影響卵丘細胞擴展率。0.5 μmol/L RES 組卵母細胞第一極體排出率顯著高于對照組和其他試驗組，對照組和2.0 μmol/L 試驗組之間無顯著差異。隨RES 濃度的增高卵母細胞第一極體排出率有下降的趨勢，添加5.0 μmol/L RES 顯著降低卵母細胞第一極體排出率。結果表明，5.0 μmol/L RES 對卵母細胞核成熟有抑制作用。

表1 不同濃度的白藜蘆醇對綿羊卵丘細胞擴展的影響

2.2 添加不同濃度的白藜蘆醇對卵母細胞質內ROS 水平的影響 如表2 和圖1 所示，添加0.5 μmol/L RES 顯著降低細胞胞質內ROS 含量；5.0 μmol/ RES 組的ROS 水平顯著高于對照組。由此可知，添加0.5 μmol/L RES 可以顯著改善IVM 綿羊卵母細胞氧化還原狀態(tài)；5.0 μmol/L RES 對細胞成熟有負面作用。

表2 不同濃度的白藜蘆醇對綿羊卵母細胞質內ROS 水平的影響

圖1 白藜蘆醇對成熟后卵母細胞ROS 和GSH 含量的影響（10x10）

2.3 添加不同濃度的白藜蘆醇對細胞內GSH 水平的影響如表3 所示，IVM 液中添加0.5 μmol/L RES 顯著提高卵母細胞胞質內GSH 含量，高濃度處理組5.0 μmol/L RES 細胞胞質內GSH 含量顯著低于對照組；隨RES 濃度增加綿羊卵母細胞內GSH 含量有逐漸下降的趨勢。因此，最佳添加濃度0.5 μmol/L RES 可以顯著增強綿羊卵母細胞IVM 的抗氧化能力，促進綿羊卵母細胞細胞質成熟。

表3 不同濃度的白藜蘆醇對綿羊卵母細胞質內GSH 水平的影響

3 討 論

IVM 后卵母細胞排出第一極體是細胞核成熟的標志[10]，細胞胞質內的GSH 含量是細胞胞質成熟程度的一個特異性指標[11]。RES 屬于高效抗氧化劑，在細胞內發(fā)揮著重要作用。本研究表明，在綿羊卵母細胞IVM 培養(yǎng)液中添加不同濃度RES 對卵母細胞核質成熟有顯著影響。在IVM 液中添加0.5 μmol/L RES 顯著改善卵母細胞體外成熟能力，促進卵丘細胞擴展及第一極體的形成；高濃度5.0 μmol/L RES 試驗組顯著降低細胞核成熟率。此結果與Zabihi 等[7]研究結果相同，濃度為0.5 μmol/L RES 對綿羊卵母細胞核成熟的效果最佳，高濃度5.0 μmol/L RES 有抑制細胞體外成熟的趨勢。Liu 等[12]研究發(fā)現(xiàn)在老齡小鼠和人類卵母細胞成熟液中添加1.0 μmol/L RES 顯著提高第一極體排出率，顯著改善紡錘體和染色體的正常形態(tài)；此外，增強老齡小鼠卵母細胞中SIRT1、CAT、SOD1 和GPX4 等基因的表達模式。Wang 等[8]研究表明，1.0 μmol/L RES 能顯著促進牛卵丘擴展和極體形成，提高卵母細胞體外受精后囊胚率、孵化囊胚率和囊胚細胞數(shù)。

本研究報道，0.5 μmol/L RES 顯著降低細胞胞質內ROS 含量，提高GSH 含量，從而提高卵母細胞體外成熟能力。高濃度5.0 μmol/L RES 增加胞質內ROS 含量，而降低卵母細胞質量。Mukherjee 等[6]得到了相同的研究結果，在IVM 培養(yǎng)基中添加0.25 μmol/L 和0.5 μmol/L RES 可促進山羊卵母細胞細胞質成熟，減少細胞ROS含量并提高細胞GSH 含量。而Li 等[13]研究報道，添加2.0 μmol/L RES 不僅改善豬體外熱應激條件的卵母細胞核成熟，而且提高卵母細胞GSH 水平，降低ROS水平，并可上調卵母細胞內SIRT1 基因的表達量。Kwak 等[14]研究得出，適宜濃度的RES 能夠增加細胞內GSH 含量并降低ROS 含量，從而提高豬卵母細胞體外成熟和體外受精胚胎的發(fā)育潛能，同時調節(jié)卵母細胞成熟相關基因的表達。在豬卵母細胞玻璃化冷凍保存液中添加RES 對未成熟卵母細胞的損傷及卵母細胞內ROS 和GSH 含量無影響，但在玻璃化冷凍后的豬卵母細胞IVM 液中添加2.0 μmol/L RES 顯著提高存活卵母細胞發(fā)育到囊胚期的發(fā)育能力[15]。陳培芳[16]研究表明，低氧培養(yǎng)條件下，適量濃度的RES 顯著提高小鼠2-細胞、4-細胞和囊胚內抗氧化相關GPX 1、Mn-SOD、PRDX3、GLS2等基因的表達。添加1.0 μmol/L RES能夠誘導牛卵母細胞孕激素分泌和降低胞內ROS 水平、提高GSH 水平，并可能通過SIRT1 途徑提高牛卵母細胞成熟及體外受精后發(fā)育效率[8]。有研究報道[17]，RES可下調囊胚中促凋亡相關Caspase-3、Bcl-2等基因的表達，上調Bax基因的表達，進而預防細胞凋亡，及阻止因此引起的胚胎發(fā)育損傷。本實驗結果與前人研究結果差異可能與不同種類動物細胞在不同條件下對RES 的敏感性有關。目前，RES 對綿羊早期胚胎發(fā)育及卵母細胞凋亡mRNA 水平的影響是本實驗下一步的研究計劃。

4 結 論

綿羊卵母細胞IVM 液中添加0.5 μmol/L RES 能夠促進卵丘細胞的擴展及第一極體的形成，而提高卵母細胞核成熟。同時，降低細胞內ROS 含量及提高GSH 含量，并通過提高細胞抵抗氧化能力促進細胞胞質成熟及提高細胞胞質質量；高濃度5.0 μmol/L RES 對綿羊卵母細胞成熟有抑制作用。