不同產(chǎn)奶量和乳蛋白率奶牛的血液生化和激素水平分析

武雪會，孫會增，王迪銘，薛茗元，劉建新

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

產(chǎn)奶量（Milk Yield，MY）和乳蛋白率（Milk Protein Content，MP）是衡量奶牛泌乳性能的重要指標(biāo)，直接影響奶業(yè)利潤。以往多從育種、營養(yǎng)和管理角度研究如何提高奶牛的泌乳性能[1]，而從奶牛自身生理代謝角度的研究較少。血液生化指標(biāo)可反映奶牛的能量代謝狀態(tài)和生理變化[2]，與泌乳性能密切相關(guān)[3]。據(jù)報(bào)道，泌乳前期血中非酯化脂肪酸（Non-esterified Fatty Acids，NEFA）和血尿素氮與MY 顯著正相關(guān)，血鈣與MY 顯著負(fù)相關(guān)；泌乳中后期血尿素氮與MP 顯著負(fù)相關(guān)[3]。但上述研究檢測指標(biāo)少（NFEA、血尿素氮、鈣、磷和堿性磷酸酶），不能滿足對奶牛系統(tǒng)性生理研究的需要。一直以來，激素對奶牛泌乳性能的研究多通過體外細(xì)胞試驗(yàn)或外源激素在體試驗(yàn)進(jìn)行探究[4]，缺乏正常生理狀態(tài)下奶牛自身分泌激素的調(diào)控作用研究。Fiore 等[5]報(bào)道，圍產(chǎn)期和泌乳早期的水牛，MY 與胰島素、甲狀腺刺激激素顯著正相關(guān)。但上述研究圍繞水牛的特殊生理階段，忽略了平穩(wěn)生理階段（泌乳中期）激素對泌乳的調(diào)控。

為研究奶牛自身生理代謝對MY、MP 的影響，本研究在排除奶牛品種、日糧、管理等因素的前提下，以高低MY、MP 的泌乳中期荷斯坦奶牛為研究對象，分析其血液生化指標(biāo)和激素水平，進(jìn)一步結(jié)合大群奶牛（n=287）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為深入挖掘與奶牛MY 或MP 有關(guān)的生理代謝機(jī)制提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)動(dòng)物為選自杭江奶牛場的287 頭健康、體況良好的經(jīng)產(chǎn)泌乳中期荷斯坦奶牛，日糧、管理?xiàng)l件一致。奶牛采用栓系式飼養(yǎng)，牛棚通風(fēng)良好，管道式擠奶。以全混合日糧飼喂，日糧精粗比為57∶43，分別在06:30、14:00、20:00 飼喂和擠奶各3 次，自由飲水。試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以287 頭荷斯坦奶牛為對象，選取極高、極低MY 牛各20 頭，分別設(shè)為高M(jìn)Y 組和低MY 組，2 組間乳成分、胎次和泌乳天數(shù)差異不顯著（表2）；選取極高、極低MP 牛各20 頭，分別設(shè)為高M(jìn)P 組和低MP 組，2 組間的產(chǎn)奶量、其他乳成分、胎次和泌乳天數(shù)差異不顯著（表3），分析2 組牛的血液生化指標(biāo)和血清激素水平差異。以287 頭奶牛的試驗(yàn)數(shù)據(jù)為對象，進(jìn)行血液生化指標(biāo)、激素指標(biāo)與奶牛MY、MP 的關(guān)聯(lián)分析。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表2 高、低MY 奶牛的奶產(chǎn)量和乳成分（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

表3 高、低MP 奶牛的奶產(chǎn)量和乳成分（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

1.3 樣品采集 于早晚飼喂前（05:30、19:00）采集飼料樣約500 g，置于自封袋并做好標(biāo)記，凍存于-20℃用于日糧營養(yǎng)組成測定。使用連接有采樣器的擠奶器（WAIKATO，新西蘭）測定奶牛的產(chǎn)奶量，每頭牛使用離心管采集奶樣50 mL，按照早∶中∶晚為4∶3∶3 的比例混勻，采樣前離心管中添加防腐劑（萬分之六重鉻酸鉀），置于4℃用于乳成分測定。晨飼前（04:00—06:00）使用加有促凝劑的血清管采集頸靜脈血10 mL，置于冰上靜置分層后，立即在4℃下，3 000×g 離心15 min得到血清，分裝后凍存于-80℃，用于測定血液生化指標(biāo)和血清激素。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 飼料常規(guī)營養(yǎng)成分 采集的飼料樣稱重取500 g，于65℃下烘48 h，回潮稱重后粉碎，先后過2 mm 篩和1 mm 篩，自封袋封裝并做好標(biāo)記，置于4℃。按照AOAC 方法[7]測定干物質(zhì)（105℃，5 h）、粗蛋白質(zhì)（988.05）、粗脂肪（920.39）、酸性洗滌纖維（973.18）、鈣和磷含量，并分析中性洗滌纖維含量[8]。

1.4.2 產(chǎn)奶量和乳成分 采樣前兩天和采樣當(dāng)天測定產(chǎn)奶量，取平均值用于后續(xù)分析。利用紅外線法[9]（Foss-4000；Foss 公司，丹麥）測定乳蛋白、乳脂、乳糖、乳尿素氮、總固形物含量和體細(xì)胞數(shù)。

1.4.3 血液生化指標(biāo) 取500 μL 血清，進(jìn)行分析。使用UNICO 7200 可見分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）測定吸光度，計(jì)算血尿素氮、總蛋白、白蛋白、血糖、NEFA、β-羥基丁酸、肌酐、丙二醛濃度；超氧化物歧化酶酶活測定以每毫升反應(yīng)液中超氧化物歧化酶抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的量為1 個(gè)酶活力單位；谷胱甘肽過氧化物酶酶活以每0.1 mL 血清在37℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中谷胱甘肽濃度降低1 μmol/L 為1 個(gè)酶活力單位；總抗氧化能力以37℃時(shí)，每分鐘每毫升血清使反應(yīng)體系的吸光度值增加0.01 時(shí)，為1 個(gè)總抗氧化能力單位。使用DG5033A 酶標(biāo)儀（南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療設(shè)備有限公司）在510 nm 處測定吸光度，配合相應(yīng)的比色試劑盒（南京建成生物工程研究所）計(jì)算總膽固醇（Total Cholesterol，TCH）和甘油三酯濃度。

1.4.4 血清激素 取500 μL 血清，使用DG5033A 酶標(biāo)儀配合相應(yīng)的比色試劑盒（江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司）應(yīng)用雙抗體夾心法分別在450 nm 處測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中的胰島素、胰高血糖素、胰島素樣生長因子-1（Insulin-like Growth Factor-1，IGF-1）、皮質(zhì)醇、胃饑餓素和瘦素濃度，根據(jù)公式計(jì)算胰島素敏感性指數(shù)（the Revised Quantitative Insulin Sensitivity Check Index，RQUICKI）[10]：

RQUICKI=1/[log 血糖（mg/dL）+log 胰島素（μU/mL）+log 非酯化脂肪酸（mmol/L）]

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2013 初步統(tǒng)計(jì)后，采用SAS 9.2（SAS Institute，2000）中的MIXED 模型，將分組作為固定效應(yīng)，對胎次、泌乳天數(shù)進(jìn)行單因素方差分析；同樣采用MIXED 模型將分組、胎次、泌乳天數(shù)作為固定效應(yīng)對奶產(chǎn)量、乳成分、血液生化參數(shù)和激素指標(biāo)進(jìn)行三因素方差分析，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示；表格中僅列出分組因素（主效應(yīng)）的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（P值）；統(tǒng)計(jì)差異性定義為P＜0.05，極顯著差異定義為P＜0.01，差異趨勢定義為0.05＜P＜0.01。應(yīng)用R 3.5.1 進(jìn)行Spearman 關(guān)聯(lián)分析，顯著關(guān)聯(lián)定義為P＜0.05，極顯著關(guān)聯(lián)定義為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 高低MY 牛的血液生化參數(shù)和激素水平 高低MY牛的產(chǎn)奶量分別為41.1 kg/d 和25.4 kg/d（P＜0.01）（表2）。由表4 可知，高M(jìn)Y 牛的血尿素氮濃度低于低MY 牛（P＜0.01），而血清總蛋白（P＜0.05）、白蛋白（P＜0.05）和TCH（P＜0.01）濃度高于低MY 牛，其他血液生化參數(shù)在2 組間不存在顯著差異。由表5 可知，高M(jìn)Y 組的胰高血糖素（P＜0.01）、IGF-1（P＜0.05）和瘦素（P＜0.05）濃度低于低產(chǎn)MY 牛，其他激素在2組間不存在顯著差異。

2.2 高低MP 奶牛的血液生化參數(shù)和激素水平 高低MP組的MP 分別為3.51% 和2.75%（P＜0.01）（表3）。分析發(fā)現(xiàn)，高M(jìn)P 牛的血尿素氮（P＜0.05）和白蛋白（P＜0.05）濃度高于低MP 牛，其他血液生化指標(biāo)在2組間無顯著差異（表6）。由表7 可見，高、低MP 奶牛的激素水平無顯著差異。

表4 高、低MY 奶牛的血液生化參數(shù)

表5 高、低MY 奶牛的激素水平

表6 高、低MP 奶牛的血液生化參數(shù)

表7 高、低MP 奶牛的血清激素水平

2.3 奶牛MY 和MP 與差異血液生化參數(shù)和激素的關(guān)聯(lián)分析 由表8 可知，高低MY 組的血液生化指標(biāo)中，總膽固醇（r=0.357）、丙二醛（r=0.211）、總抗氧化能力（r=0.153）與MY 正相關(guān)（P＜0.01），血糖（r=-0.211，P＜0.01）、血尿素氮（r=-0.147，P＜0.05）、肌酐（r=-0.146，P＜0.05）與MY 負(fù)相關(guān)。高低MP 牛的血液生化指標(biāo)中，血糖（r=0.153，P＜0.01）、肌酐（r=0.228，P＜0.01）、總膽紅素（r=0.199，P＜0.01）、血尿素氮（r=0.125，P＜0.05）與MP 正相關(guān)，總蛋白與MP 負(fù)相關(guān)（r=-0.201，P＜0.01）。其他血液生化指標(biāo)、所有的檢測激素與MY、MP 均不存在顯著相關(guān)性，未列入表8。

表8 287 頭奶牛MY、MP 與血液生化參數(shù)的關(guān)聯(lián)分

3 討 論

3.1 影響奶牛MY 的血液生化參數(shù)和激素水平 本研究中血尿素氮和總膽固醇在高低MY 組間存在顯著差異，同時(shí)經(jīng)擴(kuò)群關(guān)聯(lián)分析顯示與奶牛MY 顯著相關(guān)，而且差異分析和關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果趨勢一致。血尿素氮在高、低MY 牛的差異趨勢與Ahn 等[11]報(bào)道的結(jié)論相反。血尿素氮作為評價(jià)奶牛蛋白代謝狀態(tài)的指標(biāo)，受日糧蛋白質(zhì)含量與氨基酸組成、瘤胃降解能力、肝腎功能、肌肉代謝的影響[2]。本研究所有試驗(yàn)牛飼喂相同日糧，而且高、低MY 組奶牛的MP 無顯著差異，提示低MY ?？赡芫邆漭^高的瘤胃降解蛋白能力，產(chǎn)生過量的氨未被利用合成更多的微生物蛋白（Microbial Protein，MCP），而是通過肝臟解毒轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩剡M(jìn)入到血液，造成血尿素氮濃度顯著高于高M(jìn)Y 牛?？偰懝檀际呛饬磕膛Ｄ芰繝顟B(tài)的指標(biāo)[2]，與脂質(zhì)動(dòng)員供能有關(guān)。奶牛機(jī)體首先利用血糖為泌乳供能，而高M(jìn)Y 牛需要更多的能量維持泌乳，容易造成血糖供應(yīng)不足（高M(jìn)Y 牛體內(nèi)血糖濃度數(shù)值上低于低MY 牛），進(jìn)而促發(fā)機(jī)體脂質(zhì)動(dòng)員，造成高M(jìn)Y牛總膽固醇濃度顯著高于低MY 牛。另一方面，總膽固醇參與類固醇激素的生物合成[12]，但本研究中皮質(zhì)醇作為固醇類激素，在2 組奶牛間不存在顯著差異，間接證明了2 組牛血清總膽固醇的差異主要與脂質(zhì)動(dòng)員供能有關(guān)。

此外，血清總蛋白在高、低MY 組的差異趨勢與Pazzola 等[13]的報(bào)道一致。Nozad 等[14]報(bào)道，血清肌酐水平可用于預(yù)測奶牛MY 和乳品質(zhì)，證實(shí)了肌酐與奶牛MY 存在相關(guān)性。丙二醛作為體內(nèi)自由基作用下脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，常被用作反映機(jī)體不同程度氧化應(yīng)激的生物標(biāo)記物[15]，總抗氧化能力則反映機(jī)體總體的抗氧化水平；二者與奶牛MY 極顯著正相關(guān)可能提示隨奶牛MY 增加，機(jī)體泌乳應(yīng)激水平上升。

本研究中，高M(jìn)Y 組的胰高血糖素、胰島素樣生長因子-1 和瘦素濃度顯著高于低MY 組，但擴(kuò)群關(guān)聯(lián)分析顯示上述激素與奶牛的MY 相關(guān)性不顯著，提示單一激素在調(diào)控或反映奶牛MY 上可能存在一定局限性。胰高血糖素由胰島α細(xì)胞分泌，作用于肝細(xì)胞促進(jìn)糖原分解和糖異生以升高血糖。Bobe 等[16]報(bào)道，靜脈灌注胰高血糖素有降低奶牛MY 的趨勢，這與本研究中低MY 牛的胰高血糖素濃度高于高M(jìn)Y 牛的趨勢一致。本研究中高M(jìn)Y 組的胰島素顯著高于低MY 組，結(jié)合其較低的胰高血糖素水平，提示高M(jìn)Y 牛體內(nèi)葡萄糖代謝以分解代謝為主，大量葡萄糖分解為泌乳供能，這與其血清中較低的血糖水平相符。胰島素樣生長因子-1 主要由肝臟合成，其在血清中的濃度可以直接反映乳腺組織的營養(yǎng)供應(yīng)狀態(tài)[17]。本研究中高M(jìn)Y 牛的胰島素樣生長因子-1 濃度顯著低于低MY 牛，究其原因，IGF-1通過抑制生長激素的釋放減少營養(yǎng)物質(zhì)向泌乳的分配，進(jìn)而造成MY 下降[18]。瘦素主要由脂肪組織分泌，進(jìn)入血液循環(huán)后參與糖、脂及能量代謝的調(diào)節(jié)，降低采食量和體內(nèi)脂肪沉積，維持能量平衡，并具備調(diào)控繁育（黃體活動(dòng)、發(fā)情）、激活免疫細(xì)胞、調(diào)控乳腺發(fā)育和功能等作用[19]。Liefers 等[20]報(bào)道，泌乳期內(nèi)高M(jìn)Y 牛多處于能量負(fù)平衡，其血清瘦素濃度低于能量正平衡的牛。本研究中高M(jìn)Y 牛的瘦素濃度顯著低于低MY 牛，反映了高M(jìn)Y 牛對養(yǎng)分的需求更高；高M(jìn)Y 牛的高血清總膽固醇濃度證實(shí)了其需要?jiǎng)訂T體脂供能。

3.2 影響奶牛乳蛋白合成的血液生化參數(shù)和激素水平本研究4 個(gè)與蛋白代謝有關(guān)的血液生化指標(biāo)中，血尿素氮和白蛋白在2 組間存在顯著差異；同時(shí)血尿素氮和肌酐濃度與MP 顯著正相關(guān)，與Nozad 等[14]的研究結(jié)果一致。飼喂相同日糧條件下，高M(jìn)P 組血尿素氮濃度高可能與瘤胃降解蛋白速度超出了瘤胃MCP 的合成速度，促發(fā)肝臟合成尿素能力升高有關(guān)。白蛋白主要由肝臟合成，是一種負(fù)的急性期蛋白，當(dāng)營養(yǎng)不良、肝腎發(fā)生炎癥或感染性疾病時(shí)，其濃度下降[21]。Bobbo 等[22]報(bào)道，血清白蛋白水平與乳中體細(xì)胞數(shù)呈反比，將其作為乳腺感染或乳腺發(fā)生免疫反應(yīng)的指征物。另有研究發(fā)現(xiàn)，奶牛血清白蛋白是血液中類固醇、脂肪酸和甲狀腺激素的運(yùn)輸載體[23]。因此，高M(jìn)P 牛體內(nèi)較高的白蛋白水平可能有助于脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)供能，并促進(jìn)激素轉(zhuǎn)運(yùn)至靶器官發(fā)揮調(diào)控作用。肌酐是肌肉肌酸的代謝產(chǎn)物，可被瘤胃微生物利用合成MCP（乳蛋白前體物）[2]，因此高的血清肌酐水平可能會間接提高牛奶的MP，證實(shí)了本研究中血清肌酐水平與MP 的正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)與Nozad等[14]的研究結(jié)果一致。另有研究報(bào)道，母羊營養(yǎng)供給不足時(shí)，肌肉大量代謝以維持機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)，提高血糖和肌酐水平[24]。本研究中肌酐和血糖水平與奶牛MP呈顯著正相關(guān)關(guān)系，提示機(jī)體可能通過提高肌肉代謝為MP 合成提供間接底物和能量底物（血糖）。

本研究發(fā)現(xiàn)，在相同的日糧、管理和品種條件下，奶牛自身生理代謝的不同是造成其泌乳性能（MY、MP）差異的重要原因，血尿素氮與MY 顯著負(fù)相關(guān)，與MP 顯著正相關(guān)；總膽固醇與MY 極顯著正相關(guān)，可作為潛在的生理標(biāo)記物。張輝等[3]報(bào)道，血液生化指標(biāo)與泌乳性能的相關(guān)性與泌乳階段有關(guān)，并且二者的相關(guān)性在泌乳中后期較弱，這與本研究中相關(guān)系數(shù)較低的結(jié)果一致，提示后續(xù)試驗(yàn)或需借助代謝組學(xué)等手段，挖掘與奶牛MY 或MP 相關(guān)性更為顯著的代謝標(biāo)志物；同時(shí)可開展不同泌乳階段的研究，挖掘具有普適性地能夠反映奶牛MY 或MP 的血液生理標(biāo)志物。

4 結(jié) 論

在相同的日糧和管理?xiàng)l件下，高M(jìn)P 和低MP 組在血尿素氮、白蛋白濃度上存在顯著差異，提示其在氮代謝效率上的差異；而胰高血糖素、IGF-1 和瘦素濃度等參數(shù)的差異表明激素調(diào)控介導(dǎo)的糖代謝和能量供應(yīng)是造成奶牛產(chǎn)奶量不同的生理原因。血尿素氮與MY 顯著負(fù)相關(guān)，與MP 顯著正相關(guān)；總膽固醇與MY 呈極顯著正相關(guān)，可作為潛在的生理標(biāo)記物。