黃淮杜泊羊繁殖性能和FecB 基因多態(tài)性研究

李 君，劉永斌，馬馳騁，張子軍，李甲申，董鵬飛，張道江，權(quán) 凱*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；4.河南省舞陽縣畜牧局，河南舞陽 462400；5.?？h鑫林牧業(yè)有限公司，河南?？h 456282）

黃淮地區(qū)地處平原，灌溉條件便利，一直以來都是國家的重要產(chǎn)糧大區(qū)，屬于溫帶季風(fēng)氣候，氣候濕潤，陽光充足，非常適宜農(nóng)牧業(yè)發(fā)展。黃淮平原地區(qū)秸稈資源豐富，玉米秸稈、花生秸、豆秸年產(chǎn)量合計(jì)超過5 000 萬t，但有效利用率不到57%[1]。為調(diào)整國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，加速農(nóng)區(qū)草牧業(yè)發(fā)展，農(nóng)業(yè)部（現(xiàn)為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部）相繼出臺(tái)了《全國肉羊遺傳改良計(jì)劃（2015-2025）》和《全國草食畜牧業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2016-2020）》，計(jì)劃培育10 個(gè)以上繁殖性能高、生長發(fā)育快的專門化（滿足區(qū)域市場需求）肉羊新品種[2]，加快推進(jìn)聯(lián)合育種，支持和鼓勵(lì)企業(yè)、高校和科研機(jī)構(gòu)等成立聯(lián)合育種組織[3]。因此，發(fā)展黃淮地區(qū)肉羊產(chǎn)業(yè)符合國家政策和市場發(fā)展的需要，但黃淮平原地區(qū)目前還沒有相應(yīng)的地方專門化肉羊品種，因此，加速黃淮地區(qū)肉羊新品種培育迫在眉睫。

黃淮杜泊羊是由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院牽頭，采用傳統(tǒng)育種與基因育種相結(jié)合的方法，以小尾寒羊?yàn)槟副荆枚挪囱?、特克賽爾羊和薩?？搜?yàn)楦副荆?jīng)過雜交創(chuàng)新、橫交固定和群體擴(kuò)繁3 個(gè)階段培育出的適應(yīng)黃淮地區(qū)的專門化肉用高繁綿羊品種。黃淮杜泊羊肉用體型外貌特征明顯，早期生長發(fā)育快，飼料轉(zhuǎn)化率高，遺傳穩(wěn)定，在黃淮地區(qū)適合作為專門化肉羊品種進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化推廣。目前，黃淮杜泊羊擴(kuò)繁群數(shù)量6 萬余只，經(jīng)濟(jì)雜交群超過10 萬只。綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-IB（Bone Morphogenetic Protein Receptor-IB,BMPR-IB）基因編碼區(qū)發(fā)生突變（A746G），導(dǎo)致第249 位谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔斐删d羊排卵數(shù)增加，經(jīng)證明249R 就是FecB的等位基因[4-5]。目前研究最多的FecB基因，即是BMPR-IB 突變引起的。FecB基因突變通過增加排卵數(shù)來增加產(chǎn)羔數(shù)，在湖羊和小尾寒羊，F(xiàn)ecB是遺傳方式已知的多胎主效基因[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)黃淮杜泊羊繁殖性能指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采集血樣、提取DNA，對(duì)FecB基因進(jìn)行多態(tài)性分析，為黃淮杜泊羊新品種進(jìn)一步選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)于2017 年10 月—2018 年10 月在黃淮杜泊羊核心育種場（河南綠源肉羊發(fā)展有限公司，河南省鶴壁市浚縣鑫林牧業(yè)有限公司）進(jìn)行繁殖性能測定。黃淮杜泊羊FecB基因多態(tài)性由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院分子實(shí)驗(yàn)室分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為符合黃淮杜泊羊品種標(biāo)準(zhǔn)的育種核心群羊只，其中包括642 只初產(chǎn)母羊和1 684 只經(jīng)產(chǎn)母羊，其繁殖性能評(píng)價(jià)指標(biāo)和測定參照權(quán)凱[8]《羊繁殖管理指標(biāo)的測定》執(zhí)行；所有母羊發(fā)情鑒定、人工授精和妊娠診斷參照權(quán)凱[9]《羊人工授精操作流程》執(zhí)行。整理收集1 年內(nèi)642 只初產(chǎn)母羊和1 684 只經(jīng)產(chǎn)母羊的發(fā)情、發(fā)情周期、發(fā)情持續(xù)期、人工授精、產(chǎn)羔等記錄。

1.2.2 主要試劑 血液基因組DNA 提取試劑盒、DNA聚合酶、DNA Marker、瓊脂糖等均購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶AvaⅡ購自NEB 公司。

1.3FecB基因多態(tài)性分析

1.3.1 血液采集和DNA 提取 黃淮杜泊羊核心群血樣145份，其中初產(chǎn)母羊30 只，經(jīng)產(chǎn)母羊115 只，頸靜脈采血，肝素鈉抗凝，采血后，顛倒混勻防止血液凝固，-20℃保存。按照全血DNA 提取試劑盒操作說明提取血液基因組DNA，經(jīng)NANDROP 2000 檢測OD260/280，檢測合格的DNA 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增FecB基因（GenBank 登錄號(hào)：NM_001009431.1）檢測方法參照儲(chǔ)明星等[10]制定的綿羊多胎主效基因FecB 分子檢測方法，利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物，其預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為140 bp，上游引物序列為：5’-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3’；下游引物序列為：5’-CAAGATGTTTTCATGCCTCAT CAACACGGTC-3’，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增體 系（20 μL）：2×Taq PCR mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，模板DNA（20～30 ng/μL）1 μL，ddH2O 補(bǔ) 足20 μL 體 系。PCR 擴(kuò) 增 條 件：94 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，33 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。

1.3.3 RFLP 分析 用AvaⅡ限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為15 μL：PCR 產(chǎn)物5 μL，10×Buffer 1.5 μL，AvaⅡ限制性內(nèi)切酶1 μL，去離子水7.5 μL。酶切反應(yīng)條件為37℃水浴4 h。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用 Excel 2010 統(tǒng)計(jì)黃淮杜泊羊FecB的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度和有效等位基因數(shù)，并進(jìn)行 Hardy-Weinberg 平衡檢測。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析（ANOVA）中的LSD 法對(duì)黃淮杜泊羊基因型與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)情特征 經(jīng)觀察，黃淮杜泊羊發(fā)情周期平均為（19.3±2.8）d，發(fā)情持續(xù)期平均為33～46 h。黃淮杜泊母羊初次發(fā)情在150～170 日齡，即5～6 月齡；第二次發(fā)情達(dá)性成熟，在6～7 月齡。

2.2 發(fā)情季節(jié) 如表1 所示，黃淮杜泊羊全年均可發(fā)情配種，發(fā)情配種集中在秋季，其中10 月最多，占15.45%，發(fā)情季節(jié)從高到低依次是秋季（9—11 月）、春季（3—5 月）、冬季（12 月至次年2 月）、夏季（6—8 月），分別占41.85%、36.4%、34.15%、31.24%，黃淮杜泊羊季節(jié)性發(fā)情不明顯。

表1 黃淮杜泊羊不同月份發(fā)情統(tǒng)計(jì)

2.3 母羊年提供斷奶羔羊數(shù)

2.3.1 繁殖率 由表2 可知，初產(chǎn)羊產(chǎn)單羔數(shù)居多，占比63.77%，平均產(chǎn)羔數(shù)為1.38 只；經(jīng)產(chǎn)母羊產(chǎn)雙羔數(shù)最多，占比67.64%，平均產(chǎn)羔數(shù)為1.85 只；黃淮杜泊羊平均窩產(chǎn)羔數(shù)為1.76 只，年繁殖率為252.82%。

2.3.2 母羊年提供斷奶羔羊數(shù) 對(duì)3 992 只初生羔羊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)羔羊斷奶成活率為95.79%（3 824/3 992），每只母羊年提供斷奶羔羊數(shù)=斷奶羔羊數(shù)/母羊=3 824/1 602.17=2.39 只。

表2 黃淮杜泊羊產(chǎn)羔數(shù)

2.4FecB基因的遺傳多態(tài)性

2.4.1FecB基因的PCR-RFLP 分析 利用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)FecB基因目的片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖1 所示，擴(kuò)增出1 條特異性片段，擴(kuò)增區(qū)域與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致。將擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行RFLP 檢測，采用AvaⅡ限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切電泳分型，酶切后的片段經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分型結(jié)果見圖2。黃淮杜泊羊FecB基因存在3 種基因型，140/140 bp 為野生型（++型），140/110 bp 為雜合型（B+型），110/110 bp 為純合突變型（BB 型）。

圖1 FecB 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 FecB 基因擴(kuò)增產(chǎn)物Ava Ⅱ酶切結(jié)果

2.4.2FecB基因的遺傳多態(tài)性分析 對(duì)黃淮杜泊羊?qū)嶒?yàn)群體FecB基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），黃淮杜泊羊存在3 種基因型：純合突變型（BB型）、雜合型（B+型）和野生型（++）型，基因型頻率分別為0.082 8、0.606 9、0.310 3，且雜合型B+是群體中的優(yōu)勢基因型，有效等位基因數(shù)為1.901 5，雜合度為0.474 1，PIC 為0.361 7，即0.25＜PIC＜0.5，說明FecB基因位點(diǎn)在該群體是中度多態(tài)。χ2檢驗(yàn)顯示該位點(diǎn)基因型不符合Hardy-Weinberg 平衡（P＜0.05）。

2.4.3 不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析FecB不同基因型與黃淮杜泊羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（表4）表明，BB 基因型產(chǎn)羔數(shù)比B+基因型多0.26 只，但差異不顯著，BB 基因型比++基因型多0.72 只，差異極顯著；B+基因型比++基因型產(chǎn)羔數(shù)多0.46 只，差異極顯著。

3 討 論

3.1 黃淮杜泊羊發(fā)情特性 黃淮杜泊羊初次發(fā)情期是5～6 月齡，性成熟為6～7 月齡，發(fā)情周期為19.3 d，發(fā)情持續(xù)期為33～46 h，其發(fā)情特征與中國地方品種小尾寒羊和湖羊基本一致[11]。黃淮杜泊羊發(fā)情期早于國外引入肉羊品種和國內(nèi)其他綿羊品種[12-13]，如目前引入品種杜泊羊、薩?？搜颉⑻乜速悹栄?、無角道賽特羊等初情期均為6 月齡以上、性成熟8 月齡以上，且薩?？搜蚝吞乜速悹栄虺尸F(xiàn)季節(jié)性發(fā)情[13]；國內(nèi)無論巴美肉羊等培育品種，還是蒙古羊、阿勒泰羊等地方品種，發(fā)情配種均在8 月齡以上，每年一胎且以單羔為主[14]。從發(fā)情季節(jié)來看，黃淮杜泊羊季節(jié)性發(fā)情不明顯，呈全年性發(fā)情特征，年發(fā)情配種率143.65%，說明其可以實(shí)現(xiàn)2 年3 胎。

3.2 黃淮杜泊羊產(chǎn)羔性能 黃淮杜泊羊平均窩產(chǎn)羔數(shù)為1.76 只，年繁殖率為252.82%，其繁殖率與小尾寒羊、湖羊等中國地方高繁綿羊品種接近[15]，且遠(yuǎn)高于杜泊羊、特克賽爾羊、薩?？搜颉o角道賽特羊和夏洛萊羊等國外引入肉羊品種[16]。黃淮杜泊羊羔羊斷奶成活率為95.79%，每只母羊年提供斷奶羔羊數(shù)2.39 個(gè)，高于小尾寒羊、湖羊和巴美肉羊等中國地方品種和培育品種[17-18]。

表3 FecB 基因型頻率、等位基因頻率及群體遺傳特性

表4 黃淮杜泊羊基因型與產(chǎn)羔數(shù)分析

母羊年提供斷奶羔羊數(shù)不僅反映了品種的繁殖率，也反映了品種的環(huán)境適應(yīng)性、母性及羔羊的飼養(yǎng)管理水平，因此，結(jié)果充分驗(yàn)證了黃淮杜泊羊的高繁殖性能，也體現(xiàn)了其對(duì)黃淮平原環(huán)境的適應(yīng)性，說明黃淮杜泊羊在繁殖性能方面符合黃淮平原地區(qū)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展所需的專門化肉羊品種標(biāo)準(zhǔn)。

3.3FecB基因的遺傳多態(tài)性FecB基因是影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，可作為分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選育。郭慧慧等[19]對(duì)杜寒F1代進(jìn)行了多胎候選基因檢測，發(fā)現(xiàn)杜寒綿羊FecB基因存在3 種基因型，雜合型B+為優(yōu)勢基因型，且BB 和B+基因型個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于++型個(gè)體。Mishra 等[20]發(fā)現(xiàn)在卡羅爾羊與馬爾普拉羊雜交F1代中有78.4% 的個(gè)體中存在基因型為B+的FecB基因，并且其中55%可以繁殖出具有多胎性狀的羔羊。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃淮杜泊羊FecB基因存在3種基因型，BB 型、B+型和++型，基因型頻率分別為0.082 8、0.606 9、0.310 3，雜合型B+是群體中的優(yōu)勢基因型，且BB 基因型產(chǎn)羔數(shù)比B+基因型多0.26 只，BB 基因型比++基因型多0.72 只，B+基因型比++基因型產(chǎn)羔數(shù)多0.46 只，該結(jié)果從基因?qū)用骝?yàn)證了黃淮杜泊羊多胎性，為下一步品種繁殖率的提升提供理論支撐，也為品種的選育和改良提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

黃淮杜泊羊具有性成熟早、多胎高繁的特性，其初情期為5～6 月齡、年繁殖率為252.82%、每只母羊年提供斷奶羔羊數(shù)2.39 只。黃淮杜泊羊FecB 雜合型B+是群體中的優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.606 9，B+型窩產(chǎn)羔數(shù)比++基因型高0.46 只。