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    基于600K SNP 芯片技術(shù)對(duì)寧海黃雞和廣西黃雞繁殖性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

    2019-11-27 08:47:52曹海月譚雨革董信陽毛海光馬有智姜俊保尹兆正
    中國(guó)畜牧雜志 2019年11期
    關(guān)鍵詞:黃雞寧海染色體

    曹海月,譚雨革,董信陽,毛海光,馬有智,盧 磊,姜俊保,尹兆正*

    (1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058;2.寧波市振寧牧業(yè)有限公司,浙江寧波 315600)

    全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-Wide Association Study,GWAS)是指在全基因組范圍內(nèi)找出存在的序列變異,即單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs),并從中篩選出與目的性狀相關(guān)的SNPs。GWAS 研究最先被應(yīng)用于醫(yī)學(xué),Klein 等[1]在《Science》雜志上首次發(fā)表了利用GWAS 研究人類視網(wǎng)膜黃斑病的文章,自此之后,GWAS 被廣泛應(yīng)用于人類疾病致病基因的篩選,并成功鑒定了糖尿病、抑郁癥等疾病的主要致病基因[2-3]。近年來,GWAS 開始逐漸應(yīng)用于畜禽數(shù)量性狀的研究,鑒定出大量與豬繁殖性狀、雞生長(zhǎng)及蛋品質(zhì)等性狀相關(guān)的候選基因[4-6]。隨著高通量測(cè)序和高分辨代謝檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展,以及多種生物信息學(xué)技術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法發(fā)展,使復(fù)雜性狀基因變異的定位更加準(zhǔn)確,為畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀主效基因和疾病性狀致病基因挖掘提供了更加有效的方法[7]。

    寧海黃雞和廣西黃雞是我國(guó)南方地區(qū)的2 個(gè)優(yōu)質(zhì)地方雞種,相比而言,寧海黃雞產(chǎn)蛋率高,廣西黃雞生長(zhǎng)速度快。由于表型差異通常由基因差異引起,因此探究影響2 個(gè)品種性狀特征的基因?qū)⒂欣诘胤狡贩N雞的遺傳改良和配套利用。前人研究表明,雞的大多數(shù)性狀受多個(gè)微效基因控制[8]。近年來,GWAS 被大量應(yīng)用于中低密度的單核苷酸多態(tài)性與雞生長(zhǎng)、繁殖性狀相關(guān)性的研究[9-10]。高密度(600K)的基因芯片可以使目標(biāo)基因的篩選更加準(zhǔn)確有效[11],但其目前主要應(yīng)用于雞體重、疾病和脂肪沉積等方面的研究[6,12-13]。為此,本研究采用雞600K SNP 芯片技術(shù)對(duì)寧海黃雞和廣西黃雞進(jìn)行基因分型和GWAS 分析,篩選鑒定與繁殖性狀相關(guān)的SNP 位點(diǎn)和候選基因。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 寧海黃雞和廣西黃雞種母雞各59 只由浙江省寧波市振寧牧業(yè)有限公司提供,個(gè)體籠養(yǎng),營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件一致,其中產(chǎn)蛋期光照時(shí)間每天14 h。

    1.2 性狀測(cè)定 記錄每只母雞在300 日齡內(nèi)的產(chǎn)蛋數(shù)(Egg Number at the Age of 300 d,EN300)。28~29周齡為選留下一代種蛋期,依據(jù)種蛋大小、形狀和蛋殼厚度等選出合格種蛋,然后轉(zhuǎn)移到機(jī)器孵化器進(jìn)行系譜孵化。記錄每只母雞28~29 周齡合格種蛋的總數(shù),記為入孵蛋數(shù)(Setting Eggs,SE)。在孵化第5 天,照蛋除去未受精的蛋,記錄每只母雞剩余受精蛋的數(shù)量,并將其與對(duì)應(yīng)母雞產(chǎn)蛋數(shù)的比率計(jì)為受精率(Fertility Rate,F(xiàn)R)。孵化至第18 天時(shí),把孵化器里的受精蛋移到出雛器里繼續(xù)孵化,統(tǒng)計(jì)移盤數(shù)并記為移盤數(shù)(Transferring Eggs,TE)。在出殼當(dāng)天,將每只母雞的雛雞數(shù)計(jì)為出雛數(shù)(Hatching Number,HN),將未孵化出雛雞的受精蛋的數(shù)量計(jì)為死胚蛋數(shù)(Addle Egg Number,AE)。將出雛數(shù)與入孵蛋數(shù)及受精蛋數(shù)的比例分別計(jì)為入孵蛋孵化率(Hatchability Of Setting Eggs,HSE)和受精蛋孵化率(Hatchability Of Fertile Eggs,HFE)。

    1.3 基因分型和數(shù)據(jù)質(zhì)控 雞頸靜脈采血并儲(chǔ)存在-20℃。依據(jù)制造商說明,使用Genome DNA Extraction Kit(天根生化科技有限公司,中國(guó)北京)提取基因組DNA,并稀釋至50~100 ng/μL。SNP 芯片試驗(yàn)的基因組DNA 應(yīng)達(dá)到以下條件:采用NanoDrop2000 紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD 值,A260/A280在1.8~2.1;用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,條帶清晰,且長(zhǎng)度大于10 kb。將合格的DNA 送紐勤生物科技(上海)有限公司進(jìn)行雞600K SNP 芯片檢測(cè)和基因分型。采用PLINK(v1.09)進(jìn)行基因型數(shù)據(jù)的質(zhì)控[14]。

    1.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用PLINK(v1.09)軟件對(duì)所有樣本的600K 芯片掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,剔除SNPs 檢出率小于90% 且哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)P<1×10-6(卡方檢驗(yàn))和最小等位基因頻率(MAF)≤0.05 的SNPs,剔除分型成功率小于90% 的樣品。使用SPSS 20.0 對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用PLINK v1.09 中的主成分分析法(Principal Component Analysis,PCA)對(duì)兩個(gè)群體進(jìn)行群體分層評(píng)估,使用PLINK(v1.09)的線性模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,所用模型:

    其中,Y 是性狀表型值向量;β是表型均值、SNPs、群體結(jié)構(gòu)(校正群體結(jié)構(gòu)時(shí),使用前5 個(gè)主成分作為協(xié)變量)3 個(gè)固定效應(yīng)向量;X 是β 的關(guān)聯(lián)矩陣;e 是殘差效應(yīng)向量,e~ N(0,Iσ2e),其中I 是單位陣,Iσ2e是隨機(jī)殘差方差,最終,每個(gè)SNP 位點(diǎn)都能得到一個(gè)關(guān)聯(lián)值。為減少多重檢驗(yàn)帶來的假陽性率,以Bonferroni 校正法[15]對(duì)全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的P值進(jìn)行校正。此處獨(dú)立檢驗(yàn)數(shù)計(jì)算使用PLINK(v1.09)中的“indeppairwise 25 5 0.2”命令(即以25 個(gè)SNPs 為一個(gè)窗口,5 個(gè)SNP 為步移,r2閾值為0.2),估算出連鎖不平衡(LD)塊和單個(gè)獨(dú)立SNP 數(shù)目為149 653,因此Bonferroni校正的達(dá)5% 基因組水平顯著的P 值閾值為3.341E-07(0.05/149653),即P值低于此閾值的SNPs 則被認(rèn)為與繁殖性狀顯著關(guān)聯(lián);達(dá)到基因組水平潛在關(guān)聯(lián)的P值閾值為6.682E-06(1/149653),即P值低于此閾值的SNPs 則被認(rèn)為與繁殖性狀潛在關(guān)聯(lián)。使用R 軟件作Quantile-Quantile(QQ)圖和曼哈頓圖。

    2 結(jié)果

    2.1 表型值的描述性統(tǒng)計(jì) 如表1 所示,寧海黃雞和廣西黃雞的EN300、SE、TE 和HN 存在極顯著差異。

    2.2 基因分型和數(shù)據(jù)質(zhì)控 剔除SNP 檢出率小于90%的位點(diǎn)5 604 個(gè)、哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)P<1×10-6(卡方檢驗(yàn))的位點(diǎn)2 734 個(gè),剔除MAF ≤ 0.05 的SNP 位點(diǎn)78 879 個(gè),剔除分型成功率小于90%的樣品0 個(gè),剩余495 704 個(gè)SNPs 118 個(gè)樣本可用于后續(xù)與繁殖性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析。獨(dú)立SNPs 計(jì)算后,共得到獨(dú)立SNPs 標(biāo)記和Block 模塊149 653 個(gè)。通過統(tǒng)計(jì)基因組每100 K 范圍內(nèi)的SNP 數(shù),得到SNPs 在基因各染色體上的分布情況(圖1),結(jié)果顯示基于高密度芯片技術(shù)檢測(cè)到的SNPs 在染色體上分布均勻,SNPs 數(shù)據(jù)可靠。

    表1 寧海黃雞和廣西黃雞繁殖性狀的描述性統(tǒng)計(jì)

    圖1 質(zhì)控后的SNPs 標(biāo)記在各染色體上的分布情況

    2.3 群體層化分析 在GWAS 分析中,群體分層會(huì)導(dǎo)致分析的結(jié)果出現(xiàn)假陽性,但主成分分析結(jié)果顯示,在2個(gè)雞群體中未顯示明顯的亞群結(jié)構(gòu)(圖2),并且繁殖性狀的Quantile-Quantile 圖結(jié)果顯示,觀測(cè)值(縱坐標(biāo))和期望值(橫坐標(biāo))基本吻合(圖3),說明關(guān)聯(lián)分析不會(huì)因?yàn)槿后w分層而產(chǎn)生假陽性,基于線性模型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果可靠。

    圖2 群體結(jié)構(gòu)主成分分析圖

    2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析 繁殖性狀的曼哈頓圖見圖4,共有4 個(gè)SNPs 與繁殖性狀的相關(guān)性達(dá)到Bonferroni 校正的5%基因組顯著性水平,其中rs313221983 和rs314844182影響AE,rs14758703 影響FR,rs312721292 影響HSE,rs314844182 和rs312721292 影響HFE。在每個(gè)顯著的SNP 位點(diǎn)上、下游5 kb 內(nèi)尋找可能的候選基因,結(jié)果共找到3 個(gè)可能的候選基因,分別為唾液酸轉(zhuǎn)移酶1(ST8 alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2,8-sialyltransferase 1,ST8SIA1)基因,神經(jīng)外胚層皮質(zhì)1(Ectodermal-neural cortex 1,ENC1)基因和LOC101750905基因(表2)。

    3 討 論

    從本研究結(jié)果可知,寧海黃雞和廣西黃雞的EN300、SE、TE、HN 存在極顯著差異。此外,品種內(nèi)各個(gè)性狀都擁有較大的極值差距,顯示品種的遺傳多樣性得到了保持,這種多樣性將使GWAS 分析結(jié)果更加有效。本研究結(jié)果顯示,總共4 個(gè)SNPs 與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性達(dá)到了全基因組顯著性水平,其中rs313221983和rs314844182 位于1號(hào)染色體,rs14758703 位 于Z染色體,rs312721292 位于4 號(hào)染色體,值得注意的是,rs314844182 同時(shí)與AE、HFE 2 個(gè)性狀相關(guān)聯(lián),rs312721292 同時(shí)與HSE、HFE 2 個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)。之前的研究通過GWAS 已經(jīng)鑒定出了許多與雞繁殖性狀相關(guān)的QTL、候選區(qū)域和SNPs。對(duì)白色來航雞繁殖性狀進(jìn)行GWAS 分析發(fā)現(xiàn),7 號(hào)和13 號(hào)染色體上各有1 個(gè)SNP 分別與21~56 周的產(chǎn)蛋數(shù)和初產(chǎn)日齡顯著相關(guān)[16]。另外,有研究發(fā)現(xiàn)5 號(hào)染色體上29.5~46.9 Mb 區(qū)域與300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)和孵化率有關(guān)[10],并確定了5 號(hào)染色體上與21~26 周產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)的6 個(gè)基因座[17]。本研究結(jié)果所得到的與AE、FR、HSE 和HFE 顯著相關(guān)的SNPs 位于3 個(gè)候選基因的序列附近或內(nèi)部,分別是ST8SIA1、ENC1和LOC101750905。對(duì)ST8SIA1基因的報(bào)道主要在于其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用,Bobowski 等[18]研究表明,在人乳腺癌細(xì)胞中,ST8SIA1的表達(dá)量受雌二醇抑制,其核心啟動(dòng)子包含2 個(gè)推測(cè)的雌激素反應(yīng)元件,結(jié)合本研究結(jié)果表明,ST8SIA1基因是影響雞繁殖性狀的候選基因之一。ENC1主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá),編碼一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,在神經(jīng)細(xì)胞分化和凸起生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[19]。Kim 等[20]研究表明,在排卵前顆粒細(xì)胞中,ENC1 被促黃體生成素/人絨毛膜促性腺激素(LH/ hCG)誘導(dǎo)與F-肌動(dòng)蛋白物理結(jié)合,可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組織促進(jìn)顆粒細(xì)胞的分化,這與本研究結(jié)果不謀而合,ENC1基因可以作為影響雞繁殖性狀的候選基因之一。有關(guān)LOC101750905基因的報(bào)道目前較少,GWAS 研究表明,此基因下游的rs14490981位點(diǎn)對(duì)活體重、腳重、全凈膛重和半凈膛重4 個(gè)性狀顯著相關(guān)[21]。本研究表明,LOC101750905基因與雞繁殖性狀相關(guān)。今后尚需要進(jìn)一步研究ST8SIA1、ENC1和LOC101750905基因?qū)﹄uAE、FR、HSE 和HFE 的調(diào)節(jié)機(jī)制。

    圖3 繁殖性狀的Quantile-Quantile 圖

    表2 繁殖性狀達(dá)到5%基因組顯著水平的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

    圖4 繁殖性狀的曼哈頓圖

    4 結(jié) 論

    本研究采用600K SNP 芯片檢測(cè)及GWAS,發(fā)現(xiàn)了4 個(gè)SNPs 對(duì)寧海黃雞和廣西黃雞繁殖性狀關(guān)聯(lián)性達(dá)到Bonferroni 校正5%的全基因組顯著性水平,并檢測(cè)到了可能與AE、FR、HSE 和HFE 相關(guān)的3 個(gè)近端基因(ST8SIA1、ENC1和LOC101750905),為進(jìn)一步了解地方雞種繁殖性狀的遺傳基礎(chǔ)和基因組選擇提供了理論依據(jù)。

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