新昌宮廷黃雞遺傳多樣性及遺傳結構分析

王珍珍，黃玲玲，趙婉秋，李志梁，劉銀蘭，詹海琴，石孟達，田 勇，曾 濤，盧立志*

（1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321001；2.浙江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310023；3.福建農林大學動物科學學院，福建福州 350002；4.新昌縣宮廷黃雞繁育有限公司，浙江紹興 312530）

微衛(wèi)星是一種簡單重復的2～4 個核苷酸序列基序，兩側有獨特的序列，由于它們是共顯性的，可以檢測到高水平的等位基因多樣性，并且易于用PCR 進行分析，因此作為遺傳標記是有價值的[1]。微衛(wèi)星標記，又稱STR（Short Tandem Repeat）或SSR（Simple Sequence Repeats），通常用于研究自然種群的遺傳結構，關于遺傳變異在種群間的分配不僅在進化生物學和生態(tài)學中具有重要意義，而且在保護生物學中也具有重要意義[2]。由于其重復的特征，在DNA 復制過程中易發(fā)生DNA聚合酶“打滑”現(xiàn)象，導致重復序列中核心序列重復次數的改變而出現(xiàn)突變，因此STRs 也是基因組中變異最快的位點之一[3]，所以STRs 通常與遺傳疾病和基因調控功能有關，也是分析進化、遺傳多樣性和法醫(yī)鑒定的遺傳標記[4]。

我國是家禽飼養(yǎng)及消費大國，雞更是生活中最常見的家禽之一，研究雞的遺傳多樣性及遺傳結構有助于對其進行合理的開發(fā)與利用。宮廷黃雞是我國頗具特色的地方品種，具有獨特的外貌特征和很高的觀賞價值，蛋品質優(yōu)良，肉質濃郁[5]。本研究利用微衛(wèi)星對宮廷黃雞遺傳多樣性進行檢測，并分析其與浙江省不同地方雞品種間的遺傳結構，為今后新昌宮廷黃雞種質資源的保護和合理的開發(fā)利用提供科學的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA 提取 60 只宮廷黃雞來自新昌縣宮廷黃雞繁育有限公司，其他5 個雞品種為絲羽烏骨雞（浙江合興禽業(yè)發(fā)展有限公司）、龍游麻雞（龍游縣田野山莊）、蕭山雞（杭州蕭山東海養(yǎng)殖有限公司）、仙居雞（仙居雞開發(fā)總公司）、白耳黃雞（江山藍豐種禽有限公司），各60 只。所有個體用含有抗凝劑Na2EDTA 或K2EDTA 的抗凝管進行翅下靜脈釆血，低溫保存，使用TaKaRa Blood Genome DNA Extraction Kit 提取基因組DNA。

1.2 引物信息及PCR 擴增 首先，根據GenBank 中所提供的雞的SSR 序列利用Primer Premier 5 軟件進行引物設計或者對相關文獻中引物進行篩選，最終篩選出核心重復序列較多，且多態(tài)性豐富的位點。共有26 對引物擴增成功：ADL136，DL166，ADL185，ADL195，ADL210，ADL212，ADL225，ADL123，ADL176，LEI 0166，LEI 0066，MCW 0295，MCW 0014，MCW 67，MCW 0081，MCW 183，MCW 330，MCW 0085，MCW 264，MCW 134，MCW 104，MCW150，MCW32，MCW4，MCW120，MCW174，其 中ADL166、ADL185、MCW0014 和MCW0085 引物序列參考沈立權[6]，MCW264 和MCW4 引物序列參考李紅霞[7]，ADL176 引物序列參考陳紅菊等[8]，引物由上海英捷生物有限公司合成。

將提取到的基因組DNA 以及合成的引物進行PCR反應，得到的PCR 產物于4℃保存?zhèn)溆?，含熒光標記的PCR 產物用 ABI-3730XL DNA Analyzer 全自動測序儀檢測DNA。PCR 反應體系、擴增反應程序以及檢測程序參照陶爭榮等[9]和劉雅麗等[10]。

1.3 統(tǒng)計分析 利用POPGENE 1.31 軟件進行遺傳多樣性參數統(tǒng)計，利用GENEPOP 4.2[11]軟件卡方檢驗HWE無偏估計概率值（P）；利用Dispan 軟件統(tǒng)計各群體間Nei 遺傳距離DA[12]，并進行鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）聚類分析，基于群體間遺傳距離參數用MEGA 4.0[13]軟件，構建品種間的系統(tǒng)發(fā)生樹；運用Gentix4.02[14]軟件中相關因子分析基于雞群個體遺傳差異進行成分因子分析。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性分析 經統(tǒng)計（表1），去除ADL136、ADL195、ADL210 這3 個無效等位基因座（文中未呈現(xiàn)具體檢驗過程）。宮廷黃雞26 個微衛(wèi)星座平均等位基因數（Ne）為4.03 個，在座位MCW32 上檢測到的基因數最多，在座位LEI0166 上檢測到的基因數最少。宮廷黃雞26 個微衛(wèi)星座多態(tài)信息含量（PIC）均值為0.67，大部分位點PIC 大于0.5，部分位點（ADL123、LEI0166、MCW0085）介于0.25～0.5，為中等多態(tài)性微衛(wèi)星座。觀察雜合度（Ho）與期望雜合度（He）均值分別為0.60、0.72，平均Shannon 信息指數（I）為1.50。利用GENEPOP 進行 Hardy-Weinberg 平衡檢驗發(fā)現(xiàn)，經過邦佛倫尼[15]校正（Bonferroni correction）（P＜0.002），26 個位點中有11 個位點處于不平衡狀態(tài)。

表1 26 對STR 引物信息以及遺傳多樣性參數

2.2 遺傳距離估計 宮廷黃雞與其他雞品種間的遺傳距離DA見表2，6 個雞群體中仙居雞和龍游麻雞的DA遺傳距離最小，僅為0.103 5，絲羽烏骨雞和龍游麻雞的DA遺傳距離也比較小，為0.134 5，而宮廷黃雞與其他群體之間的DA遺傳距離均在0.190 0 以上，其中與絲羽烏骨雞DA遺傳距離最小，為0.190 9，與白耳黃雞的DA遺傳距離最大，為0.342 7，事實上，白耳黃雞與其他群體之間的遺傳距離均在0.300 以上，比其他群體間任意2 個群體間的DA遺傳距離都高。

表2 宮廷黃雞與其他品種雞群DA 遺傳距離

2.3 聚類分析 基于遺傳距離DA采用NJ 構建系統(tǒng)發(fā)生樹，結果見圖1。宮廷黃雞與其他4 個品種雞群分為一簇，仙居雞先與龍游麻雞聚合再與蕭山雞、絲羽烏骨雞聚合，最終與宮廷黃雞聚合，而白耳黃雞則單獨作為一簇。

2.4 因子相關分析（FCA） 基于個體遺傳差異的FCA 結果顯示，反映個體間遺傳差異最主要的3 個因子（Factor I=37.43%，F(xiàn)actor II=22.37%，F(xiàn)actor III=18.27%）呈現(xiàn)了總變異的78.08%，因而能較好反映群體簇聚情況。從FCA 結果可知，宮廷黃雞依次與絲羽烏骨雞、龍游麻雞、蕭山雞、仙居雞簇在一起，白耳黃雞單獨為一簇。

3 討 論

圖1 基于DA 遺傳距離構建的系統(tǒng)發(fā)生樹（NJ）

3.1 遺傳多樣性 遺傳多樣性是世界自然保護聯(lián)盟（IUCN）公認的值得保護的3 種生物多樣性形式之一。保護種群內遺傳多樣性需要基于2 個論點：進化發(fā)生的遺傳多樣性的必要性，以及雜合度與種群適應性之間的預期關系[16]。本研究采用26 個微衛(wèi)星基因座，對宮廷黃雞60 個個體進行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)宮廷黃雞的26 個位點的平均PIC 為0.67，其中只有ADL123、LEI0166、MCW0085 3 個位點為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性；本研究所選用的26 個微衛(wèi)星位點的平均雜合度高于0.60，為高度多態(tài)位點，表明宮廷黃雞具有豐富的遺傳多樣性，而其Ho（0.60）低于He（0.72），說明其純合子比較多，外界的變化對于其影響較?。籗hannon 信息指數越大，群體遺傳結構變異性越高，宮廷黃雞26 個微衛(wèi)星座的平均Shannon 信息指數I 為1.50，說明該群體遺傳結構變異性比較高。哈代-溫伯格平衡結果顯示，在26 個位點中有11 個位點處于不平衡狀態(tài)，說明這11 個位點的基因頻率在后代中會發(fā)生改變。

3.2 遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)生樹 遺傳距離是衡量2 個不同種群或親緣關系較近的物種之間遺傳差異的一種方法，通常是利用2 個種群不同位點的等位基因頻率數據來計算[17]。遺傳距離測量是種群或物種間親緣關系的指標，對重建種群間的歷史和系統(tǒng)發(fā)育關系具有重要意義[18]。遺傳距離的大小可以反映出群體間的親緣關系[19-21]。本研究結果表明，與另外5 個品種相比較，宮廷黃雞與絲羽烏骨雞遺傳距離最小，即親緣關系最近，與白耳黃雞親緣關系最遠；仙居雞與蕭山雞的遺傳距離大于仙居雞與龍游麻雞的遺傳距離，這一結果與曾濤等[22]研究結果一致。總體來看，仙居雞與龍游麻雞的遺傳距離最小，其次是仙居雞與絲羽烏骨雞，白耳黃雞與其他群體之間的距離均在0.33 以上，屬親緣關系最遠。以DA遺傳距離為基礎繪制了NJ 遺傳進化樹，宮廷黃雞與其他4 品種雞群分為一簇，仙居雞先與龍游麻雞聚合再與蕭山雞、絲羽烏骨雞聚合，最終與宮廷黃雞聚合，而白耳黃雞則單獨作為一簇，聚類結果與DA遺傳距離反映結果一致。

3.3 FCA FCA 是對數據集的歸納探索，通過將主要性狀的數量減少到更少的因子中，這些因子是原始變量的組合，是方差最大的因子，消除了原始數據集中的冗余，可以發(fā)現(xiàn)性狀之間的真實關聯(lián)[23]。本研究結果顯示，6個不同雞群間的遺傳結構，與基于遺傳距離NJ 系統(tǒng)樹分析結果一致，白耳黃雞單獨為一簇，宮廷黃雞與絲羽烏骨雞最近，而龍游麻雞與仙居雞及蕭山雞遺傳距離較近。

4 結 論

本研究利用 26 個微衛(wèi)星位點分析宮廷黃雞群體遺傳多樣性及遺傳結構的結果顯示，新昌宮廷黃雞具有豐富的遺傳多樣性，具有較高的保種價值；遺傳距離分析和聚類分析顯示，宮廷黃雞與絲羽烏骨雞遺傳距離最近，與白耳黃雞遺傳距離最遠。