千金子對腎癌Renca細胞周期及侵襲能力的影響

趙俊峰 李豪 肖耀軍 雷震 張林超 孫繼建 潘世杰 崔洪泉 陳瑞廷

(1河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 鄭州 450002；2武警廣東總隊醫(yī)院泌尿外科，3河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室)

腎細胞癌(RCC)為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占成人惡性腫瘤3%～5%，其發(fā)病率有逐年上升趨勢〔1〕。即使通過外科手術(shù)治療，仍有20%～40%的患者在術(shù)后發(fā)生侵襲和遠處轉(zhuǎn)移〔2,3〕。因此尋找中藥治療腎癌成為熱點,其中千金子為大戟科類干燥以后成熟的種子，現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)表明其對腎癌〔4〕、肝細胞癌〔5〕、前列腺癌〔6〕及血液系統(tǒng)的惡性腫瘤細胞〔7〕均具有不同程度的抗腫瘤效果。本研究以小鼠腎癌Renca細胞為實驗對象，通過體外細胞實驗檢測千金子對腎癌細胞周期的影響及其侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，為后續(xù)的實驗研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 千金子二萜醇實驗用藥品購買自四川維克奇生物科技有限公司，純度為99%(批號：20190023)；胎牛血清、RPMI-1640細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；雙抗(青霉素、鏈霉素)購買自武漢漢恒生物科技有限公司；細胞6孔板和Transwell小室均購自美國Corning公司；AnnexinV-FITC細胞周期的試劑盒購買自上海碧云天生物科技有限公司。小鼠腎癌Renca細胞購自北京鼎國昌盛生物科技有限公司，由河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室保存。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 小鼠腎癌Renca細胞放置在含5%CO2、37℃的細胞恒溫箱中，含有雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細胞飽和度達到80%～85%后，使用胰蛋白酶消化細胞后并進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于本實驗。

1.2.2千金子作用前后對腎癌Renca細胞形態(tài)學(xué)的影響 取預(yù)先復(fù)蘇的細胞，使用含有0.25%的胰蛋白酶消化細胞后，調(diào)整細胞的濃度為3×105/ml，并接種到6孔板中。常規(guī)的條件下培養(yǎng)24 h后，等細胞完全貼壁，換液1次，實驗孔滴加預(yù)先稀釋的千金子二萜醇，對照孔滴加等量的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24～48 h后，于倒置顯微鏡下隨機拍照，記錄細胞形態(tài)學(xué)的變化。

1.2.3劃痕實驗檢測千金子對腎癌Renca細胞遷移能力的影響 取對數(shù)期生長的細胞，用含有0.25%的胰蛋白酶消化后收集腎癌Renca細胞，隨即接種到6孔板中密度為1×105/孔，待細胞貼壁后，使用無血清培養(yǎng)基饑餓6 h，用200 μl的槍頭垂直于6孔板劃“1”字形的劃痕，再用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次。加入濃度為(9 000 μg/ml)的千金子二萜醇，以加入培養(yǎng)基組作為對照組。在劃痕時開始和千金子處理24 h后，在倒置顯微鏡下觀測劃痕的寬度并拍照。

1.2.4Transwell小室檢測千金子對腎癌Renca細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響 采用Transwell小室法體外遷移實驗觀察和處理48 h后腎癌Renca細胞遷移能力的變化，同樣取對數(shù)生長期腎癌細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化細胞后，收集細胞調(diào)整細胞密度為1×105/ml，PBS水化小室的基底膜，同時向小室下層內(nèi)添加500 μl不含胎牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基，小室膜上均加入100 μl細胞懸浮液。實驗組滴加9 000 μg/ml的千金子二萜醇溶液，對照組滴加培養(yǎng)基。放置于37℃、5%CO2飽和濕度細胞恒溫箱中培養(yǎng)48 h后，用含4%的多聚甲醛固定30 min、0.1%的結(jié)晶紫染色20 min以后，并取出里邊的小室，擦去沒有穿過小室膜的細胞，在顯微鏡下，隨機取5個視野(上、下、左、右、中間)觀察Transwell小室并進行細胞計數(shù)，實驗的結(jié)果取均值，并獨立重復(fù)3次。

1.2.5細胞增殖周期的檢測 取對數(shù)生長期的腎癌Renca細胞，用單純RPMI1640調(diào)整細胞密度為2×105/ml，均勻加樣于6孔板中置于細胞恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h貼壁后備用。實驗組加入千金子二萜醇(9 000 μg/ml)，對照組加入體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，預(yù)處理細胞；常規(guī)培養(yǎng)24 h后，收集各孔細胞。用預(yù)冷的PBS沖洗細胞2次后，將細胞重懸于0.5 ml PBS液中，迅速注入75%的預(yù)冷乙醇(4℃)冰箱固定過夜。測定時離心棄上清液2次，將細胞重懸于0.5 ml的PBS液中，加入0.5 ml的碘化丙啶(PI)溶液(含10 mg/L的RNase、0.1%Triton-100、50 mg/L PI)4℃避光染色30 min,經(jīng)過尼龍網(wǎng)過濾以后，上流式細胞儀檢測細胞周期，所得實驗結(jié)果利用Modfit軟件分析。試驗獨立重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1千金子對腎癌Renca細胞形態(tài)學(xué)的影響 9 000 μg/ml的千金子二萜醇作用于腎癌Renca細胞24 h后，大部分細胞體積變小、變細短圓鈍；部分細胞出現(xiàn)凋亡的特征，細胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體，有細胞碎片漂浮。見圖1。

圖1 千金子對腎癌Renca細胞形態(tài)學(xué)的影響(×100)

2.2千金子對腎癌Renca細胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力的影響 千金子二萜醇處理腎癌Renca細胞48 h后，穿過小室膜的細胞數(shù)量〔(116.51±15.26)%〕與對照組〔(563.23±39.61)%〕比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3千金子對腎癌Renca細胞遷徙能力的影響 與對照組相比較，實驗組腎癌細胞的遷移距離明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2及表1。

圖2 千金子對腎癌Renca細胞遷徙能力的影響(×100)

表1 千金子對Renca細胞遷移距離的影響

與對照組比較：1)P<0.05，下表同

2.4千金子對腎癌Renca細胞周期的影響 與對照組比較，實驗組細胞G0/G1期細胞明顯增加，S期細胞明顯減少(P<0.05),G2/M期的細胞無明顯變化(P>0.05)。見表2。

表2 千金子對腎癌Renca細胞周期的影響

3 討 論

本研究基于前期發(fā)現(xiàn)中藥千金子二萜醇濃度為9 000 μg/ml時對小鼠腎癌Renca細胞存在明顯的抑制作用〔8〕，更進一步探討其對腎癌細胞周期和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。腫瘤是細胞增殖周期調(diào)控機制出現(xiàn)紊亂，最終導(dǎo)致細胞無限制地進行分裂增殖。在臨床上抗腫瘤藥物的機理有許多是通過阻斷腫瘤細胞的分裂周期從而抑制癌細胞的增殖。Choene等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)千金子乙醇提取物作用于人腎癌細胞后，G2/M期的細胞數(shù)量明顯增加，隨著藥物濃度提高處于G0期細胞數(shù)量隨之增多。本實驗結(jié)果顯示，千金子可以使小鼠腎癌Renca細胞G0/G1期細胞明顯增加，S期細胞數(shù)量減少，G2/M期細胞無明顯變化。Cheng等〔4〕研究中藥千金子作用于乳腺癌(mda-mb 231)等細胞株后，處于G0/G1期細胞數(shù)量顯著增多，與本研究的結(jié)果一致，表明中藥千金子在不同的細胞引起細胞周期的阻滯可能并不完全一致。此外，癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的另一重要的因素，也是腫瘤治療失敗的主要原因。本研究通過Transwell小室實驗及體外細胞劃痕實驗，與對照組相比較，發(fā)現(xiàn)千金子可以有效降低腎癌Renca細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和遷徙的能力。另外，Yang等〔10〕的研究結(jié)果也表明千金子通過抑制人肺癌A549細胞腫瘤血管的生成來阻斷其侵襲和轉(zhuǎn)移，與本研究的結(jié)果基本相符。近年來研究表明PI3K-AKT-mTOR信號傳導(dǎo)通路廣泛存在于多種細胞中，完成并參與細胞包括增殖、分裂、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等生物學(xué)行為〔11,12〕；該信號通路的表達失控與多種癌細胞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，針對PI3K-AKT-mTOR信號通路分子靶向治療成為當(dāng)前研究的熱點〔13〕。千金子與通過該信號通路調(diào)控腎癌Renca細胞生物學(xué)行為的分子機制之間的關(guān)系，有待后續(xù)的研究。