Toll樣受體2基因敲除通過(guò)myd88依賴的p38MAPK減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織氧化應(yīng)激

宋冰 王茹 張浩強(qiáng)

(1錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院)

隨著患病率逐年增高，肥胖已經(jīng)成為世界性難題〔1，2〕，它可以引起胰島素抵抗、2型糖尿病、心臟病、終末期腎病甚至是某些癌癥等一系列疾病〔3〕。肥胖機(jī)體脂肪組織存在低水平的炎癥反應(yīng)〔4〕及氧化應(yīng)激〔5〕在肥胖發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)被廣泛研究，近年來(lái)高游離脂肪酸(FFA)能夠激活Toll樣受體(TLR)2越來(lái)越引起研究者的關(guān)注，F(xiàn)FA激活TLR2后可層層激活包括myd88依賴的炎癥通路而引起下游炎癥因子的表達(dá)〔6〕，而包括腫瘤壞死因子(TNF)-α在內(nèi)的炎癥因子表達(dá)和氧化應(yīng)激反應(yīng)密切〔7〕，本實(shí)驗(yàn)利用高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠，并檢測(cè)肥胖小鼠脂肪組織炎癥因子以及氧化應(yīng)激狀態(tài)的改變，然后再利用高脂飲食喂養(yǎng)的TLR2基因敲除的小鼠探究TLR2基因敲除對(duì)肥胖小鼠脂肪組織炎癥因子表達(dá)和氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 SPF級(jí)健康4周齡雄性C57bl/6小鼠和TLR2基因敲除小鼠各24只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)(8只)，高脂飲食組(HFD組)(16只)，TLR2基因敲除肥胖組(TK組)和TLR2基因敲除高脂飲食組(TH組)。NC組和TK組給予普通飲食(華阜康，北京)，HFD組和TH組給予含60%脂肪的高脂飲食(華阜康，北京)。16 w后HFD組隨機(jī)挑選8只體重大于NC組上限納入肥胖組(OB組)，TH組隨機(jī)挑選8只體重大于TK組上限者納入TO組(TO組)用于實(shí)驗(yàn)，其余剔除。各組小鼠飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合錦州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.2生化指標(biāo)檢測(cè) 各組小鼠禁食6 h，心臟取血，檢測(cè)空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和FFA。

1.3Western印跡 動(dòng)物處死后速取腹腔脂肪組織，-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，冰上?00 mg脂肪組織，剪碎后加裂解液裂解(RIPA∶PMSF=100∶1)，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒(博奧森，北京)定量至2 mg/ml，聚丙烯酰胺凝膠電泳，賽默飛Marker標(biāo)注蛋白位置，濕轉(zhuǎn)蛋白及Marker至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，TLR2(博奧森，北京)，myd88(萬(wàn)類，沈陽(yáng))，p38MAPK(博奧森，北京)和β-actin(ABSCI，美國(guó))一抗4℃孵育過(guò)夜，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(ABSCI，美國(guó))常溫孵育2 h，超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(萬(wàn)類，沈陽(yáng))及GISt020凝膠圖像分析儀成像。

1.4熒光實(shí)時(shí)定量PCR 腹腔脂肪組織總RNA采用Trizol抽提，含反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bioneer，韓國(guó))反轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA，QIAGEN Fast Cycling PCR 試劑盒(Takara生物科技，大連)用于擴(kuò)增：按照95℃(預(yù)變性，10 s；變性5 s)，60℃(退火，15 s)，70℃(拉伸，15 s)進(jìn)行擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。引物由上海生工設(shè)計(jì)并合成，白細(xì)胞介素(IL)-6：正義5′-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3′，反義5′-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3′；TNF-α：正義5′-TGTCTCAGCCTCTTCTCATT-3′，反義5′-AGATG-ATCTGAGTGTGAGGG-3′；GAPDH：正義5′-TTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATG-3′，反義5′-GGATAGG-GCCTCTCTTGCTCA-3′，所得數(shù)據(jù)以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算IL-6和TNF-α基因的相對(duì)拷貝數(shù)，相對(duì)拷貝數(shù)用2-△△Ct表示。

1.5氧化應(yīng)激檢測(cè) 脂肪組織1∶20的比例加入100 mmol/L磷酸緩沖液勻漿后離心(12 000 r/min)10 min，取中層清液，BCA定量如上，調(diào)整蛋白濃度至2 mg/ml后，活性氧簇(ROS)檢測(cè)試劑盒(萬(wàn)類，沈陽(yáng))檢測(cè)活性氧含量。丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(建成生物研究所，南京)檢測(cè)MDA含量和SOD活力。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 析因設(shè)計(jì)分析交互作用，單因素方差分析組間差異，數(shù)據(jù)處理采用SPSS20.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1生化指標(biāo) 與NC組相比，OB組小鼠FPG，TC，TG，LDL和FFA明顯升高(P<0.01)，HDL明顯降低(P<0.01)。與OB組相比，TO組FPG，TC，TG，HDL，LDL和FFA均降低(P<0.01,P<0.05)，且TLR2基因敲除和高脂飲食喂養(yǎng)之間存在交互作用(表1)。

表1 各組血脂、血糖、FFA水平比較

與NC組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與OB組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；與TK組比較：5)P<0.01，6)P<0.05，下表同

2.2Western印跡 與NC組相比，OB組小鼠TLR2、myd88和p38MAPK蛋白水平明顯升高(P<0.01)；而與OB組相比，TO組myd88和p38MAPK明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖1、表2。

圖1 TLR2，myd88，p65nfkb和p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量

組別TLR2myd88p38MAPKNC組0.22±0.030.72±0.0150.26±0.04OB組0.73±0.041)1.02±0.061)0.48±0.031)TK組-0.75±0.070.13±0.01TO組-0.86±0.113)0.17±0.013)

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 與NC組相比，OB組小鼠脂肪組織IL-6和TNF-α mRNA水平明顯升高，與OB組小鼠相比，TO組小鼠脂肪組織IL-6和TNF-α mRNA水平明顯降低，且TLR2基因敲除和高脂飲食喂養(yǎng)對(duì)其影響存在交互作用(P=0.000)，見(jiàn)表3。

2.4氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 與NC組相比，OB組小鼠脂肪組織ROS和MDA水平明顯升高，SOD活力水平明顯降低，與OB組小鼠相比，TO組小鼠脂肪組織ROS和MDA水平明顯降低，SOD活力明顯增加，見(jiàn)表4。

表3 各組TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)量比較

表4 各組脂肪組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

3 討 論

近年來(lái)超重和肥胖已經(jīng)越來(lái)越成為亟待解決的問(wèn)題〔1，8〕。肥胖機(jī)體中的高水平FFA可以刺激TLR2而層層激活炎癥，刺激炎癥因子的表達(dá)〔6〕，我們猜想，在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠體內(nèi)可能存在TLR2及其下游炎癥因子的高表達(dá)，myd88依賴的炎癥通路是TLRs激活后引起炎癥反應(yīng)的重要通路〔6〕，而其下游通過(guò)p38MAPK影響炎癥因子的表達(dá)〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前研究認(rèn)為肥胖小鼠脂肪組織IL-6和TNF-α高表達(dá)結(jié)果一致〔10〕，炎癥因子的表達(dá)可使組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)〔7，11〕。所以我們猜想肥胖小鼠可以通過(guò)myd88依賴的p38MAPK途徑激活下游的炎癥因子并使脂肪組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，ROS是誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的主要物質(zhì)〔12〕，能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物，如MDA，SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，可清除超氧產(chǎn)物，可作為機(jī)體還原能力水平的檢測(cè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。由于肥胖小鼠脂肪組織TLR2高表達(dá)，我們猜想脂肪組織發(fā)生的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激狀態(tài)可能與TLR2激活有關(guān)，所以我們采用TLR2基因敲除小鼠并給予高脂飲食以探究TLR2基因敲除對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織炎癥因子的表達(dá)和氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示TLR2基因敲除抑制了myd88，p38MAPK，IL-6 mRNA和TNF-α mRNA的高表達(dá)，并減輕了脂肪組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)，綜上所述，TLR2基因敲除可能通過(guò)myd88依賴的p38MAPK途徑減輕了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)，但是這一結(jié)論需要進(jìn)一步利用雙基因甚至多基因敲除動(dòng)物模型做進(jìn)一步驗(yàn)證。