尿路感染大腸埃希菌ST131 克隆株的分子生物學(xué)特征分析

盧燕芳，李 彬，徐兩蒲，蘭芳俊，吳志輝，何清雯

大腸埃希菌是與人類疾病關(guān)系密切的腸道菌之一，可引起許多不同類型的腸外感染，如血流感染、腦膜炎和尿路感染等。而大腸埃希菌ST131克隆株是系統(tǒng)發(fā)育分型B2型中一類具有明確致病性的種群[1]，同時(shí)也是腸外致病性大腸埃希菌（ExPEC）感染的主要克隆群。該種群通常具有多種毒力因子，并與氟喹諾酮類和頭孢菌素類抗菌藥物耐藥密切相關(guān)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌ST131克隆株與腎盂腎炎高度相關(guān)，尤其是ST131的H30亞克隆株與持續(xù)性或復(fù)發(fā)性尿路感染密切相關(guān)[1-3]。本研究旨在分析尿路感染B2-ST131克隆株在本地區(qū)的流行情況和分子生物學(xué)特征，同時(shí)了解其與B2型非ST131克隆株的毒力和耐藥情況，為今后進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集2014年8月－2015年8月福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)中段尿培養(yǎng)大腸埃希菌357株。患者尿常規(guī)白細(xì)胞數(shù)≥5/HP且尿液培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)≥105CFU/mL，均診斷為尿路感染。所有菌株均使用VITEK系統(tǒng)鑒 定。

1.1.2 儀器和試劑 細(xì)菌鑒定儀為V.T.K 2-Compact全自動(dòng)微生物檢定儀（法國(guó)生物梅里埃公司），PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied Biosystems公司），Universal HoodⅡ凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司），脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及GEL DOC2000凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司），PCR相關(guān)試劑（大連寶生物有限公司），DNA Maker、電泳用瓊脂糖、Goodview核酸染料（上海鉑尚生物技術(shù)有限公司），藥敏紙片（英國(guó)OXOID公司）。

1.2 方法

1.2.1 系統(tǒng)發(fā)育分型 采用煮沸法提取357株菌株DNA模板，采用多重PCR擴(kuò)增系統(tǒng)發(fā)育分型基因，包括ChuA、YjaA、TspE4.C2；PCR引物序列參照文獻(xiàn) [4]。

1.2.2 大腸埃希菌ST131克隆株篩查 采用PCR擴(kuò)增針對(duì)大腸埃希菌ST131克隆株特異性gyrB、mdh基因和O血清型的分子分型基因（O1、O2、O4、O6、O7、O8、O15、O16、O18、O21、O22、 O25、O25b、O75、O83和O157），PCR反應(yīng)體系和引物序列參照文獻(xiàn) [5-7]。根據(jù)Achtman方案，使用7個(gè)管家基因（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA）對(duì)所有非O25b、非O16和非B2群大腸埃希菌ST131克隆株采用多位點(diǎn)序列分型（MLST）驗(yàn)證是否為大腸埃希菌ST131克隆株。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法藥物敏感性試驗(yàn)[8]。酶抑制劑增強(qiáng)雙紙片擴(kuò)散法檢測(cè)大腸埃希菌中的產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）菌株。根據(jù)CLSI（2017年版）[8]規(guī)定的折點(diǎn)判斷敏感、中介和耐藥。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.2.4 耐藥基因的檢測(cè) 采用PCR法擴(kuò)增常見β內(nèi)酰胺酶基因（blaCTX-M、blaTEM和blaSHV）。PCR反應(yīng)體系和引物序列參照文獻(xiàn) [9-12]，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司（Sanger測(cè)序法）測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分 析。

1.2.5 毒力基因的檢測(cè) 采用多重PCR擴(kuò)增15對(duì)毒力基因，PCR反應(yīng)體系和引物序列參照文獻(xiàn) [13]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用χ2或Fisher確切概率法檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株的種系分型及大腸埃希菌ST131克隆株篩查

系統(tǒng)發(fā)育分型結(jié)果顯示，357株大腸埃希菌中54株（15.1%）為A型，32株（9.0%）為B1型，162株（45.4%）為B2型，109株（30.5%）為D型。162株B2型大腸埃希菌中，MLST結(jié)果顯示55株（55/162，34.0%）被鑒定為大腸埃希菌ST131克隆株，107株為B2型非大腸埃希菌ST131克隆株。55例尿路感染大腸埃希菌ST131克隆株患者中，門診7例，住院48例。住院病例中復(fù)雜性尿路感染15例，非復(fù)雜性尿路感染33例。血清型的結(jié)果顯示55株大腸埃希菌ST131克隆株屬于兩種類型，O25b-ST131（36株，65.5%）和O16-ST131（19株，34.5%）。162株B2型大腸埃希菌的臨床信息見表1。

表1 尿標(biāo)本162株B2型大腸埃希菌中ST131克隆株篩查 結(jié)果和相關(guān)信息Table.Details of the ST131 clone in the 162 strains of phylogenetic group B2 Escherichia coli isolated from urine samples

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

大腸埃希菌ST131和非ST131克隆株對(duì)15種常見抗菌藥物的耐藥率見表2，其中ST131克隆株對(duì)頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、甲氧芐啶-磺胺甲唑、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率顯著高于非ST131克隆株。ST131克隆株的ESBL檢出率65.5%高于非ST131克隆株的檢出率35.5%（P＜0.05）。未檢出對(duì)亞胺培南和厄他培南的耐藥株；對(duì)磷霉素和呋喃妥因的耐藥率≤3.6%，對(duì)阿米卡星的耐藥率≤9.1%。

表2 尿標(biāo)本大腸埃希菌ST131和非ST131克隆株對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table.Susceptibility of ST131 and non-ST131 clones E.coli to antimicrobial agents（%）

2.3 耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果

55株大腸埃希菌ST131克隆株中共有48株（87.3%）攜帶β內(nèi)酰胺酶基因。其中TEM-1型23株；CTX-M-1組12株（CTX-M-15型11株、CTXM-123型1株）；CTX-M-9組25株（CTX-M-14型25株）。1株同時(shí)攜帶CTX-M-15型和CTX-M-14型β內(nèi)酰胺酶基因，11株攜帶CTX-M型和TEM-1型兩種β內(nèi)酰胺酶基因。未檢出blaSHV、CTX-M-2組、CTX-M-8組和CTX-M-25組基因。見表3。

2.4 毒力基因分布

大腸埃希菌ST131克隆株中毒力基因的檢出率高于20%的有12種，檢出率最高的為fimH（98.2%）、fyuA（96.4%）和iutA（90.9%），而107株B2型非ST131克隆株中，毒力基因fimH（99.1%）、fyuA（91.6%）的流行率最高。毒力基因iutA、kpsMT K5和traT在ST131克隆株的流行率顯著高于B2型非ST131克隆株（P＜0.05）。見表1。

表3 55株大腸埃希菌ST131克隆株中 β內(nèi)酰胺酶基因的分布Table.Prevalence of β-lactamase gene in the 55 E.coli ST131 clones

3 討論

尿路感染是臨床中最常見的細(xì)菌感染性疾病之一。大腸埃希菌是引起尿路感染最主要的病原菌，75%單純性尿路感染和65%復(fù)雜性尿路感染由大腸埃希菌所致[14]。大腸埃希菌不同系統(tǒng)發(fā)育群在耐藥和致病性方面存在較大差異，文獻(xiàn)報(bào)道，ExPEC不同系統(tǒng)發(fā)育群根據(jù)其致病能力從高到低分別為B2型、D型、A型和B1型[1]。本組資料顯示，引起尿路感染的大腸埃希菌以B2型（45.4%）為主，D型（30.5%）次之，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的相一致[1，15]。董敏等[15]對(duì)隨機(jī)挑選尿路感染患者尿液分離的55株大腸埃希菌分析發(fā)現(xiàn)，B2型和D型分別占43.6%和41.8%，其攜帶的毒力基因種數(shù)最多且致病能力較強(qiáng)。本地區(qū)尿路感染患者中段尿分離的195株非B2型大腸埃希菌中D型的比例明顯較高。本組資料顯示，大腸埃希菌ST131克隆株在我院尿培養(yǎng)中有一定的流行，但流行率低（15.4%，55/357），遠(yuǎn)低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道（27%～30%）[2-3]。推測(cè)其原因可能為地域或人口組成差異所致。本組資料顯示O25b-ST131克隆株（65.5%）是臨床尿路感染大腸埃希菌ST131的主要克隆株，O16-ST131克隆株占34.5%。這與國(guó)內(nèi)Zhong等[16]2015年關(guān)于O16-ST131 和O25b-ST131克隆株研究報(bào)道相一致；但本組資料遠(yuǎn)高于國(guó)外同行的同類研究報(bào)道的結(jié)果[1，17-18]。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于大腸埃希菌ST131克隆株的研究主要集中在O25b-ST131克隆株，而對(duì)O16-ST131克隆株的研究甚少，綜合以前的研究，本組資料提示除O25b-ST131克隆株外，O16-ST131克隆株可能也是大腸埃希菌ST131克隆株的另一個(gè)重要類型，未來(lái)的研究應(yīng)更多關(guān)注O16-ST131克隆群[16，19]。

本研究藥敏結(jié)果顯示，69.1% ST131克隆株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，65.5%菌株產(chǎn)ESBL，產(chǎn)ESBL的ST131克隆株中，78.9% ST131克隆株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥。另外，ST131克隆株對(duì)頭孢噻肟、頭孢吡肟、甲氧芐啶-磺胺甲唑、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率顯著高于非ST131克隆株，與文獻(xiàn)報(bào)道的ST131克隆株對(duì)頭孢菌素類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥率顯著高于其他的ST菌株相符合[20]。大腸埃希菌ST131克隆株對(duì)臨床常用抗菌藥物高度耐藥可能與臨床藥物使用方法和習(xí)慣有關(guān)，如氟喹諾酮類藥物在臨床上廣泛應(yīng)用于尿路感染的治 療。

大腸埃希菌ST131克隆株是近年來(lái)細(xì)菌耐藥研究領(lǐng)域非常熱門的一類高耐藥性的克隆株，該克隆株與頭孢菌素類抗生素耐藥密切相關(guān)[1，17]。本研究主要分析大腸埃希菌ST131克隆株對(duì)常見β內(nèi)酰胺酶耐藥基因的特征，結(jié)果顯示本組大腸埃希菌ST131克隆株中主要以CTX-M型為主，其中blaCTX-M-14檢出率（45.5%）最高，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的大腸埃希菌ST131克隆株高blaCTX-M-14檢出率（46%～48.4%）相一致[16，21]，提示blaCTX-M-14可能是該院大腸埃希菌ST131克隆株尿路感染患者對(duì)頭孢菌素類藥物耐藥的主要原因。本研究中大腸埃希菌ST131克隆株對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥率高達(dá)69.1%。文獻(xiàn)報(bào)道大腸埃希菌ST131克隆株對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥的主要原因是染色體介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥決定區(qū)基因（QRDR區(qū)）的染色體突變，特別是回旋酶gyrA1AB和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的parC1aAB突變密切相關(guān)，大腸埃希菌ST131克隆株還與質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥決定簇aac(6')-Ibcr的存在有關(guān)[22]。關(guān)于本組資料中氟喹諾酮類耐藥菌株的特征有待進(jìn)一步研 究。

本組資料顯示，大腸埃希菌ST131克隆株中多種毒力基因的檢出率高于非ST131克隆株的，其中iutA、kpsMT K5和traT均有顯著差異。文獻(xiàn)報(bào)道某些毒力基因的產(chǎn)物可能與大腸埃希菌ST131克隆株引起腎盂腎炎密切相關(guān)[1]。例如，iutA是編碼細(xì)菌鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，而kpsMT K5是Capsule synthesis 基因，文獻(xiàn)報(bào)道由kpsMT K5編碼的基因具有抗吞噬作用而增強(qiáng)大腸埃希菌ST131克隆株的發(fā)病機(jī)制[13]，本組資料顯示，iutA和kpsMT K5的檢出率為90.9%和58.2%。 綜上所述，本組尿路感染的大腸埃希菌中存在強(qiáng)毒力和多重耐藥的ST131克隆株，但其流行率低，主要包括O25b-ST131（65.5%）和O16-ST131（34.5%）兩大類，提示O25b-ST131克隆株是本院尿路感染患者中ST131的主要流行型別。O16-ST131克隆株在毒力基因和耐藥率方面顯著有別于 O25b-ST131克隆株。故在防止O25b-ST131克隆株流行的同時(shí)也應(yīng)該密切關(guān)注O16-ST131克隆株的發(fā)展趨勢(shì) 。