響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇粗多糖提取條件及其體外活性

龔 頻， 王思遠(yuǎn)， 陳雪峰*， 常相娜， 劉楠楠，2

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.渭南師范學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院， 陜西 渭南 714000)

0 引言

杏鮑菇(Pleurotus eryngii)是一種藥食兩用的大型食用真菌[1]，其又名刺芹側(cè)耳，有“菇中之王”的美稱，屬于擔(dān)子菌亞門、擔(dān)子菌綱、層菌亞綱、無(wú)隔擔(dān)子菌亞、綱傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬食用菌[2].杏鮑菇肉質(zhì)肥美，具有杏仁味與鮑魚味，故稱之為杏鮑菇[3]，并且營(yíng)養(yǎng)豐富，其營(yíng)養(yǎng)成分有多糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、微量元素、維生素、萜類化合物以及多肽類等多種物質(zhì)，且含有較低的脂肪[4-8].

作為杏鮑菇子實(shí)體的主要提取物之一，杏鮑菇多糖具有多種生理活性，比如抗腫瘤活性[9]、降血糖作用[10]、降血脂作用以及抗氧化作用等，在藥理方面均發(fā)揮著重要作用.

杏鮑菇多糖的提取方法有多種，主要有水提醇沉法[11,12]、微波輔助提取[13]、酶解法[14,15]、堿提法[16,17]、超臨界流體萃取法等，但是由于微波輔助提取以及超臨界流體萃取方法對(duì)設(shè)備要求較高，增加了提取成本，并且微波輔助等的提取方法過(guò)程較為強(qiáng)烈，有可能會(huì)對(duì)多糖造成破壞；酶解法對(duì)提取條件的要求比較嚴(yán)苛，酶的種類以及提取溫度等都會(huì)影響提取效果；堿提法會(huì)用到大量的有機(jī)溶劑.

因此，本文采用實(shí)驗(yàn)室較為成熟的水提醇沉法對(duì)杏鮑菇多糖進(jìn)行提取，確定影響提取效果的單因素，在單因素水平的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)提取效果進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳的提取工藝，同時(shí)對(duì)杏鮑菇粗多糖進(jìn)行體外抗氧化及降糖活性研究，為杏鮑菇多糖的利用開(kāi)發(fā)提供相應(yīng)的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮杏鮑菇(四川成都)，購(gòu)于西安市潤(rùn)家超市；無(wú)水乙醇(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉(分析純)，西安化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鈉(分析純)，西安化學(xué)試劑廠；水楊酸(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸Vc(分析純)，西安化學(xué)試劑廠；30% H202(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；水合三氯化鐵(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；正丁醇(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氯仿(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；阿卡波糖，上海植信化工有限公司；α-葡萄糖苷酶，湖北實(shí)順生物科技有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

HC-150T2粉碎機(jī)，永康市綠可食品機(jī)械有限公司；TDL-40B電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-16C高速離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠； SHZ-Ⅱ循環(huán)水真空泵，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；ZXA 型式真空冷凍干燥機(jī)，上海比郎儀器制造有限公司；HWS12型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海恒科學(xué)儀器有限公司.Varioskan fiash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

將新鮮杏鮑菇洗凈，瀝干，切成 1～3 cm的薄片，放入50 ℃的烘箱中干燥12～14 h，取出后用植物組織粉碎機(jī)粉碎備用.

1.3.2 杏鮑菇粗多糖提取

取5 g杏鮑菇粉末于適量加熱的蒸餾水中，浸提一段時(shí)間，冷卻至室溫，采用抽濾的方法得到杏鮑菇多糖提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/4，按照1∶4的比例加入濃度為95%的乙醇于4 ℃醇沉過(guò)夜，多糖提取液在5 000 r/min下離心5 min，棄去上清液將沉淀用無(wú)水乙醇洗滌3次，將沉淀溶于蒸餾水中，置于-20 ℃冷凍過(guò)夜，放于真空冷凍干燥機(jī)中干燥48 h，即得杏鮑菇粗多糖.

粗多糖得率/%=粗品質(zhì)量/杏鮑菇粉末質(zhì)量×100

1.3.3 粗多糖除蛋白

采用Sevage法除蛋白[18]：將冷凍干燥得到的多糖配成10%濃度的溶液，添加1/4體積的Sevage溶液，置于搖床振蕩20 min，之后靜置20 min，棄去變性蛋白以及下層氯仿，得到的上清液進(jìn)行2次處理.

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

選定提取時(shí)間、提取溫度以及料液比三個(gè)單因素水平，考察每個(gè)單因素水平對(duì)多糖提取率的影響，以便找出最優(yōu)提取工藝.

(1)料液比對(duì)粗多糖得率的影響

選定提取溫度50 ℃，提取時(shí)間2 h不變，分別在料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的條件下水提，得出相應(yīng)杏鮑菇粗多糖得率，以料液比為橫坐標(biāo)，多糖得率為縱坐標(biāo)，分析影響趨勢(shì)，確定最佳料液比.

(2)提取時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

選定提取溫度50 ℃，料液比1∶10不變，分別在提取時(shí)間為2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h的條件下水提，得出相應(yīng)杏鮑菇粗多糖得率，以提取時(shí)間為橫坐標(biāo)，多糖得率為縱坐標(biāo)，分析影響趨勢(shì)，確定最佳提取時(shí)間.

(3)提取溫度對(duì)粗多糖得率的影響

選定提取時(shí)間2 h，料液比1∶10不變，分別在提取溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的條件下進(jìn)行水提，得出相應(yīng)杏鮑菇粗多糖得率，以提取溫度為橫坐標(biāo)，多糖得率為縱坐標(biāo)，分析影響趨勢(shì)，確定最佳提取溫度.

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(box-behnken design BBD)軟件自動(dòng)生成得到杏鮑菇粗多糖的提取工藝方案，設(shè)計(jì)出三因素三水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1所示.

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.3.6 體外抗氧化活性研究

(1)DPPH清除能力試驗(yàn)[19]

取不同濃度0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.80 mg/mL、1.0 mg/mL的杏鮑菇多糖溶液4 mL，再加入0.2 mmol/L的DPPH溶液4 mL，混合均勻，于37 ℃暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度Ai1;4 mL無(wú)水乙醇和4 mL蒸餾水空白調(diào)零；用Vc做陽(yáng)性對(duì)照：取與杏鮑菇粗多糖對(duì)應(yīng)濃度0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.80 mg/mL、1.0 mg/mL的溶液Vc 4 mL,分別加入4 mL的DPPH溶液(0.2 mmol/L)，按處理多糖溶液的操作，在 517 nm處測(cè)定吸光度，記為Ai2(以上數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)測(cè)得)；另取一支試管加入4 mL雙蒸水和4 mL DPPH溶液為空白對(duì)照，混合均勻，于暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度，記為A0.DPPH 自由基清除率的計(jì)算如公式(1)所示：

清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100%

(1)

式(1)中：A0，空白對(duì)照的吸光度值；Ai1，樣品的吸光度值；Ai2，Vc的吸光度值.

(2)羥自由基清除能力試驗(yàn)[20]

取5支試管,以次加入不同濃度(0.05、0.20、0.80、1.60、3.20)mg/mL杏鮑菇粗多糖溶液，再加入6 mmol/L新配制的FeSO4溶液 2 mL、6 mmol/L的H2O2溶液2 mL，再向各試管中分別加入6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液2 mL，搖勻，靜置于37 ℃恒溫水浴鍋中1 h，于510 nm 處的測(cè)定吸光度值，記為Ai1；空白對(duì)照用蒸餾水代替杏鮑菇粗多糖樣品中，于510 nm處測(cè)定吸光度值，記為A0；用 Vc 代替多糖做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，吸光度記為Ai2.羥基自由基清除率的計(jì)算如公式(2)所示：

清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100%

(2)

式(2)中：A0，空白對(duì)照的吸光度值；Ai1，對(duì)應(yīng)濃度的杏鮑菇粗多糖的吸光度值；Ai2，Vc的吸光度值.

1.3.7α-葡萄糖苷酶體外抑制試驗(yàn)

將 0.1 mol/L 80μL的磷酸緩沖液(pH6.8)，40μL 10 mM的PNPG溶液及20μL的測(cè)試樣品溶液(陰性對(duì)照孔加入蒸餾水,陽(yáng)性對(duì)照孔加入0.01 mol/L阿卡波糖，樣品孔加入杏鮑菇粗多糖)，依次加入96孔酶標(biāo)板中，37 ℃條件下放置 10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定此時(shí)的OD值(OD1).然后加入 20μL 0.28 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃下進(jìn)行反應(yīng)，待反應(yīng)30 min后，測(cè)定此時(shí)的 OD 值(OD2).抑制率的計(jì)算如公式(3)所示：

樣品抑制率=(OD2-OD1)對(duì)照-

(OD2-OD1)樣品/(OD2-OD1)對(duì)照-

(OD2-OD1)空白

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)粗多糖得率的影響

不同料液比對(duì)粗多糖得率的影響如圖1所示.由圖1可知，不同料液比對(duì)杏鮑菇粗多糖得率有影響，且料液比在1∶10～1∶40之間粗多糖得率有增加的趨勢(shì)，在料液比為1∶40時(shí)多糖得率達(dá)到最大.隨著溶劑的增加，使杏鮑菇粉末與溶劑的接觸面積變大，導(dǎo)致可溶性多糖溶出.但在料液比達(dá)到1∶40之后，粗多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，則表明多糖已基本溶于溶劑當(dāng)中，因此選擇料液比1∶40較為適宜.

圖1 料液比對(duì)粗多糖得率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

不同提取時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響如圖2所示.如圖2可知，在3 h之前粗多糖得率隨著提取時(shí)間的增加而增加，并且在3 h時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明粗多糖在一定溫度的作用下，隨著加熱作用而持續(xù)地溶出于蒸餾水中，但是在3 h過(guò)后，粗多糖得率有所下降，可能是由于提取液達(dá)到飽和狀態(tài)，或是溫度對(duì)粗多糖提取有一定的影響，所以選定3 h為最佳提取時(shí)間.

圖2 提取時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)粗多糖得率的影響

不同提取溫度對(duì)粗多糖得率的影響如圖3所示.如圖3可知，在40 ℃以前，粗多糖得率隨著溫度升高而增加，但是在超過(guò)40 ℃時(shí)，粗多糖得率有下降的趨勢(shì)，在60 ℃到70 ℃之間趨于平緩，由此可得溫度較高的時(shí)候可能不利于粗多糖的溶出，因此也從操作條件以及可操作性上來(lái)看，選擇40 ℃為最佳提取溫度.

圖3 提取溫度對(duì)粗多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

將響應(yīng)面因素水平表輸入Disign-Expert 軟件中，得出以下試驗(yàn)設(shè)計(jì)表(如表2所示)，根據(jù)中心組合試驗(yàn)(box-behnken design BBD)設(shè)計(jì)出的試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，得出粗多糖得率Y(如表2所示)、回歸模型方差分析表(如表3所示)以及因素交互影響三維圖(如圖4所示).

表2 中心組合試驗(yàn)方案與結(jié)果

表3 響應(yīng)面法回歸模型方差分析

注： **表示差異極顯著(P<0.01).

采用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得的響應(yīng)值粗多糖得率(Y)對(duì)提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)真實(shí)值的回歸模型方程為：

Y=6.16+0.050A-0.025B-0.075C-

0.15AB+0.55AC-0.20BC-0.63A2-

1.18B2-1.08C2

(a)提取時(shí)間與提取溫度等高線圖

(b)提取時(shí)間與提取溫度響應(yīng)面圖

(c)提取時(shí)間與料液比等高線圖

(d)提取時(shí)間與料液比響應(yīng)面圖

(e)提取溫度與料液比等高線圖

(f)提取溫度與料液比響應(yīng)面圖圖4 各因素交互作用對(duì)杏鮑菇粗多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

對(duì)粗多糖得率的回歸模型進(jìn)行方差分析，得出的結(jié)果列于表3中，由此可見(jiàn)模型是顯著的(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.0001)，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.976 9)，則說(shuō)明該模型可以解釋97.69%的變化.根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面圖(如圖4所示)，直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響.由響應(yīng)面圖4可知，其呈現(xiàn)拋物線狀，則說(shuō)明所擬合的回歸模型有最大值點(diǎn).根據(jù)相應(yīng)面法提取優(yōu)化來(lái)看，提取杏鮑菇粗多糖的最優(yōu)工藝條件為提取時(shí)間3.03 h、料液比1∶39.74(g/mL)、提取溫度39.89 ℃.在此條件下，杏鮑菇粗多糖的提取率為6.16%.

采用上述響應(yīng)面優(yōu)化得出的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作情況,將提取最佳參數(shù)設(shè)為提取時(shí)間3 h、料液比1∶40(g/mL)、提取溫度39.89 ℃，在此條件下，得到的粗多糖得率為5.9%，與預(yù)測(cè)值相近，回歸模型較好地預(yù)測(cè)了杏鮑菇粗多糖的得率，說(shuō)明采用響應(yīng)面優(yōu)化法得到的熱水浸提杏鮑菇粗多糖優(yōu)化條件是可以實(shí)現(xiàn)的.

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

杏鮑菇粗多糖的DPPH清除能力如圖5所示.由圖5可知，杏鮑菇粗多糖對(duì)DPPH有清除能力，并且有一定的劑量效應(yīng)，隨著糖溶液濃度的增加，其對(duì)DPPH清除能力顯著增強(qiáng)，當(dāng)杏鮑菇粗多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到52.90%，說(shuō)明杏鮑菇粗多糖有一定的抗氧化能力.

圖5 杏鮑菇粗多糖DPPH清除率變化圖

2.3.2 羥自由基清除能力

杏鮑菇粗多糖的羥自由基清除能力如圖6所示.由圖6可知，杏鮑菇粗多糖對(duì)羥自由基具有良好的清除能力，其濃度自1.6 mg/mL開(kāi)始，隨著濃度增加，其清除能力呈現(xiàn)出平緩的趨勢(shì)，當(dāng)達(dá)到3.2 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到最大值87.24%，這與陽(yáng)性對(duì)照組呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì).

圖6 杏鮑菇粗多糖羥自由基清除率變化圖

2.4 體外降糖活性

杏鮑菇粗多糖的α-糖苷酶抑制能力如圖7所示.由圖7可知，杏鮑菇粗多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，在濃度達(dá)到0.4 mg/mL前其抑制率有明顯上升趨勢(shì)，隨后其抑制率隨濃度的增加而趨于平緩，在濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)其清除率達(dá)到13%，但是效果與阿卡波糖相比有一定的差距.

圖7 杏鮑菇粗多糖α-糖苷酶抑制率變化圖

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，包括癌癥、心腦血管疾病等多種疾病的發(fā)生及衰老等過(guò)程都與體內(nèi)抗氧化水平和自由基代謝失調(diào)有關(guān).據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道香菇多糖、靈芝多糖、猴頭多糖等可食用菌多糖有著極強(qiáng)的抗氧化特性，能夠清除DPPH、羥基自由基、超氧自由基等[21].經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)表明未經(jīng)純化的杏鮑菇粗多糖也有抗氧化活性[22]，這可能與它的單糖組成等一系列的結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，經(jīng)由水提醇沉法得到的杏鮑菇粗多糖是由D-甘露糖、D-核糖、D-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-巖藻糖組成[23,24]，可能正是由于杏鮑菇多糖的這種雜多糖形式使其具有一定的抗氧化活性和對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用.

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化得出杏鮑菇粗多糖的最佳提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間3 h、料液比1∶40(g/mL)、提取溫度40 ℃.采用水提法條件溫和，可以較大程度保留多糖活性成份.體外抗氧化活性試驗(yàn)也表明杏鮑菇粗多糖對(duì)DPPH、羥自由基有一定的清除能力，且呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)；對(duì)α-葡萄糖苷酶也有一定的抑制作用.該法對(duì)杏鮑菇資源的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)和應(yīng)用前景.