自剪切多肽P2A對自然殺傷細胞的高效誘導擴增作用的研究

陳雪梅 張曦 林建煒 薛禎智 劉韜

自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。其特異性分子標記是CD3-CD16+CD56+。與T細胞相比，NK細胞具有主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）非限制性殺傷的特點。NK細胞是駐留在黏膜系統(tǒng)和淋巴結等機體抵御病原體感染和惡性腫瘤第一道防線的重要免疫細胞。在感染和腫瘤發(fā)生早期起著重要的控制作用[1]。NK細胞可以識別并清除腫瘤細胞，無需預先抗原致敏[2]。它們對腫瘤細胞的識別依賴于細胞表面活化性受體和抑制性受體之間的平衡[3]。NK細胞識別腫瘤細胞后，可通過釋放穿孔素和顆粒酶[4-5]、誘導凋亡、誘導腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族分子[6]的表達，亦可通過其表面CD16分子介導的抗體依賴性細胞毒性作用（antibody dependent cell cytotoxicity，ADCC）[7-8]，迅速破壞腫瘤細胞。

目前絕大多數(shù)臨床以及臨床前研究中所使用的NK細胞來源為人自體外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。 由 于NK細胞在PBMC細胞中僅占5%～ 20%，且在體外的擴增能力遠遠低于T淋巴細胞，限制了其在臨床的大規(guī)模應用[9-10]。因此，如何從PBMC誘導獲得大量的高活性NK細胞成為其應用于臨床的關鍵[11-12]。目前，NK細胞的體外擴增培養(yǎng)方法主要有細胞因子組合誘導培養(yǎng)法[13-14]和滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)法[9,15-16]。其中滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)法在NK細胞擴增倍數(shù)和純度上要優(yōu)于細胞因子組合的擴增方案，但仍具有很大的改進空間[9,17]。

白介素（interleukin，IL）-15（IL-15）是維持NK細胞活性和功能的重要因子。IL-15與白介素2（IL-2）聯(lián)合使用，可維持NK細胞存活，促進NK細胞擴增[18]。此外，IL-15還可促進NK細胞分泌 γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）[19]，促進 ADCC，大大提高NK細胞聯(lián)合單抗治療腫瘤的療效[20]。4-1BBL是Ⅱ型跨膜糖蛋白，屬于TNF超家族。4-1BB/4- 1BBL作為一對重要的協(xié)同刺激信號分子，可促進NK細胞增殖、激活和分泌IFN-γ[21]，同時還可抑制NK細胞凋亡，提高NK細胞毒性，在NK細胞介導的免疫應答中起十分重要的調控作用[9]。

自剪切多肽P2A是由21個氨基酸構成，來源于Ⅰ型豬腸病毒。其序列比內核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）序列小很多。在2個目的蛋白之間插入P2A多肽序列，通過在2A序列的C端甘氨酸和脯氨酸間進行共轉錄自剪切，產(chǎn)生獨立的2個目的蛋白，增加了共表達蛋白的產(chǎn)量[22-23]，同時實現(xiàn)同一個啟動子控制下的兩蛋白共翻譯?；谏鲜鲈恚贗L-15和4-1BBL之間加入該序列將會增加這兩種因子在滋養(yǎng)層細胞表面的表達豐度。使用上述方法構建的滋養(yǎng)層細胞將會進一步提高NK細胞體外擴增能力，提高NK細胞純度和細胞毒性。

材料與方法

一、材料

人慢性髓系白血病細胞K562、人胚胎腎細胞293T購自北京北納生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺購自美國Thermo公司；EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內切酶購自美國New England Biolabs公司；pLVX-IRES-Puro、pLVX-IRES-ZsGreen1質粒購自美國Clontech公司；pUC57-IL15-41BBL質粒及相關引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；psPAX2、pMD.2G質粒由哈爾濱工業(yè)大學胡穎教授贈送；DH5α感受態(tài)細胞購自上海生工生物公司；D2000 DNA Marker、無內毒素質粒中量提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；NK細胞無血清培養(yǎng)基、DPBS由深圳默賽爾生物公司提供；人白介素2 （IL-2）購自北京同立海源生物 公 司；LEGENDplex?Human Th Cytokine Panel（13- plex）、Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer （細胞內染色滲透洗滌液）（×10）、PE-anti-human 4-1BBL、CD3-PerCP/Cy5.5、CD56-FITC、CD3-FITC、CD56-PE、IFN-γ-PE、TNF-α-APC流式抗體均購自美國Biolegend公司；嘌呤霉素購自上海翊圣生物公司；乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測試劑盒購自中國碧云天生物公司。

二、方法

1.pUC57-IL15-41BBL質粒的構建和合成：從NCBI的基因庫中搜索目的基因IL-15和41BBL的cDNA序列，設計“CD8α信號肽-IL15-CD8α跨膜區(qū)-P2A-41BBL”全序列，序列結構示意圖如圖1a所示，將該序列在合適的位點插入pUC53質粒中，獲得pLVX-IL15-41BBL質粒，質粒圖譜如圖1b所示。將獲得的pUC57-IL15-41BBL質粒全序列送交南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.pLVX-IL15-41BBL慢病毒表達載體的構建：以pUC57-IL15-41BBL質粒為模板，利用IL15-41BBL 擴 增 引 物（Sense：CGGAATTCGCCA CCATGGCCTTACCAGTGACCGCC，Antisense：GCTCGA GCGGTTATTCCGACCTCG）將“CD8α信號肽-IL15-CD8α跨 膜區(qū)-P2A-41BBL”基 因片段（1474 bp）擴增出來。pLVX-IRES-Puro質粒用 EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后，將“CD8α信號肽-IL15-CD8α跨膜區(qū)-P2A-41BBL”基因片段插入至pLVX-IRES-Puro質粒中，經(jīng)過DNA連接，即合成慢病毒表達載體pLVX-IL15-41BBL質粒。將pLVX-IL15-41BBL質粒轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)過克隆PCR（引物CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG，IRES-R：CCTCA CATTG CCAAAAGACG）及電泳初步鑒定（PCR產(chǎn)物長度1757 bp）后，選取鑒定正確的轉化克隆大量擴增，提取pLVX-IL15-41BBL質粒進行最終測序鑒定。

3.IL15-41BBL/ZsGreen1慢病毒的制備和濃縮：將pLVX-IL15-41BBL或pLVX-IRES-ZsGreen1質粒與第二代慢病毒包裝質粒psPAX2、pMD2.G用氯化鈣轉染法共同轉染至293T細胞中，轉染6～12 h后更換新鮮的293T細胞完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10% FBS+ 1%谷氨酰胺）。轉染48 h和72 h后分別收獲1次病毒，200×g離心5 min后，上清液用0.45 μm濾器過濾后，轉移至超高速離心管中，4 ℃，72 000×g離心 2 h，棄去上清液后用適量DPBS重懸慢病毒沉淀，分裝后置于-80 ℃長期保存，即為收獲的IL15-41BBL慢病毒或ZsGreen1慢病毒。

圖1 pLVX-IL15-41BBL慢病毒表達載體的構建

4.慢病毒的滴度檢測：第1天，將293T細胞消化計數(shù)后稀釋至2×105個/ml，加入12 孔板，1 ml/ 孔，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；第2天，將上述制備的ZsGreen1慢病毒用293T細胞完全培養(yǎng)基進行10倍梯度稀釋，棄除12孔板中的舊 培 養(yǎng) 基，用 1 ml未 稀 釋、1 : 10、1 : 102、1 : 103、1 : 104、1 : 105稀釋的 ZsGreen1 慢病毒（含 8 μg/ml Polybrene）感染 293T 細胞，置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，更換新鮮的293T細胞完全培養(yǎng)基。慢病毒感染48 h后，消化293T細胞，DPBS重懸后，用流式細胞儀檢測ZsGreen1+293T細胞比例。對細胞比例在10%～ 30%之間的孔進行滴度計算。慢病毒的滴度計算公式如下：滴度（TU/ ml）=（接種細胞數(shù)×ZsGreen1+ 293T細胞百分比×1 000）/病毒原液體積（μl）。

5.K562-IL15-41BBL穩(wěn)轉細胞株的構建：取1×106個K562細胞，參照ZsGreen1慢病毒的滴度檢測結果，以感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）= 30加入IL15-41BBL慢病毒，另外加入8 μg/ml Polybrene，37 ℃、5%CO2培 養(yǎng) 箱 培 養(yǎng)，6 h后離心換液，換成K562細胞完全培養(yǎng)基（RPMI 1640+10%FBS）；感染24 h后，重復感染1次；72 h后，加入5 μg/ml嘌呤霉素進行篩選；24 h后換成不含嘌呤霉素的K562細胞完全培養(yǎng)基，48 h后加入 10 μg/ml嘌呤霉素，繼續(xù)篩選培養(yǎng)；K562細胞狀態(tài)生長良好，有克隆團后，取適量細胞懸液，以未感染慢病毒的K562細胞作為陰性對照，流式檢測IL15- 41BBL+ K562細胞的比例；根據(jù)流式檢測結果，加入IL15-41BBL慢病毒重復感染，再篩選，直至IL15-41BBL+ K562細胞比例達到95%以上。

6.NK細胞的誘導培養(yǎng)：用密度梯度離心法從健康志愿者來源的肝素鈉抗凝外周血中分離PBMC細胞，將3×106個PBMC細胞和0.5×106個經(jīng)過輻照（100 Gy）的K562細胞或K562-IL15-41BBL細胞重懸在含10 U/ml IL-2的NK細胞無血清培養(yǎng)基中，接種至24孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。另外用流式細胞儀檢測PBMC細胞中CD3-CD56+NK細胞比例。后續(xù)根據(jù)NK細胞生長狀況用新鮮的NK細胞培養(yǎng)基進行補液或半量換液。第16天：收獲NK細胞，血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，流式細胞儀檢測CD3-CD56+NK細胞比例。陰性對照K562滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)的NK細胞標為NC-NK細胞，K562-IL15-41BBL滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)的NK細胞標為KIB-NK細胞。

7.PBMC細胞和NK細胞表型的檢測：取1×106個PBMC細胞或1×106個滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)16 d的NK細胞（NC-NK、KIB-NK），按照抗體使用說明書用流式抗體CD3-FITC、CD56-PE進行染色，上流式細胞儀檢測CD3-CD56+NK細胞比例。

8.NK細胞內細胞因子的檢測：分別取1×106個滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)16 d的NC-NK細胞和KIB-NK細胞，按照抗體使用說明書用流式抗體CD3-PerCP/Cy5.5、CD56-FITC進行染色后，用4%多聚甲醛室溫固定，DPBS洗滌1次后，用細胞內染色滲透洗滌液滌并重懸，加入IFN-γ-PE、TNF-α- APC 流式抗體，室溫避光孵育 15～20 min后，用細胞內染色滲透洗滌液及DPBS各洗滌1次后，DPBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測細胞因子IFN-γ、TNF-α表達陽性的NK細胞比例。

9.NK細胞分泌細胞因子的檢測：分別取滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)16 d的NC-NK細胞和KIB- NK細胞培養(yǎng)上清，按照LEGENDplex?Human Th Cytokine Panel （13-plex）試劑盒使用說明處理上清樣本，流式細胞儀上樣檢測上清液中的IFN-γ和TNF-α兩種細胞因子。利用LEGENDplex V8.0軟件根據(jù)已知濃度的標準品制作標準曲線，從而推算出NC-NK細胞和KIB-NK細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α細胞因子的濃度。

10.NK細胞的細胞毒性檢測 （LDH法）：以NC-NK細胞和KIB-NK細胞作為效應細胞，選取K562細胞系和人肺癌細胞系H520作為殺傷靶細胞。按照效應細胞：靶細胞= 2.5 : 1的效靶比設置共培養(yǎng)反應體系，同時設置無細胞的培養(yǎng)液孔 （扣除背景）、只有靶細胞的樣品對照孔以及只有靶細胞用于后續(xù)裂解的孔 （樣品最大酶活性孔）。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)3 h后，在樣品最大酶活性孔加入總體積10%的LDH釋放試劑。共培養(yǎng)4 h后，將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機離心，分別取各孔的上清液120 μl，加入到一新的96孔板中，隨即進行樣品測定；各孔分別加入60 μl LDH檢測工作液，充分混勻，室溫避光孵育30 min，于490 nm處測定吸光度。細胞毒性或死亡率計算公式如下：細胞毒性或死亡率 （%）= （實驗組樣品吸光度-樣品對照孔吸光度） / （樣品最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度）×100%。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用Graphpad prism 5.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗結果以表示。培養(yǎng)至第16天的兩組NK細胞的總細胞數(shù)量、NK細胞增殖倍數(shù)、細胞因子分泌功能及細胞殺傷能力的比較采用兩樣本t檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、 pLVX-IL15-41BBL慢病毒表達載體的構建

將“CD8α信號肽-IL15-CD8α跨 膜 區(qū)-P2A-41BBL”基因片段插入至pLVX-IRES-Puro質粒中獲得慢病毒表達載體pLVX-IL15-41BBL。pLVXIL15-41BBL質粒轉化克隆PCR鑒定電泳圖如圖2所示，挑取的8個轉化克隆PCR產(chǎn)物均在1.7～1.8 kb處有清晰的條帶，與預期目的片段大小一致。

圖2 pLVX-IL15-41BBL質粒轉化克隆PCR產(chǎn)物的電泳條帶

圖3 梯度稀釋的ZsGreen1慢病毒感染293T細胞的流式檢測

二、慢病毒的滴度檢測

用10倍梯度稀釋的ZsGreen1慢病毒感染293T細胞，感染48 h后，各組ZsGreen1+293T細胞流式檢測結果如圖3所示。根據(jù)流式檢測結果，選取稀釋103倍的慢病毒感染組作為病毒滴度計算組。根據(jù)公式，計算本實驗中制備的ZsGreen1慢病毒的滴度 =（2×105×0.1440×1 000）/1=2.88× 107T /ml。

三、K562-IL15-41BBL穩(wěn)轉細胞株的構建

K562細胞系經(jīng)過IL15-41BBL慢病毒感染和嘌呤霉素篩選后，獲得穩(wěn)定表達IL15-41BBL蛋白的K562-IL15-41BBL穩(wěn)轉細胞株。IL15和41BBL兩種蛋白在K562細胞內經(jīng)過P2A自剪切后，分別單獨表達在K562細胞膜上，如圖4所示。

圖4 K562細胞內目的蛋白自剪切及跨膜表達

圖5 慢病毒感染前后IL15-41BBL+ K562細胞的流式檢測

第一輪病毒感染+嘌呤霉素篩選后IL15-41BBL+ K562細胞比例約為46.60%，經(jīng)過兩輪慢病毒感染和嘌呤霉素篩選后，IL15-41BBL+ K562細胞比例達到96.50%，感染前后IL15-41BBL+K562細胞的流式檢測結果見圖5所示。

四、NK細胞誘導培養(yǎng)

PBMC細胞經(jīng)過輻照的滋養(yǎng)層K562細胞或K562-IL15-41BBL細胞誘導培養(yǎng)16 d后，分別獲得NC-NK細胞和KIB-NK細胞（圖 6）。

圖6 倒置顯微鏡下觀察經(jīng)滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)16 d后獲得的兩組自然殺傷細胞（明場，×100）

總細胞數(shù)量計數(shù)結果顯示，NC-NK組總細胞數(shù)為（480.26±34.78）×106個，KIB-NK組總細胞數(shù)為（948.95±10.41）×106個，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。兩組細胞誘導培養(yǎng)16 d的生長曲線圖如圖7所示。

圖7 兩組自然殺傷細胞誘導培養(yǎng)16 d的生長曲線

第0 天的PBMC細胞、誘導培養(yǎng)第16天的NC-NK細胞、KIB-NK細胞的細胞表型流式檢測散點圖 （圖8），CD3-CD56+NK細胞比例分別為8.70%、45.04%和94.79%。

根據(jù)總細胞數(shù)量和細胞表型檢測結果，計算NC-NK組和KIB-NK組中CD3-CD56+NK細胞的增殖倍數(shù)（圖 9），分別為（1079.12±60.01）倍和（4480.43±37.80）倍，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。

五、NK細胞活性和功能檢測

用流式細胞法檢測誘導培養(yǎng)16 d的NC-NK細胞和KIB-NK細胞內IFN-γ、TNF-α細胞因子的表達情況，流式散點檢測圖見圖10，詳細檢測結果如下：IFN-γ+NC-NK 細胞比例為（16.28±2.86）%，TNF-α+NC-NK 細胞比例為（14.53±1.15）%；IFN-γ+KIB-NK 細 胞 比 例 為（63.07±3.37）%，TNF-α+KIB-NK細胞比例為（54.85±2.04）%。KIB-NK細胞內兩種細胞因子的表達均高于NC-NK細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01，圖 11）。

圖8 外周血單個核細胞及誘導培養(yǎng)16 d的兩組自然殺傷細胞的細胞表型流式檢測

圖9 CD3- CD56+ 自然殺傷細胞的增殖倍數(shù)比較

用流式細胞熒光微球技術檢測誘導培養(yǎng)16 d的NC-NK細胞和KIB-NK細胞上清液中IFN-γ、TNF-α細胞因子的表達情況，流式檢測散點圖如圖12所示，詳細檢測結果如下：NC-NK細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度為 （44.99±4.74）pg/ml，TNF-α濃度為 （11.09±2.45）pg/ml；KIB-NK細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度為 （111.39±6.95）pg/ml，TNF-α濃度為 （32.76±3.23）pg/ml。KIB-NK細胞培養(yǎng)上清中兩種細胞因子的含量均高于NC-NK細胞培養(yǎng)上清，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01，圖 13）。

用LDH法檢測誘導培養(yǎng)16 d的NC-NK細胞和KIB-NK細胞對腫瘤細胞系K562和H520細胞的殺傷活性，結果如下：NC-NK對K562細胞的殺傷比例為（48.53±6.66）%，NC-NK對H520細胞的殺傷比例為（35.85±3.99）%；KIB-NK對K562細胞的殺傷比例為（78.52±7.36）%，KIB-NK對H520細胞的殺傷比例為（65.03±3.27）%。KIB-NK細胞對兩種腫瘤細胞的殺傷比例均高于NC-NK細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01，圖 14）。

討論

NK細胞在人體外周血內存在的數(shù)量很少。腫瘤患者體內NK細胞的數(shù)量及活性都發(fā)生了改變[24]。因此，體外擴增出大量高活性、高殺傷能力的NK細胞，回輸?shù)饺梭w后可以提高機體免疫力，提高抗腫瘤、抗感染的能力。

目前，體外培養(yǎng)NK細胞的方法主要有以下2 種：（1）細胞因子組合法，如采用 IL-2、IL- 15、IL-18、IL-21等細胞因子誘導NK細胞體外擴增。Torelli等[17]利用IL-2、IL-15誘導培養(yǎng)人 PBMC細胞，在第14 天 NK細胞群平均增殖了（15.7±4.7） 倍，存活率為（96±0.5）%；（2）滋養(yǎng)層細胞法，如采用基因修飾的K562細胞誘導NK細胞擴增。Baek等[9]利用構建的K562-mbIL15-41BBL滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)人PBMC細胞，經(jīng)過21 d的體外培養(yǎng)，NK細胞增殖倍數(shù)達到980倍。目前已有的研究顯示，采用滋養(yǎng)層細胞誘導培養(yǎng)法在NK細胞擴增倍數(shù)和純度上要優(yōu)于細胞因子組合的擴增方案，但仍具有很大的改進空間。

圖10 兩組自然殺傷細胞內γ-干擾素、α-干擾素細胞因子表達的流式散點檢測

圖11 兩組自然殺傷細胞內γ-干擾素、α-干擾素細胞因子表達陽性比例

本研究將IL-15和4-1BBL基因通過一種自剪切多肽P2A進行連接，避免了多基因共表達時下游基因表達量低、蛋白活性低的缺陷。P2A連接的IL-15和4-1BBL基因通過慢病毒載體導入K562細胞中，經(jīng)過嘌呤霉素篩選后，獲得K562-IL15-41BBL穩(wěn)轉細胞株。K562細胞表面穩(wěn)定表達的IL-15和4-1BBL分子均具有促進NK細胞增殖，維持NK細胞活性的作用，與PBMC細胞共培養(yǎng)時，可選擇性地激活并擴增PBMC細胞中的NK細胞。本研究實驗結果表明：經(jīng)過輻照的K562-IL15-41BBL細胞可在16 d內使PBMC中的NK細胞純度達到94.79%，增殖倍數(shù)達到4 480倍，遠高于野生型K562細胞誘導培養(yǎng)組，且優(yōu)于Baek等[9]利用K562-mbIL15-41BBL滋養(yǎng)層細胞擴增NK細胞的效果。IFN-γ和TNF-α是由活化的NK細胞釋放的細胞因子，可提高NK的殺傷功能，對于機體抵抗感染、抗腫瘤起著關鍵作用[25]。胞內細胞因子流式檢測結果表明：KIB-NK組細胞內表達IFN-γ和TNF- α的NK細胞比例均高于NC-NK組；細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子含量的流式檢測結果表明：KIB-NK細胞分泌的IFN-γ和TNF-α兩種細胞因子的濃度均高于NC-NK組；體外殺傷實驗結果顯示：KIB-NK細胞對K562細胞和H520細胞的細胞毒性均高于NC-NK細胞。

圖12 兩組自然殺傷細胞培養(yǎng)上清液中γ-干擾素、α-干擾素細胞因子的流式散點檢測

圖13 兩組自然殺傷細胞培養(yǎng)上清液中γ-干擾素、α-干擾素細胞因子濃度的比較

圖14 兩組自然殺傷細胞對腫瘤細胞系K562和H520細胞的殺傷比例

綜上所述，本研究成功制備了穩(wěn)定高表達IL-15和4-1BBL的K562滋養(yǎng)層細胞。經(jīng)過輻照后，該穩(wěn)定細胞株在體外與PBMC細胞共培養(yǎng)可獲得高增殖倍數(shù)、高純度和高細胞毒性的人NK細胞。該研究的創(chuàng)新點在于利用自剪切多肽P2A構建穩(wěn)定高表達IL-15和4-1BBL的K562滋養(yǎng)層細胞株，提高了人PBMC細胞誘導的NK細胞增殖效率和細胞毒活性。跟目前已有技術相比，只需轉染一個目的蛋白，所表達蛋白在胞內進行自剪切，從而提高了IL-15和4-1BBL共同跨膜表達細胞的陽性數(shù)量和比例；同時，該方法降低了兩種慢病毒感染滋養(yǎng)層細胞所導致的細胞毒性，提升了病毒感染效率，降低了成本。未來，NK細胞在治療腫瘤或感染性疾病方面的臨床使用安全性和有效性還需進一步研究，隨著NK細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展，NK細胞的臨床應用會越來越廣泛。