人中鼻甲來源嗅鞘細胞培養(yǎng)與鑒定的初步研究

陳恒 宋振濤 劉小盾 曲廷瑜

成人中樞神經損傷后往往難以有效修復。尤其重度損傷患者，即神經橫斷，由于自身無法進行軸突再生且受損區(qū)域形成抑制神經修復的瘢痕組織，使得病患終身致殘，給患者家庭及社會帶來極大負擔[1]。近年研究發(fā)現，中樞神經系統中，嗅神經系統神經元可以不斷再生或修復，促進嗅神經再生與修復的關鍵細胞就是嗅鞘細胞。

早在上世紀，就已有研究團隊從哺乳動物嗅球外層及鼻黏膜中分離出嗅鞘細胞[2-3]。盡管研究發(fā)現，嗅鞘細胞兼具星形膠質細胞與施旺細胞的特點與功能，但仍發(fā)現其具有某些特有性狀，所以一般將嗅鞘細胞視為單獨一類神經膠質細胞[4]?，F有研究顯示，嗅鞘細胞在神經再生與修復領域擁有極大的應用優(yōu)勢，主要體現在嗅鞘細胞可以促進神經軸突再生、可包繞新生軸突形成髓鞘、具有引導新生軸突通過瘢痕組織和外周神經-中樞神經邊界的作用。目前國內外已經進行了較多從嗅球與嗅黏膜中分離嗅鞘細胞的研究，取得了豐富的成果[5-6]。

本研究探索了一種從人體安全有效獲得嗅鞘細胞的方法并對獲得的細胞進行了鑒定。

材料與方法

一、材料

人中鼻甲黏膜組織（取自愿捐獻者的中鼻甲及部分鼻中隔組織）、DMEM/F12培養(yǎng)基、Anti-Anti抗生素、DPBS平衡鹽溶液、PBS平衡鹽溶液、胎牛 血 清（FBS）（美 國 Gbico公 司）、Accutase（美國Milipore公司），中性蛋白酶Ⅱ與膠原酶Ⅳ （美國Life Science公司），Arb-C與DAPI染料 （美國Sigma公司），60 mm直徑培養(yǎng)皿 （美國Corning公司）、兔抗人p75及兔抗人S100β抗體 （英國Abcam公司），驢血清、驢抗兔二抗 （美國CHEMICON CA公司）。剪刀、鑷子、一次性細胞刮刀。

二、方法

1.樣本的清洗：采集自愿捐獻者的中鼻甲黏膜（1 cm2），將樣本放入儲運瓶（瓶內裝有足夠浸沒樣本的平衡鹽溶液）并貼好標簽置于4℃～ 25℃運輸箱內儲運。樣本于采集后2 h內開始處理。

對儲運瓶外表面進行75%酒精擦拭消毒，在生物安全柜內打開儲運瓶瓶蓋，將中鼻甲黏膜用手術鑷整體取出，置于含有20 ml清洗液（含1%雙抗的DPBS溶液）的50 ml離心管中清洗30 s，并重復清洗2次。將清洗后的中鼻甲黏膜用手術鑷移至1個無菌塑料平皿中，用鑷子去除黏膜表面殘存的血污，最后用DPBS沖洗1遍。

2.樣本的消化：將中鼻甲黏膜移入預熱至37 ℃的中性蛋白酶Ⅱ中水域消化30 min，期間不斷搖動使組織均勻消化。將消化后的組織用DPBS溶液清洗1次，用細胞刮刀輕輕剝去黏膜上皮層。將剝去上皮層的黏膜置于50 ml離心管內剪碎，加入適量膠原酶Ⅳ于37 ℃水域中消化40 min，期間不斷搖動。以10 ml移液管輕柔吹打組織，隨后加入與膠原酶Ⅳ等體積的原代培養(yǎng)基（含有DMEM/ F-12 培養(yǎng)基 500 ml，胎牛血清 50 ml，L-谷氨酰胺2 mmol/L，Anti-Anti抗生素 5 ml）中和消化酶，350×g離心5 min后棄去全部上清。以8 ml原代培養(yǎng)基重懸組織，將其均勻接種于2個60 mm培養(yǎng)皿中。另取數例樣本，在經過中性蛋白酶消化后，不剝離上皮層，直接進行后續(xù)操作。

3.細胞原代培養(yǎng)：細胞原代培養(yǎng)前5 d不進行換液等任何處理，第5天將培養(yǎng)皿內液體全部吸出至50 ml離心管內，以240×g離心5 min后棄去1/2最上層清液，利用剩余上清液重懸下層沉淀后移入原皿培養(yǎng)，同時補加適量原代培養(yǎng)基。隨后每隔2～3 d半量換液1次。

4.細胞傳代培養(yǎng)：直至原代細胞生長至80%融合。每皿細胞加入1 ml 37 ℃預熱的Accutase消化酶后置于37 ℃溫箱內消化90 s，當成纖維樣細胞皺縮而上皮細胞未皺縮時，輕柔吹下后，細胞懸液以240×g離心5 min，棄去上清后，以傳代培養(yǎng)基（含有DMEM/ F-12培養(yǎng)基500 ml，胎牛血清100 ml，L-谷 氨 酰 胺 2 mmol/L，BPE 20 μg/ml，Forskolin 2 μmol/L，Anti-Anti抗生素 5 ml）重懸細胞接種于2個培養(yǎng)皿（φ60 mm）內，每隔2 d換液1次。

5.細胞加壓篩選：培養(yǎng)皿內傳代細胞生長至50%融合后，培養(yǎng)體系內加入5 μg/ml Arb-C連續(xù)作用48 h，細胞生長速度減慢同時有少量細胞死亡漂浮，如圖2所示。以新傳代培養(yǎng)基換掉培養(yǎng)皿內原有培養(yǎng)基，隨后根據皿內細胞生長狀態(tài)，每隔2～3 d 換液 1 次。

6.細胞免疫熒光鑒定：加壓篩選后待細胞融合度達到80%，取部分消化后細胞接種于細胞爬片上。待爬片細胞融合度達到50%，取出爬片以DPBS溶液漂洗1次。以4%的多聚甲醛溶液室溫固定20 min后吸除固定液；隨后加入0.1%的TritonX-100溶液，室溫孵育10 min后吸除全部液體，PBS平衡鹽溶液漂洗爬片5次，每次5 min。以5%驢血清稀釋一抗Rabbit Anti-human S100β或Rabbit Anti-human p75至1 : 400終濃度。將稀釋好的一抗加入細胞爬片上，4 ℃過夜孵育。孵育后以PBS溶液漂洗爬片3次，每次5 min。細胞爬片上加入終濃度為1 : 200的標記有熒光基團的驢抗兔二抗，37 ℃孵育1 h后PBS漂洗爬片3次，每次5 min。最后細胞爬片上滴加防熒光猝滅劑含DAPI，染核10 min后，100倍顯微鏡下觀察熒光標記并隨機選取5個視野計算標記物陽性率。

三、統計學分析方法

使用SPSS 20.0統計學軟件進行統計學分析。上皮樣細胞比例、S100β和p75陽性細胞比例用表示，組間比較采用雙側獨立樣本t檢驗，方差齊性采用Levene檢驗（執(zhí)行t檢驗時SPSS自動計算）。以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、細胞原代培養(yǎng)

中鼻甲黏膜組織進行消化、剝離上皮層、剪碎操作，隨后進行組織塊培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后可見大量成纖維樣細胞遷出，同時可見有部分上皮樣細胞（圖1a）。另取樣本，采用不剝離上皮層直接消化、剪碎并培養(yǎng)7 d后獲得的原代細胞中上皮樣細胞比例較高（圖 1b）。

分別選取3例剝離上皮層與不剝離上皮層的鼻黏膜原代培養(yǎng)7 d后的細胞進行比較。每例樣本鏡下隨機選擇5個視野，統計上皮樣細胞所占比例的平均值作為該例樣本原代細胞中上皮樣細胞的比值。將不剝離上皮層的原代細胞定義為上皮層組，剝離上皮層的原代細胞定義為剝離上皮層組。上皮層組中上皮樣細胞比例為（92.23±3.93）%，剝離上皮層組中上皮樣細胞比例為（77.63±2.97）%，兩組差異具有統計學意義（t= 5.129，P= 0.007，圖 2）。

二、細胞加壓篩選

使用消化酶對原代細胞進行短時間消化（1～2min），以成纖維樣細胞皺縮而上皮樣細胞未出現明顯變化為宜，以此獲得純度較高的成纖維樣細胞。隨后對收獲的成纖維樣細胞進行傳代培養(yǎng)，待第1 次傳代培養(yǎng)的細胞融合度達到50%后進行Arb-C加壓篩選。篩選后1～ 2 d可見大量細胞死亡，細胞密度降低（圖3）。

三、細胞免疫熒光鑒定

圖1 光鏡下觀察培養(yǎng)7 d的原代細胞（×100）

圖2 原代細胞中上皮樣細胞比例對比

圖3 光鏡下觀察加壓篩選2 d后的傳代細胞（×100）

當篩選后的第1代細胞融合度達到80%后，取部分細胞接種于細胞爬片上進行免疫熒光鑒定，可見大量雙極或多極樣細胞。對獲得的樣本進行統計分析，發(fā)現加壓篩選后的第1代細胞中（8.1±1.7）%的細胞呈 S100β陽性（圖 4a），另有少量細胞呈p75陽性（圖4b）。

圖4 間接免疫熒光鑒定的傳代細胞（×400）

討論

本實驗取鼻息肉患者術中已切除并自愿捐獻的中鼻甲組織，組織獲取方法參照已發(fā)表的同類研究[7-8]。分離獲得上皮層以下黏膜組織，經培養(yǎng)篩選獲得傳代細胞。對傳代細胞進行間接免疫熒光鑒定，結果顯示部分細胞呈S100β陽性，少量細胞呈p75陽性，符合嗅鞘細胞的典型標記特征[9-10]。

根據解剖學相關研究，發(fā)現人上鼻甲黏膜中嗅神經分布密度較大[11]。然而，上鼻甲黏膜總面積小，若滿足實驗需求需采集絕大部分的上鼻甲組織，易對供者嗅覺功能造成難以恢復的損傷；且由于上鼻甲臨近篩骨，取材時若操作不當易造成腦脊液滲出，安全性較差。綜合多方面原因，使得采集上鼻甲組織制備嗅鞘細胞存在諸多困難。同時，有文章報道，人中鼻甲及部分鼻中隔黏膜中也存在一定數量的嗅鞘細胞[12]，這就為從中鼻甲/鼻中隔分離嗅鞘細胞奠定了基礎。另外，由于中鼻甲面積較大取材方便，且并不承擔主要的嗅覺功能，采集后對人的嗅覺功能沒有較大損傷。這使得中鼻甲成為制備自體嗅鞘細胞的良好選材。

本研究之初，直接剪碎鼻黏膜組織后消化獲得組織塊，這與大多數報道一致。結果發(fā)現，有大量上皮樣細胞從組織塊中遷出，這不利于嗅鞘細胞的后期純化。所以根據鼻黏膜組織學特點[6,13]，嘗試將上皮層從組織中分離后，對下層含有嗅鞘細胞的固有層進行單獨培養(yǎng)。通過反復嘗試，采取先用中性蛋白酶Ⅱ消化鼻黏膜組織，以使上皮層與固有層分離；隨后用細胞刮刀剝去上皮層；最后再用剪碎、吹打并聯合膠原酶Ⅳ消化的方法對固有層進行處理，得到較分散的固有層組織塊。從固有層組織塊的培養(yǎng)情況看，原代細胞中上皮樣細胞的比例較之前有顯著降低。雖然成功剝離了固有層之上的上皮層，但固有層與下層結締組織聯系緊密無法有效剝離，所獲得的原代細胞中成纖維樣細比例仍然較高。

已有報道，大多從嗅球（嗅腦）中分離制備嗅鞘細胞，在原代培養(yǎng)消化后，利用嗅鞘細胞與成纖維樣細胞貼壁速度不同進行分離純化，即差速貼壁法，該操作往往需持續(xù)數日至數周[14]。在實踐中發(fā)現，由于人中鼻甲嗅黏膜中嗅鞘細胞比例過低，成纖維樣差速貼壁后，培養(yǎng)上清液中剩余細胞稀少。隨后將培養(yǎng)上清轉移至新皿內進行二次貼壁，但由于細胞生長存在數量依賴性，二次貼壁后存活的細胞稀少，導致細胞迅速進入生長停滯狀態(tài)無法用于后續(xù)實驗，所以舍去該步驟。通過以上優(yōu)化，本研究中嗅鞘細胞的培養(yǎng)周期低于同類研究[15]。

細胞經過一段時間擴大培養(yǎng)后，利用阿糖胞苷對細胞進行短時間加壓篩選，以抑制傳代細胞中成纖維樣細胞亞群的增殖。加壓后大量細胞陸續(xù)凋亡，待恢復一定細胞數量后立即進行鑒定。對獲得的8 例樣本進行統計分析，發(fā)現加壓篩選后的第1代細胞中（8.1±1.7）%的細胞呈S100β陽性，少量細胞呈p75陽性（p75陽性細胞數量極少難以進行統計）。以上比例，與國外上鼻甲嗅鞘細胞同類研究結果一致[7]。隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，成纖維樣細胞最終又取得增殖優(yōu)勢，S100β陽性細胞與p75陽性細胞比例逐漸下降?；谝陨涎芯?，認為中鼻甲黏膜組織較嗅球組織在分離制備嗅鞘細胞方面難度更大，主要體現在中鼻甲黏膜組織中成纖維細胞比例極高，傳統手段難以有效去除。

有研究報道，嗅鞘細胞可進一步分為兩大亞群[16]，其中一個亞群表達S100β標記而另一個亞群表達p75標記。同時這兩大亞群細胞并不是嚴格區(qū)分的，甚至細胞的標記特征與功能可以在這兩大亞群間轉換[17]。獲得的嗅鞘細胞也可分為兩個亞群，符合相關報道。

Ramón-Cueto等[18]于1994年最早利用嗅鞘細胞治療動物脊髓損傷，自此拉開了嗅鞘細胞治療中樞神系統疾病的動物/臨床研究的序幕。國內最早進行嗅鞘細胞臨床研究的是海軍總醫(yī)院的黃紅云團隊，他們不僅分離得到了嗅鞘細胞，并利用該細胞進行了數例臨床輸注實驗用于治療脊髓損傷等中樞神經系統疾病，獲取了大量臨床資料[19]。國外也在一直進行嗅鞘細胞治療中樞神經系統疾病的臨床研究，但取得的結果多種多樣。即便取得了積極療效，往往也無法重復研究結果，穩(wěn)定性無法保證[7]。這可能是由于獲取嗅鞘細胞的部位、方式及后期細胞培養(yǎng)方法有差異導致的。

本研究從人中鼻甲采集黏膜組織，安全性高，患者嗅覺功能損傷小。采用的分離培養(yǎng)嗅鞘細胞的方法較傳統方法進一步優(yōu)化，細胞培養(yǎng)周期縮短，同時嗅鞘細胞標記物比例與同類研究一致[7,15]。所獲得的嗅鞘細胞可用于各類神經系統疾病的自體移植治療，不產生免疫排斥[19]；取材部位為中鼻甲黏膜，對自身嗅覺功能沒有較大損害[6-7,20]。這就為后續(xù)開展中鼻甲來源嗅鞘細胞治療中樞神經系統疾病的臨床前研究與臨床試驗奠定了基礎。