臭氧通過調(diào)節(jié)HIF-1α-VEGF信號(hào)通路治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究

楊妮娜 詹景棣 柳海曉 許心弦

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性炎癥性疾病，其主要病理特征是全身關(guān)節(jié)滑膜炎及血管翳形成，引起關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞，病變范圍累及骨骼、肌肉、韌帶及滑膜組織，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，影響患者生存質(zhì)量?，F(xiàn)有研究表明，RA患者滑膜細(xì)胞及滑膜組織中浸潤的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等通過自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，其中低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是導(dǎo)致滑膜炎的重要的細(xì)胞因子之一，可與多種形式的細(xì)胞受體結(jié)合，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管的新生，促進(jìn)炎性細(xì)胞的浸潤，在RA血管翳發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。

近年來在風(fēng)濕性疾病領(lǐng)域中出現(xiàn)了關(guān)于臭氧（ozone，O3）治療炎癥性關(guān)節(jié)病的研究，結(jié)果提示O3具有抑制炎癥因子釋放、促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡、鎮(zhèn)痛等作用[3-4]，但是其作用機(jī)制相關(guān)的信號(hào)通路研究報(bào)道較少。本研究采用O3治療大鼠RA模型，分析其對(duì)大鼠相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響，以探索O3治療RA的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑購于美國 Sigma公司（批號(hào)：C7806、105600）；大鼠 HIF-1α、VEGF定量檢測試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司（批號(hào)：190047-201707、130570-201706）；細(xì)胞蛋白提取試劑盒、ECL試劑盒購于美國Beyotime公司（批號(hào)：P0033、P0018S）；HIF-1α、VEGF、β-actin 一抗購于美國 Cell Signaling 公司（批號(hào)：3716、9943、1025S）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購于美國Thermo Scientific公司（批號(hào)：K1022）；Trizol試劑盒、SYBR Green RT-qPCR Kit均購于美國Invitrogen公司（批號(hào)：10596018、C11744050）；HIF-1α、VEGF、GAPDH 引物由美國Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。醫(yī)用臭氧發(fā)生器為德國Hermann公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康的SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量180～220g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[SYXK（浙）2010-0150]。所有大鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料在相同條件下喂養(yǎng)，自由飲食及活動(dòng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，每組10只，即對(duì)照組（Con組）、RA組和O3組。

1.2.2 大鼠RA動(dòng)物模型的制備 RA模型的建立采用注射用弗氏完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原進(jìn)行誘導(dǎo)。具體過程如下：取牛Ⅱ型膠原蛋白和0.1mol/L冰醋酸溶液配置成質(zhì)量濃度為2mg/ml的混合液，4℃過夜。次日在冰浴條件下取上述混合液與完全弗氏佐劑按體積比1∶1混合，并研缽至乳白色黏稠液體狀，置入乳化器中反復(fù)抽推，直至完全乳化，膠原濃度為1mg/ml。RA組和O3組大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為0.5ml/100g，使用75%乙醇消毒后，將制備好的牛Ⅱ型膠原蛋白乳液1ml分點(diǎn)注入大鼠背部脊柱兩側(cè)及尾部皮下，1周后注射0.5ml進(jìn)行免疫強(qiáng)化，誘導(dǎo)RA模型。Con組不作任何特殊處理。

1.2.3 給藥方法 造模成功后，O3組大鼠右膝關(guān)節(jié)腔注射 O3，1ml/次，1次/周，連續(xù) 4周；Con 組和 RA 組右膝關(guān)節(jié)腔注射0.9%氯化鈉溶液，劑量和用法同上。

1.2.4 大鼠右膝關(guān)節(jié)腫脹率測算 于治療前后采用軟尺測量大鼠右膝關(guān)節(jié)的周長，每次共測量3遍，取3遍測量結(jié)果的平均值，將治療前后的膝關(guān)節(jié)周長進(jìn)行比較，計(jì)算膝關(guān)節(jié)腫脹率[3]。膝關(guān)節(jié)腫脹率（%）=（治療后膝關(guān)節(jié)周長-治療前膝關(guān)節(jié)周長）/治療前膝關(guān)節(jié)周長×100%。

1.2.5 大鼠血清及關(guān)節(jié)液HIF-1α、VEGF水平測定 治療開始前及結(jié)束后，抽取大鼠腹腔血5ml，充分離心后分離血清，采用ELISA法檢測HIF-1α、VEGF水平，具體操作參考試劑盒使用說明書。治療結(jié)束后另抽取右膝關(guān)節(jié)液同法檢測上述細(xì)胞因子水平。

1.2.6 大鼠滑膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，頸椎脫位法處死大鼠后，分離右膝關(guān)節(jié)滑膜組織，-80℃保存?zhèn)溆?。取約100mg大鼠右膝關(guān)節(jié)滑膜組織，加入1ml蛋白勻漿緩沖液，混入1%PMSF后冰浴下勻漿操作。充分離心后取上清液，使用BCA法測定蛋白含量。樣本經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)模、封閉，分別加入 HIF-1α、VEGF、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶500），4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗（稀釋比例1∶2 500），室溫下孵化，洗膜后加顯色劑顯影，使用Image Lab version 3.0分析結(jié)果。

1.2.7 大鼠滑膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取大鼠右膝關(guān)節(jié)滑膜組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，酶標(biāo)儀檢測RNA純度及濃度。取RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后參照試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物如下：HIF-1α上游引物：GATGAATCAAAAGCAGTGACGAAGG，下游：ATGCCTTAGCAGTGGTCATTTCTTC；VEGF上游引物：CGACAGAAGGGGAGCAGAAAG，下游：GCACTCCAGGGCTTCATCATT；GAPDH 上游引物：TGGAGTCTACTGGCGTCTT，下游：TGTCATATTTCTCGTGGTTCA。反應(yīng)條件：95℃ 1min 預(yù)變性，95℃ 5s，60℃ 60s，最終 72℃ 10min，共40個(gè)循環(huán)。每次擴(kuò)增以GAPDH為內(nèi)參，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用 2-ΔΔCt法分別計(jì)算 HIF-1α、VEGF mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹率比較 治療結(jié)束后各組大鼠右膝關(guān)節(jié)皮膚黏膜完好，無破潰。與Con組比較，RA組和O3組大鼠右膝關(guān)節(jié)腫脹率明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與RA組比較，O3組右膝關(guān)節(jié)腫脹率明顯減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠右膝關(guān)節(jié)腫脹率比較（注：與C on組比較，*P＜0.05；與 R A 組比較，△P＜0.05）

2.2 各組大鼠血清HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較 治療開始前，各組大鼠血清中HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。治療后，與Con組比較，RA組和O3組大鼠血清中上述細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平均明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而RA組和O3組血清中上述細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠血清H I F-1α、V E G F蛋白表達(dá)的水平比較（注：與C on組比較，*P＜0.05；與R A組比較，△P＜0.05）

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)液HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較 與Con組比較，RA組和O3組大鼠關(guān)節(jié)液中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。與RA組比較，O3組HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見圖 3。

圖3 各組關(guān)節(jié)液H I F-1α、V E G F蛋白表達(dá)的水平比較（注：與C on組比較，*P＜0.05；與R A組比較，△P＜0.05）

2.4 各組大鼠滑膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較 與Con組比較，RA組和O3組大鼠滑膜組織中HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與RA組比較，O3組HIF-1α和VEGF表達(dá)水平均明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見圖4、5。

2.5 各組大鼠滑膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)的影響 與Con組比較，RA組和O3組大鼠滑膜組織中HIF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平均明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。與RA組比較，O3組上述因子mRNA表達(dá)水平均明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見圖6。

圖5 各組大鼠滑膜組織H I F-1α、V E G F蛋白表達(dá)水平比較

圖6 各組大鼠滑膜組織H I F-1α、V E G F m R NA表達(dá)水平比較

3 討論

RA是一種系統(tǒng)性慢性自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。既往研究顯示，關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜炎性增生及大量血管翳形成是其特征性病理改變，而VEGF的分泌能夠促進(jìn)滑膜中大量血管新生，對(duì)血管翳的形成起著重要作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)液和血清中VEGF呈高表達(dá)狀態(tài)，提示其與RA的進(jìn)展過程關(guān)系密切，通過與VEGF受體相結(jié)合，能夠激活下游信號(hào)通路，促使血管細(xì)胞內(nèi)皮增殖、分化和遷移，產(chǎn)生大量新生血管并提高血管通透性，加速滑膜炎性增生[7]。近來有研究證實(shí)，RA的發(fā)展是在缺氧微環(huán)境中進(jìn)行的，而HIF-1α正是缺氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中一個(gè)重要的調(diào)控因子。Hollander等[8]通過免疫組化檢測證實(shí)，HIF-1α在RA滑膜中大量表達(dá)，推測其可能與RA關(guān)節(jié)腔的缺氧和炎癥因素相關(guān)。在缺氧和炎癥等因素刺激下，滑膜組織HIF-1α的表達(dá)增加，可啟動(dòng)VEGF的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)炎性細(xì)胞的侵潤、血管增生及血管翳的形成[9]。Tang等[10]研究證實(shí)，敲除腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的HIF-1α基因后，不僅能抑制VEGF的表達(dá)和實(shí)體瘤的血管生成，同時(shí)與之相關(guān)的生長和自愈功能也都消失，提示HIF-1α-VEGF軸可調(diào)控血管形成。因此，阻斷缺氧HIF-1α-VEGF這一通路以抑制RA的發(fā)生和進(jìn)展，可能成為臨床上治療RA的新思路。

既往研究已證實(shí)，O3治療RA能夠獲得良好的療效，但目前對(duì)其作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚有限[11-12]。本研究結(jié)果顯示，RA組大鼠的膝關(guān)節(jié)腫脹率、血清及關(guān)節(jié)內(nèi)HIF-1α和VEGF表達(dá)水平明顯高于Con組，提示以上細(xì)胞因子參與了大鼠全身性和關(guān)節(jié)局部的病變進(jìn)展過程。與RA組比較，O3組大鼠血清的以上細(xì)胞因子表達(dá)水平無明顯變化，提示O3關(guān)節(jié)腔局部注射無全身性治療作用；但O3組大鼠的膝關(guān)節(jié)腫脹程度和關(guān)節(jié)內(nèi)上述細(xì)胞因子的表達(dá)水平明顯下降，表明O3可通過調(diào)控HIF-1α及VEGF的局部表達(dá)來抑制RA的進(jìn)展過程。

綜上所述，關(guān)節(jié)腔注射O3能消除RA大鼠的膝關(guān)節(jié)腫脹，通過抑制HIF-1α-VEGF信號(hào)通路有效降低關(guān)節(jié)局部相關(guān)細(xì)胞因子HIF-1α和VEGF的表達(dá)水平，從而減輕局部炎性癥狀，延緩RA進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于大鼠的關(guān)節(jié)比較細(xì)小，關(guān)節(jié)的測量及關(guān)節(jié)液的獲取較為困難；與此同時(shí)，本研究尚未確定關(guān)節(jié)腔注射O3的最佳治療濃度以及治療時(shí)間，以上不足將在進(jìn)一步的研究中加以完善。