人參皂苷Rh2對(duì)慢性不可預(yù)知應(yīng)激所致抑郁小鼠的治療作用及機(jī)制研究

方玲 楊莉莉

抑郁癥是一種常見的情感精神障礙，嚴(yán)重患者可出現(xiàn)自殺念頭。隨著生活節(jié)奏的加快，人們工作和生活壓力的增加，抑郁癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。目前關(guān)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，有研究認(rèn)為慢性應(yīng)激與抑郁癥的發(fā)生關(guān)系密切。海馬在學(xué)習(xí)記憶、情緒、行為等調(diào)節(jié)中具有重要作用，是應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)中樞；而慢性應(yīng)激易損傷海馬組織并引起海馬結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化[3]。神經(jīng)炎癥在抑郁癥的發(fā)生過程中也發(fā)揮著重要作用，抑郁癥患者神經(jīng)炎癥因子水平往往升高[4]。目前抑郁癥的治療手段主要有抗抑郁藥物治療、物理治療、心理治療、中醫(yī)治療等，其中抗抑郁藥物治療是最主要的方法，但存在藥物價(jià)格昂貴、患者易復(fù)發(fā)、不良反應(yīng)較為嚴(yán)重、靶點(diǎn)單一、依從性差等問題[5-6]。人參皂苷Rh2是從人參中分離出來的單體，其藥理作用廣泛，在治療惡性腫瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、哮喘以及改善心肌缺血、調(diào)節(jié)免疫功能、抗過敏、抗輻射、抗抑郁等方面都有一定作用[7-11]。本研究通過建立抑郁小鼠模型來觀察人參皂苷Rh2對(duì)小鼠抑郁行為、神經(jīng)元發(fā)生及神經(jīng)炎癥的影響，并探討人參皂苷Rh2治療抑郁癥的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和試劑 健康、清潔級(jí)、雄性、22~26g、10~12周齡、C57BL/6J的小鼠100只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。人參皂苷Rh2（上海順博生物工程有限公司）；PCR試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白裂解液、SP檢測(cè)試劑盒、RNA提取試劑盒等（美國(guó) Gibco公司）；NF-κB p65、TNF-α、IL-1β（上海生工生物有限公司合成）；Trizol試劑、多聚甲醛、結(jié)晶紫溶液、山羊血清、一抗、二抗等（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 動(dòng)物分組與處理 將100只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、Rh2低劑量組、Rh2中劑量組、Rh2高劑量組，每組20只。模型組、Rh2低劑量組、Rh2中劑量組、Rh2高劑量組小鼠建立慢性應(yīng)激所致抑郁模型，應(yīng)激源包括2次5min游泳、2次6h飲水剝奪、1次30min懸尾、2次徹夜光照、3次10min閃光、1次17h濕籠、1次17h空籠無墊料、1次17h合籠、2次14h食物剝奪、1次2h合籠，以不可預(yù)知方式隨機(jī)組合實(shí)施，每天實(shí)施2種應(yīng)激源，持續(xù)10周；對(duì)照組小鼠不給予應(yīng)激。從應(yīng)激處理第3周開始，Rh2低、中、高劑量組小鼠分別給予5、10、40mg/（kg·d）的人參皂苷Rh2（溶于0.2ml蒸餾水中）灌胃，1次/d；對(duì)照組、模型組小鼠每天給予等量蒸餾水灌胃。

1.3 小鼠懸尾不動(dòng)、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比測(cè)定第10周應(yīng)激處理結(jié)束后，測(cè)定小鼠懸尾不動(dòng)、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比。（1）懸尾測(cè)試實(shí)驗(yàn)：固定小鼠遠(yuǎn)端尾部1.5cm處，鼠頭向下、距離地面35cm懸掛，測(cè)定360s內(nèi)小鼠懸掛時(shí)靜止不動(dòng)的時(shí)間百分比。（2）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：在直徑25cm、高30cm透明玻璃水缸中注入15cm高的水，將小鼠放入水中，水溫21~25℃，記錄360s內(nèi)小鼠輕微肢體活動(dòng)或漂浮不動(dòng)的時(shí)間百分比。

1.4 標(biāo)本采集 懸尾測(cè)試、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取10只小鼠，用戊巴比妥鈉麻醉后打開小鼠腹腔、暴露心臟，200ml PBS灌流，多聚甲醛灌流固定；斷頭取腦、分離腦組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，取4μm冠狀腦組織切片用于免疫組化染色。每組剩余10只小鼠快速斷頭處死，冰上分離海馬組織，液氮中速凍，用于RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.5 小鼠海馬區(qū)5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）和神經(jīng)元核抗原（NeuN）表達(dá)情況檢測(cè) 采用免疫組化染色法。（1）BrdU表達(dá)檢測(cè)：小鼠腦組織切片用PBS洗滌，HCl孵育30min；硼酸緩沖液洗滌，PBS洗滌，H2O2孵育10min；PBS洗滌，山羊血清封閉45min。加入小鼠抗BrdU抗體過夜孵育；PBS洗滌，加入抗小鼠二抗孵育。陰性對(duì)照以PBS代替一抗，PBS洗滌，DAB顯色，脫水、透明、封固。采用體視學(xué)方法分析BrdU免疫組化染色結(jié)果，觀察并統(tǒng)計(jì)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。（2）NeuN表達(dá)檢測(cè)：小鼠腦組織切片用PBS洗滌，加入Tritonx-100孵育30min；PBS 洗滌，H2O2室溫孵育 10min；PBS 洗滌，山羊血清封閉45min。加入小鼠抗NeuN抗體過夜孵育；PBS洗滌，加入抗小鼠二抗。陰性對(duì)照以PBS代替一抗，PBS洗滌，DAB顯色，脫水、透明、封固。采用Carl Zeiss Axio Vision Rel.4.6圖像分析系統(tǒng)分析NeuN免疫組化染色圖像，NeuN表達(dá)量以灰度值表示，灰度值越大表示NeuN表達(dá)量越少。

1.6 小鼠海馬區(qū) NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA 表達(dá)水平測(cè)定 采用RT-PCR法。取約100mg小鼠海馬組織，加入裂解液，勻漿器勻漿后提取總RNA；取1μg RNA反轉(zhuǎn)錄獲得海馬組織cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR，以β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃30s、55℃ 30s、72℃ 30s，共 40 個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA 相對(duì)表達(dá)量以 2-ΔΔCT表示。

1.7 小鼠海馬區(qū) NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達(dá)水平測(cè)定 采用Western blot法。取小鼠海馬組織50mg，加入裂解液提取海馬組織總蛋白，BCA法測(cè)定海馬組織總蛋白濃度。制備電泳凝膠，每孔加入10μl上樣液進(jìn)行電泳分離，將得到的目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，加入 NF-κB p65 抗體（1∶1 000 稀釋）、TNF-α 抗體（1∶200稀釋）、IL-1β 抗體（1∶200稀釋）、β-actin抗體（1∶5 000稀釋）過夜孵育，加入二抗（1∶5 000稀釋）孵育2h。采用Tanon-4200凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達(dá)水平以 NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 條帶吸光度值/β-actin條帶吸光度值的比值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠懸尾不動(dòng)、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比比較5組小鼠懸尾不動(dòng)、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組小鼠懸尾不動(dòng)、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比均明顯增加（均P＜0.05）；與模型組比較，Rh2中、高劑量組小鼠懸尾不動(dòng)、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比均明顯降低（均P＜0.05），而Rh2低劑量組有所降低但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 1。

2.2 5組小鼠海馬區(qū)BrdU和NeuN表達(dá)情況比較 免疫組化染色顯示，BrdU陽性細(xì)胞散在或成簇分布在齒狀回顆粒下區(qū)，呈梭形或圓形，見圖1；NeuN陽性細(xì)胞廣泛密集分布在海馬區(qū)，見圖2。5組小鼠海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)和NeuN灰度值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），NeuN灰度值明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，Rh2中、高劑量組小鼠海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增加（均P＜0.05），NeuN灰度值均明顯降低（均P＜0.05），而Rh2低劑量組小鼠海馬區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)和NeuN灰度值變化均不明顯（均P＞0.05），見表2。

圖1 5組小鼠海馬區(qū)BrdU免疫組化染色所見（a：對(duì)照組；b：模型組；c：Rh2低劑量組；d：Rh2中劑量組；e：Rh2高劑量組；×200）

圖2 5組小鼠海馬區(qū)NeuN免疫組化染色所見（a：對(duì)照組；b：模型組；c：Rh2低劑量組；d：Rh2中劑量組；e：Rh2高劑量組；×25）

2.3 5 組小鼠海馬區(qū) NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平比較 5組小鼠海馬區(qū)NF-κB p65、TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組比較，Rh2中、高劑量組小鼠海馬區(qū)NF-κB p65、TNF-α、IL-1β mRNA 表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05），而Rh2低劑量組有所降低但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表 3 5 組小鼠海馬區(qū) N F-κB p65、T N F-α、I L-1β m R NA表達(dá)水平比較

2.4 5 組小鼠海馬區(qū) NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達(dá)水平比較 5組小鼠海馬區(qū)NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05）；與模型組比較，Rh2中、高劑量組小鼠海馬區(qū)NF-κB p65、TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05），Rh2低劑量組有所降低但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3和表4。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2可改善結(jié)腸癌模型小鼠的抑郁行為，降低抑郁相關(guān)細(xì)胞因子水平，同時(shí)認(rèn)為人參皂苷Rh2可能通過降低抑郁相關(guān)細(xì)胞因子水平來發(fā)揮抗抑郁作用[12]。本文通過慢性不可預(yù)知應(yīng)激建立抑郁小鼠模型并給予人參皂苷Rh2治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2中、高劑量均可有效改善抑郁小鼠的懸尾不動(dòng)和強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間百分比，筆者認(rèn)為人參皂苷Rh2能抑制小鼠的抑郁行為，且可能呈劑量依賴性。

圖 3 5組小鼠海馬區(qū)N F-κB p65、T N F-α、I L-1β蛋白表達(dá)的電泳圖（a：對(duì)照組；b：模型組；c：R h2 低劑量組；d：R h2 中劑量組；e：R h2高劑量組）

表 4 5 組小鼠海馬區(qū) N F-κB p65、T N F-α、I L-1β蛋白表達(dá)水平比較

成年動(dòng)物的海馬組織每天會(huì)生成大量新神經(jīng)元，而海馬齒狀回終生具有生成新神經(jīng)元的能力。齒狀回是海馬組織的重要信息傳入通路，齒狀回新生的神經(jīng)元對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能具有重要作用。成年動(dòng)物的海馬神經(jīng)干細(xì)胞分布在海馬齒狀回顆粒細(xì)胞及亞顆粒區(qū)的最內(nèi)層，海馬神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生的新生細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元。近年來研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)發(fā)生障礙與抑郁癥的發(fā)病關(guān)系密切，是抑郁癥的發(fā)病基礎(chǔ)之一，抗抑郁藥可通過增加海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生來發(fā)揮抗抑郁的作用[13]。NeuN在成熟神經(jīng)元中特異表達(dá)，而BrdU在細(xì)胞中永久存在，可用于標(biāo)記處于DNA合成器的齒狀回先祖細(xì)胞，NeuN和BrdU標(biāo)記的陽性神經(jīng)元變化可反映神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化情況[14-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑郁模型小鼠海馬區(qū)NeuN表達(dá)下降（NeuN灰度值升高）、BrdU陽性細(xì)胞數(shù)減少，表明抑郁可引起小鼠海馬神經(jīng)元損傷及神經(jīng)發(fā)生減少；而人參皂苷Rh2中、高劑量治療可增加抑郁小鼠海馬區(qū)NeuN表達(dá)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。分析原因，筆者認(rèn)為人參皂苷Rh2可能通過促進(jìn)抑郁癥小鼠海馬神經(jīng)元成熟和神經(jīng)發(fā)生、恢復(fù)海馬組織的結(jié)構(gòu)和功能來發(fā)揮抗抑郁作用。

細(xì)胞因子對(duì)應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等具有調(diào)節(jié)作用，抑郁癥患者的生理和心理應(yīng)答與細(xì)胞因子的中樞效應(yīng)關(guān)系密切，多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子等活性分子水平的改變與抑郁癥的發(fā)生有關(guān)。在抑郁癥的發(fā)生過程中，抑郁、焦慮等負(fù)面情緒可引起下丘腦、垂體、腎上腺軸負(fù)反饋失調(diào)，引起機(jī)體免疫功能異常[16]。NF-κB蛋白家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，NF-κB為早期轉(zhuǎn)錄因子，參與包括TNF-α、IL-1β等多種炎癥因子的生成。腦內(nèi)TNF-α、IL-1β等一系列炎癥細(xì)胞因子水平增加，可引起神經(jīng)細(xì)胞損傷[17-19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑郁模型小鼠海馬組織 NF-κB p65、TNF-α、IL-1β 水平升高。慢性應(yīng)激能激活海馬組織NF-κB，增加NF-κB表達(dá)水平，而NF-κB水平升高又進(jìn)一步上調(diào)TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子水平，從而引起海馬神經(jīng)元損傷；而人參皂苷 Rh2治療可降低海馬組織 NF-κB、TNF-α、IL-1β水平。故筆者認(rèn)為，人參皂苷Rh2對(duì)抑郁癥的治療作用可能與人參皂苷Rh2抑制NF-κB信號(hào)通路，降低海馬組織TNF-α、IL-1β水平有關(guān)。

綜上所述，人參皂苷Rh2對(duì)抑郁癥小鼠具有治療作用，其作用機(jī)制可能是人參皂苷Rh2可促進(jìn)海馬神經(jīng)元成熟和神經(jīng)發(fā)生，并通過抑制NF-κB信號(hào)通路降低海馬組織炎性反應(yīng)來發(fā)揮抗抑郁作用。