復方仙草顆粒的質(zhì)量標準研究

黃國東，顧敬文，莫宇鳳，吳雨蓉，陳 夏

（1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

復方仙草顆粒處方來源于臨床經(jīng)驗方，主要由八仙草、三七、薏苡仁等廣西特色中草藥組成，具有健脾益腎、清熱活血、利濕解毒的功效。臨床研究表明，復方仙草顆粒對治療慢性原發(fā)性腎小球疾病及慢性腎功能衰竭和早期的糖尿病腎病有較好的療效［1-5］，其可能通過降低Smads2 蛋白、上調(diào)Smad7 蛋白的表達，調(diào)整免疫、抗炎、抗凝及脂代謝紊亂，激活PI3K∕Akt∕mTOR信號通路等機制，而發(fā)揮抑制炎癥、保護腎足細胞、減少蛋白尿、抗腎纖維化、延緩腎小球硬化持續(xù)進展的作用［6-15］。經(jīng)臨床觀察，該方毒副作用小，治療費用經(jīng)濟，適用于患者長期服用，本課題組擬將其開發(fā)為顆粒劑?；诖?，本研究采用顯微鑒別法和薄層色譜法（TLC）對該制劑中三七、大黃進行定性鑒別，并采用高效液相色譜法（HPLC）對該制劑中人參皂苷Rb1進行含量測定，以期全面、綜合的評價該制劑質(zhì)量，為臨床用藥提供保障。

1 實驗材料

1.1 儀器 Ni-U 尼康高級生物顯微鏡；視頻成像裝置拍攝成像儀；Agilent1260 高效液相色譜儀；高壓四元梯度泵（G-1311C）；標準自動進樣器（G-1329B）；柱溫箱（AT-950）；檢測器（G-1314-60101）；XS205DU十萬分之一天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-300DB超聲機（昆山市超聲儀器有限公司）；Hitech超純水器（和泰公司）。

1.2 試劑與試藥 復方仙草顆粒（自制3 批，批號：20180201、20180202、20180203）；硅膠G 薄層預制板（青島海洋化工分廠，批號：20180108）；人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-201625）、人參皂苷Rg1 對照品（批號：110703-201530）、大黃對照藥材（批號：120984-201202）、大黃酸對照品（批號：0757-9804）、大黃素對照品（批號：110756-200110）均購自中國食品藥品檢定研究院；流動相所用甲醇和乙腈均為色譜純（美國默克有限公司）；正丁醇、甲醇、95%乙醇、無水乙醇、乙酸乙酯、硫酸、乙醚、氨水、二氯甲烷、氯仿，均為市售分析純試劑；超純水（自制）。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 制劑中的三七藥材是以原藥材粉末存在的，故對三七粉末進行顯微鑒別。試驗中取3 個批號制劑樣品，分別裝片，置生物顯微鏡下觀察，顯微特征如下：導管主要是梯紋和網(wǎng)紋導管，螺紋較少或不明顯，直徑15～55 μm；可見樹脂道碎片，內(nèi)含棕黃色分泌物；未見淀粉粒及草酸鈣簇晶。結果見圖1-4。上述結果基本符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的三七顯微特征，其中未見淀粉粒是因為三七粉末經(jīng)過高溫加熱后，淀粉粒已糊化，故未能觀察到淀粉粒。

圖1 梯紋導管

圖2 網(wǎng)紋導管

圖3 螺紋導管

圖4 樹脂道

2.2 薄層鑒別

2.2.1 三七的薄層鑒別 取本品粉末2.5 g，加水2 ml，攪勻，再加以水飽和的正丁醇20 ml，超聲10 min，放置2 h，離心，取上清液，加3 倍量以正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層（必要時離心），取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。陰性溶液制備：取除三七外其余藥材，按處方量的1∕10 制備得陰性樣品，取2.5 g按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取人參皂苷Rb1對照品和人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成每1 ml 各含0.5 mg 的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2015 年版通則0502）［16］試驗，吸取供試品溶液和陰性供試品溶液各2 μl、對照品溶液4 μl 分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）在10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸溶液（1→10），在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果3 批樣品供試液色譜中，在與對照品混合溶液對應的位置上，顯相同的紅紫色斑點，且薄層色譜分離效果好，陰性溶液在與對照品混合溶液相應的位置上無斑點。說明本法重現(xiàn)性好、無陰性干擾，專屬性強。見圖5。

圖5 復方仙草顆粒中三七藥材TLC色譜圖

2.2.2 大黃的薄層鑒別 取本品5 g，研細，加甲醇20 ml，浸泡1 h，濾過，取濾液5 ml，蒸干，殘渣加水10 ml使溶解，再加鹽酸1 ml，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液。陰性溶液制備：按處方量的1∕10 稱取缺大黃的其他藥味，按供試品制備方法制成卻大黃的陰性制劑。取5 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取大黃對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。取大黃酸對照品適量，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為大黃酸對照品溶液。再取大黃素對照品適量，加三氯甲烷制成每1 ml 含0.3 mg 的溶液，作為大黃素對照品溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2015 年版通則0502）［16］試驗，吸取上述供試品溶液3 μl、對照藥材溶液2 μl、大黃酸對照品溶液3 μl、大黃素對照品溶液1 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。結果：置紫外光燈（365 nm）下檢視，3批供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光主斑點；在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點；置氨蒸氣中熏后，斑點變?yōu)榧t色。且陰性溶液在對照藥材溶液和對照品溶液相應的位置上無斑點。表明本法重現(xiàn)性好、無陰性干擾，專屬性強。見圖6。

圖6 復方仙草顆粒中大黃藥材TLC色譜圖

2.3 人參皂苷Rb1的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫Eclipse XDB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：乙腈-水（27∶72）；檢測波長：203 nm；流速：1.0 ml∕min；進樣量：10 μl。

2.3.2 供試品溶液的制備 提取條件的優(yōu)化：采用正交試驗方法，選擇提取回流時間（A）、甲醇濃度（B）、樣品稱取量（C）作為考察因素，每因素設3 水平（表1），按L9（34）正交表安排的9 種工藝，以人參皂苷Rb1 含量（%）作為考察指標，優(yōu)化供試液制備的條件。結果見表2、表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗與結果

（續(xù)表2）

表3 方差分析結果

根據(jù)表2、表3 結果，從極差R 分析，B＞C＞A；其中甲醇溶劑濃度的變化對人參皂苷Rb1 含量具有顯著影響，回流時間和樣品稱取量的變化則無顯著影響。再結合A2＞A1＞A3、B3＞B2＞B1、C1＞C3＞C2，最終確定供試品溶液的制備工藝為：A2B3C1，即取本品粉末3 g，精密稱定，精密加入60%甲醇50 ml，稱定重量，放置過夜，置80 ℃水浴上微沸2 h，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性溶液的制備 按處方量的1∕10 稱取除三七外的其余藥材，制備缺三七的陰性制劑，再按2.3.2供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3.4 對照品溶液的制備 取人參皂苷Rb1 對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成1 ml 含人參皂苷Rb1 0.4 mg的溶液，即得。

2.3.5 系統(tǒng)適應性試驗 取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖7）。結果理論板數(shù)按人參皂苷Rb1 峰計算應不低于3 000；基線分離良好，分離度均大于1.5。

圖7 復方仙草顆粒中人參皂苷Rb1含量測定HPLC圖

2.3.6 線性性考察及線性范圍 人參皂苷Rb1 對照品溶液的制備：取人參皂苷Rb1 對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成人參皂苷Rb1 甲醇溶液（濃度為1.045 mg∕ml），備用。分別精密吸取上述人參皂苷Rb1對照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml，各置5 ml量瓶中，加60%甲醇至刻度，搖勻，作為不同濃度的系列對照品溶液。精密吸取上述不同濃度的系列對照品溶液各10 μl，進樣，測定，以對照品的進樣量（μg）為橫坐標，峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=243.96X-27.9（r=0.9999）。結果顯示，人參皂苷Rb1 對照品進樣量在1.045～10.45 μg 范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.7 重復性試驗 取同一供試品溶液（批號：20180201），連續(xù)進樣測定6 次。結果：6 次測定的人參皂苷Rb1 峰面積分別為925.2、914.3、935.8、920.3、929.3、919.9，平均峰面積值為924.1，RSD=0.82%（n=6）。表明本法的重復性良好。

2.3.8 重現(xiàn)性試驗 取同一批樣品（批號20180201）約3 g，共6份，各精密稱定，按2.3.2項的方法平行制備6 份供試品溶液，分別進樣測定。結果：6 份樣品測得人參皂苷Rb1 含量分別為5.962 mg∕g、6.011 mg∕g、6.041 mg∕g、5.995 mg∕g、5.986 mg∕g、6.015 mg∕g，人參皂苷Rb1 的平均含量為6.002 mg∕g，RSD= 0.45%（n=6）。表明本法的重現(xiàn)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號20180201），照2.3.1 項測定條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 進樣測定。結果：6 個不同時間測定的人參皂苷Rb1 含量分別為5.973 mg∕g、5.980 mg∕g、6.062 mg∕g、6.048 mg∕g、6.072 mg∕g、5.920 mg∕g，人參皂苷Rb1 的平均含量為6.009 mg∕g ，RSD=1.00%（n=6）；表明供試品溶液中所含人參皂苷Rb1 在24 h 內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3.10 加樣回收率試驗 精密稱取人參皂苷Rb1 對照品適量，置于500 ml容量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，搖勻，得人參皂苷Rb1對照品溶液（0.2168 mg∕ml），備用。取已知人參皂苷Rb1含量的同一批樣品（20180201）約1.75 g 共6 份，置50 ml 量瓶中，精密稱定，分別加入上述人參皂苷Rb1 對照品溶液至刻度，搖勻。照2.3.1項擬定的條件測定，計算加樣回收率。結果：人參皂苷Rb1平均回收率為100.02%，RSD=1.45%（n=6）。見表4。

2.3.11 樣品測定 取3 批樣品各適量，分別按2.3.2項下方法制備供試品溶液，再按2.3.1項下色譜條件進樣平行測定2 次，記錄峰面積并計算樣品中人參皂苷Rb1含量，結果見表5。

表4 加樣回收率試驗結果 （n=6）

表5 3批復方仙草顆粒含量測定結果（n=2）

3 討 論

試驗中曾對制劑中豬殃殃、黃芪、甘草等進行薄層鑒別，由于分離度達不到要求，或存在陰性干擾，故不作為該顆粒劑質(zhì)量標準的指標。因此本試驗對復方仙草顆粒中三七的顯微特征和三七、大黃2 種藥材的薄層色譜進行研究。結果顯示，三七的顯微特征明顯。薄層色譜中樣品供試液在與對照品溶液（對照藥材溶液）相對應的位置顯相同的顏色和斑點，陰性無干擾，重現(xiàn)性好。

三七在處方中為臣藥。據(jù)文獻報道，三七含有皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類、氨基酸類、多糖類等化學成分以及各種微量元素，其中人參皂苷Rg1、Rb1、R1 為三七主要有效成分［17-18］，為提高本品質(zhì)量控制水平，應對這些成分進行含量測定。試驗中，我們曾摸索Rg1、Rb1、R1 成分的含量測定方法，結果：Rg1、R1 存在陰性干擾，故考慮本品只對其中的人參皂苷Rb1 含量進行質(zhì)量控制。經(jīng)全波長掃描結果顯示，人參皂苷Rb1 在203 nm 波長處有最大吸收，因此選擇203 nm作為檢測波長。

本文采用HPLC 法測定人參皂苷Rb1 含量，經(jīng)方法學考察，本方法專屬性強，無陰性干擾，精密度和準確度均較高，具有良好的重復性和重現(xiàn)性，平均回收率達到100.02%，說明本文建立的含量測定方法可行，可用于復方仙草顆粒的質(zhì)量控制。