復(fù)方仙草顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

黃國(guó)東，顧敬文，莫宇鳳，吳雨蓉，陳 夏

（1.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

復(fù)方仙草顆粒處方來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要由八仙草、三七、薏苡仁等廣西特色中草藥組成，具有健脾益腎、清熱活血、利濕解毒的功效。臨床研究表明，復(fù)方仙草顆粒對(duì)治療慢性原發(fā)性腎小球疾病及慢性腎功能衰竭和早期的糖尿病腎病有較好的療效［1-5］，其可能通過(guò)降低Smads2 蛋白、上調(diào)Smad7 蛋白的表達(dá)，調(diào)整免疫、抗炎、抗凝及脂代謝紊亂，激活PI3K∕Akt∕mTOR信號(hào)通路等機(jī)制，而發(fā)揮抑制炎癥、保護(hù)腎足細(xì)胞、減少蛋白尿、抗腎纖維化、延緩腎小球硬化持續(xù)進(jìn)展的作用［6-15］。經(jīng)臨床觀察，該方毒副作用小，治療費(fèi)用經(jīng)濟(jì)，適用于患者長(zhǎng)期服用，本課題組擬將其開(kāi)發(fā)為顆粒劑。基于此，本研究采用顯微鑒別法和薄層色譜法（TLC）對(duì)該制劑中三七、大黃進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)該制劑中人參皂苷Rb1進(jìn)行含量測(cè)定，以期全面、綜合的評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量，為臨床用藥提供保障。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Ni-U 尼康高級(jí)生物顯微鏡；視頻成像裝置拍攝成像儀；Agilent1260 高效液相色譜儀；高壓四元梯度泵（G-1311C）；標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器（G-1329B）；柱溫箱（AT-950）；檢測(cè)器（G-1314-60101）；XS205DU十萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-300DB超聲機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；Hitech超純水器（和泰公司）。

1.2 試劑與試藥 復(fù)方仙草顆粒（自制3 批，批號(hào)：20180201、20180202、20180203）；硅膠G 薄層預(yù)制板（青島海洋化工分廠，批號(hào)：20180108）；人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-201625）、人參皂苷Rg1 對(duì)照品（批號(hào)：110703-201530）、大黃對(duì)照藥材（批號(hào)：120984-201202）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：0757-9804）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；流動(dòng)相所用甲醇和乙腈均為色譜純（美國(guó)默克有限公司）；正丁醇、甲醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、硫酸、乙醚、氨水、二氯甲烷、氯仿，均為市售分析純?cè)噭?；超純水（自制）?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 制劑中的三七藥材是以原藥材粉末存在的，故對(duì)三七粉末進(jìn)行顯微鑒別。試驗(yàn)中取3 個(gè)批號(hào)制劑樣品，分別裝片，置生物顯微鏡下觀察，顯微特征如下：導(dǎo)管主要是梯紋和網(wǎng)紋導(dǎo)管，螺紋較少或不明顯，直徑15～55 μm；可見(jiàn)樹(shù)脂道碎片，內(nèi)含棕黃色分泌物；未見(jiàn)淀粉粒及草酸鈣簇晶。結(jié)果見(jiàn)圖1-4。上述結(jié)果基本符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的三七顯微特征，其中未見(jiàn)淀粉粒是因?yàn)槿叻勰┙?jīng)過(guò)高溫加熱后，淀粉粒已糊化，故未能觀察到淀粉粒。

圖1 梯紋導(dǎo)管

圖2 網(wǎng)紋導(dǎo)管

圖3 螺紋導(dǎo)管

圖4 樹(shù)脂道

2.2 薄層鑒別

2.2.1 三七的薄層鑒別 取本品粉末2.5 g，加水2 ml，攪勻，再加以水飽和的正丁醇20 ml，超聲10 min，放置2 h，離心，取上清液，加3 倍量以正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層（必要時(shí)離心），取正丁醇層，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。陰性溶液制備：取除三七外其余藥材，按處方量的1∕10 制備得陰性樣品，取2.5 g按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。另取人參皂苷Rb1對(duì)照品和人參皂苷Rg1對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml 各含0.5 mg 的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版通則0502）［16］試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性供試品溶液各2 μl、對(duì)照品溶液4 μl 分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）在10 ℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以硫酸溶液（1→10），在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果3 批樣品供試液色譜中，在與對(duì)照品混合溶液對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同的紅紫色斑點(diǎn)，且薄層色譜分離效果好，陰性溶液在與對(duì)照品混合溶液相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)。說(shuō)明本法重現(xiàn)性好、無(wú)陰性干擾，專屬性強(qiáng)。見(jiàn)圖5。

圖5 復(fù)方仙草顆粒中三七藥材TLC色譜圖

2.2.2 大黃的薄層鑒別 取本品5 g，研細(xì)，加甲醇20 ml，浸泡1 h，濾過(guò)，取濾液5 ml，蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，再加鹽酸1 ml，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? ml使溶解，作為供試品溶液。陰性溶液制備：按處方量的1∕10 稱取缺大黃的其他藥味，按供試品制備方法制成卻大黃的陰性制劑。取5 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取大黃酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為大黃酸對(duì)照品溶液。再取大黃素對(duì)照品適量，加三氯甲烷制成每1 ml 含0.3 mg 的溶液，作為大黃素對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版通則0502）［16］試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液3 μl、對(duì)照藥材溶液2 μl、大黃酸對(duì)照品溶液3 μl、大黃素對(duì)照品溶液1 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。結(jié)果：置紫外光燈（365 nm）下檢視，3批供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光主斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。且陰性溶液在對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)。表明本法重現(xiàn)性好、無(wú)陰性干擾，專屬性強(qiáng)。見(jiàn)圖6。

圖6 復(fù)方仙草顆粒中大黃藥材TLC色譜圖

2.3 人參皂苷Rb1的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫Eclipse XDB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈-水（27∶72）；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速：1.0 ml∕min；進(jìn)樣量：10 μl。

2.3.2 供試品溶液的制備 提取條件的優(yōu)化：采用正交試驗(yàn)方法，選擇提取回流時(shí)間（A）、甲醇濃度（B）、樣品稱取量（C）作為考察因素，每因素設(shè)3 水平（表1），按L9（34）正交表安排的9 種工藝，以人參皂苷Rb1 含量（%）作為考察指標(biāo)，優(yōu)化供試液制備的條件。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)與結(jié)果

（續(xù)表2）

表3 方差分析結(jié)果

根據(jù)表2、表3 結(jié)果，從極差R 分析，B＞C＞A；其中甲醇溶劑濃度的變化對(duì)人參皂苷Rb1 含量具有顯著影響，回流時(shí)間和樣品稱取量的變化則無(wú)顯著影響。再結(jié)合A2＞A1＞A3、B3＞B2＞B1、C1＞C3＞C2，最終確定供試品溶液的制備工藝為：A2B3C1，即取本品粉末3 g，精密稱定，精密加入60%甲醇50 ml，稱定重量，放置過(guò)夜，置80 ℃水浴上微沸2 h，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性溶液的制備 按處方量的1∕10 稱取除三七外的其余藥材，制備缺三七的陰性制劑，再按2.3.2供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3.4 對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Rb1 對(duì)照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成1 ml 含人參皂苷Rb1 0.4 mg的溶液，即得。

2.3.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖7）。結(jié)果理論板數(shù)按人參皂苷Rb1 峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000；基線分離良好，分離度均大于1.5。

圖7 復(fù)方仙草顆粒中人參皂苷Rb1含量測(cè)定HPLC圖

2.3.6 線性性考察及線性范圍 人參皂苷Rb1 對(duì)照品溶液的制備：取人參皂苷Rb1 對(duì)照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成人參皂苷Rb1 甲醇溶液（濃度為1.045 mg∕ml），備用。分別精密吸取上述人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml，各置5 ml量瓶中，加60%甲醇至刻度，搖勻，作為不同濃度的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述不同濃度的系列對(duì)照品溶液各10 μl，進(jìn)樣，測(cè)定，以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=243.96X-27.9（r=0.9999）。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1 對(duì)照品進(jìn)樣量在1.045～10.45 μg 范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)：20180201），連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。結(jié)果：6 次測(cè)定的人參皂苷Rb1 峰面積分別為925.2、914.3、935.8、920.3、929.3、919.9，平均峰面積值為924.1，RSD=0.82%（n=6）。表明本法的重復(fù)性良好。

2.3.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)20180201）約3 g，共6份，各精密稱定，按2.3.2項(xiàng)的方法平行制備6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果：6 份樣品測(cè)得人參皂苷Rb1 含量分別為5.962 mg∕g、6.011 mg∕g、6.041 mg∕g、5.995 mg∕g、5.986 mg∕g、6.015 mg∕g，人參皂苷Rb1 的平均含量為6.002 mg∕g，RSD= 0.45%（n=6）。表明本法的重現(xiàn)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)20180201），照2.3.1 項(xiàng)測(cè)定條件，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果：6 個(gè)不同時(shí)間測(cè)定的人參皂苷Rb1 含量分別為5.973 mg∕g、5.980 mg∕g、6.062 mg∕g、6.048 mg∕g、6.072 mg∕g、5.920 mg∕g，人參皂苷Rb1 的平均含量為6.009 mg∕g ，RSD=1.00%（n=6）；表明供試品溶液中所含人參皂苷Rb1 在24 h 內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取人參皂苷Rb1 對(duì)照品適量，置于500 ml容量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，搖勻，得人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液（0.2168 mg∕ml），備用。取已知人參皂苷Rb1含量的同一批樣品（20180201）約1.75 g 共6 份，置50 ml 量瓶中，精密稱定，分別加入上述人參皂苷Rb1 對(duì)照品溶液至刻度，搖勻。照2.3.1項(xiàng)擬定的條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果：人參皂苷Rb1平均回收率為100.02%，RSD=1.45%（n=6）。見(jiàn)表4。

2.3.11 樣品測(cè)定 取3 批樣品各適量，分別按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣平行測(cè)定2 次，記錄峰面積并計(jì)算樣品中人參皂苷Rb1含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

表5 3批復(fù)方仙草顆粒含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討 論

試驗(yàn)中曾對(duì)制劑中豬殃殃、黃芪、甘草等進(jìn)行薄層鑒別，由于分離度達(dá)不到要求，或存在陰性干擾，故不作為該顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)。因此本試驗(yàn)對(duì)復(fù)方仙草顆粒中三七的顯微特征和三七、大黃2 種藥材的薄層色譜進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，三七的顯微特征明顯。薄層色譜中樣品供試液在與對(duì)照品溶液（對(duì)照藥材溶液）相對(duì)應(yīng)的位置顯相同的顏色和斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾，重現(xiàn)性好。

三七在處方中為臣藥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，三七含有皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類、氨基酸類、多糖類等化學(xué)成分以及各種微量元素，其中人參皂苷Rg1、Rb1、R1 為三七主要有效成分［17-18］，為提高本品質(zhì)量控制水平，應(yīng)對(duì)這些成分進(jìn)行含量測(cè)定。試驗(yàn)中，我們?cè)鱎g1、Rb1、R1 成分的含量測(cè)定方法，結(jié)果：Rg1、R1 存在陰性干擾，故考慮本品只對(duì)其中的人參皂苷Rb1 含量進(jìn)行質(zhì)量控制。經(jīng)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1 在203 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇203 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本文采用HPLC 法測(cè)定人參皂苷Rb1 含量，經(jīng)方法學(xué)考察，本方法專屬性強(qiáng)，無(wú)陰性干擾，精密度和準(zhǔn)確度均較高，具有良好的重復(fù)性和重現(xiàn)性，平均回收率達(dá)到100.02%，說(shuō)明本文建立的含量測(cè)定方法可行，可用于復(fù)方仙草顆粒的質(zhì)量控制。