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    復(fù)方仙草顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

    2019-11-22 02:09:50黃國(guó)東顧敬文莫宇鳳吳雨蓉
    廣西中醫(yī)藥 2019年5期

    黃國(guó)東,顧敬文,莫宇鳳,吳雨蓉,陳 夏

    (1.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 南寧 530201;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,廣西 南寧 530011)

    復(fù)方仙草顆粒處方來(lái)源于臨床經(jīng)驗(yàn)方,主要由八仙草、三七、薏苡仁等廣西特色中草藥組成,具有健脾益腎、清熱活血、利濕解毒的功效。臨床研究表明,復(fù)方仙草顆粒對(duì)治療慢性原發(fā)性腎小球疾病及慢性腎功能衰竭和早期的糖尿病腎病有較好的療效[1-5],其可能通過(guò)降低Smads2 蛋白、上調(diào)Smad7 蛋白的表達(dá),調(diào)整免疫、抗炎、抗凝及脂代謝紊亂,激活PI3K∕Akt∕mTOR信號(hào)通路等機(jī)制,而發(fā)揮抑制炎癥、保護(hù)腎足細(xì)胞、減少蛋白尿、抗腎纖維化、延緩腎小球硬化持續(xù)進(jìn)展的作用[6-15]。經(jīng)臨床觀察,該方毒副作用小,治療費(fèi)用經(jīng)濟(jì),適用于患者長(zhǎng)期服用,本課題組擬將其開(kāi)發(fā)為顆粒劑?;诖?,本研究采用顯微鑒別法和薄層色譜法(TLC)對(duì)該制劑中三七、大黃進(jìn)行定性鑒別,并采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)該制劑中人參皂苷Rb1進(jìn)行含量測(cè)定,以期全面、綜合的評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量,為臨床用藥提供保障。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 儀器 Ni-U 尼康高級(jí)生物顯微鏡;視頻成像裝置拍攝成像儀;Agilent1260 高效液相色譜儀;高壓四元梯度泵(G-1311C);標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器(G-1329B);柱溫箱(AT-950);檢測(cè)器(G-1314-60101);XS205DU十萬(wàn)分之一天平(瑞士梅特勒公司);KQ-300DB超聲機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);Hitech超純水器(和泰公司)。

    1.2 試劑與試藥 復(fù)方仙草顆粒(自制3 批,批號(hào):20180201、20180202、20180203);硅膠G 薄層預(yù)制板(青島海洋化工分廠,批號(hào):20180108);人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào):110704-201625)、人參皂苷Rg1 對(duì)照品(批號(hào):110703-201530)、大黃對(duì)照藥材(批號(hào):120984-201202)、大黃酸對(duì)照品(批號(hào):0757-9804)、大黃素對(duì)照品(批號(hào):110756-200110)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;流動(dòng)相所用甲醇和乙腈均為色譜純(美國(guó)默克有限公司);正丁醇、甲醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、硫酸、乙醚、氨水、二氯甲烷、氯仿,均為市售分析純?cè)噭?;超純水(自制)?/p>

    2 方法與結(jié)果

    2.1 顯微鑒別 制劑中的三七藥材是以原藥材粉末存在的,故對(duì)三七粉末進(jìn)行顯微鑒別。試驗(yàn)中取3 個(gè)批號(hào)制劑樣品,分別裝片,置生物顯微鏡下觀察,顯微特征如下:導(dǎo)管主要是梯紋和網(wǎng)紋導(dǎo)管,螺紋較少或不明顯,直徑15~55 μm;可見(jiàn)樹脂道碎片,內(nèi)含棕黃色分泌物;未見(jiàn)淀粉粒及草酸鈣簇晶。結(jié)果見(jiàn)圖1-4。上述結(jié)果基本符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的三七顯微特征,其中未見(jiàn)淀粉粒是因?yàn)槿叻勰┙?jīng)過(guò)高溫加熱后,淀粉粒已糊化,故未能觀察到淀粉粒。

    圖1 梯紋導(dǎo)管

    圖2 網(wǎng)紋導(dǎo)管

    圖3 螺紋導(dǎo)管

    圖4 樹脂道

    2.2 薄層鑒別

    2.2.1 三七的薄層鑒別 取本品粉末2.5 g,加水2 ml,攪勻,再加以水飽和的正丁醇20 ml,超聲10 min,放置2 h,離心,取上清液,加3 倍量以正丁醇飽和的水,搖勻,放置使分層(必要時(shí)離心),取正丁醇層,蒸干,殘?jiān)蛹状? ml使溶解,作為供試品溶液。陰性溶液制備:取除三七外其余藥材,按處方量的1∕10 制備得陰性樣品,取2.5 g按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。另取人參皂苷Rb1對(duì)照品和人參皂苷Rg1對(duì)照品,加甲醇制成每1 ml 各含0.5 mg 的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版通則0502)[16]試驗(yàn),吸取供試品溶液和陰性供試品溶液各2 μl、對(duì)照品溶液4 μl 分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)在10 ℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以硫酸溶液(1→10),在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果3 批樣品供試液色譜中,在與對(duì)照品混合溶液對(duì)應(yīng)的位置上,顯相同的紅紫色斑點(diǎn),且薄層色譜分離效果好,陰性溶液在與對(duì)照品混合溶液相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)。說(shuō)明本法重現(xiàn)性好、無(wú)陰性干擾,專屬性強(qiáng)。見(jiàn)圖5。

    圖5 復(fù)方仙草顆粒中三七藥材TLC色譜圖

    2.2.2 大黃的薄層鑒別 取本品5 g,研細(xì),加甲醇20 ml,浸泡1 h,濾過(guò),取濾液5 ml,蒸干,殘?jiān)铀?0 ml使溶解,再加鹽酸1 ml,加熱回流30 min,立即冷卻,用乙酸乙酯振搖提取2次,每次20 ml,合并乙酸乙酯液,蒸干,殘?jiān)尤燃淄? ml使溶解,作為供試品溶液。陰性溶液制備:按處方量的1∕10 稱取缺大黃的其他藥味,按供試品制備方法制成卻大黃的陰性制劑。取5 g,按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.1 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。取大黃酸對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作為大黃酸對(duì)照品溶液。再取大黃素對(duì)照品適量,加三氯甲烷制成每1 ml 含0.3 mg 的溶液,作為大黃素對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2015 年版通則0502)[16]試驗(yàn),吸取上述供試品溶液3 μl、對(duì)照藥材溶液2 μl、大黃酸對(duì)照品溶液3 μl、大黃素對(duì)照品溶液1 μl,分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上,以石油醚(30~60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干。結(jié)果:置紫外光燈(365 nm)下檢視,3批供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的橙黃色熒光主斑點(diǎn);在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn);置氨蒸氣中熏后,斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。且陰性溶液在對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)。表明本法重現(xiàn)性好、無(wú)陰性干擾,專屬性強(qiáng)。見(jiàn)圖6。

    圖6 復(fù)方仙草顆粒中大黃藥材TLC色譜圖

    2.3 人參皂苷Rb1的含量測(cè)定

    2.3.1 色譜條件 色譜柱:安捷倫Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相:乙腈-水(27∶72);檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;流速:1.0 ml∕min;進(jìn)樣量:10 μl。

    2.3.2 供試品溶液的制備 提取條件的優(yōu)化:采用正交試驗(yàn)方法,選擇提取回流時(shí)間(A)、甲醇濃度(B)、樣品稱取量(C)作為考察因素,每因素設(shè)3 水平(表1),按L9(34)正交表安排的9 種工藝,以人參皂苷Rb1 含量(%)作為考察指標(biāo),優(yōu)化供試液制備的條件。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

    表1 因素水平表

    表2 正交試驗(yàn)與結(jié)果

    (續(xù)表2)

    表3 方差分析結(jié)果

    根據(jù)表2、表3 結(jié)果,從極差R 分析,B>C>A;其中甲醇溶劑濃度的變化對(duì)人參皂苷Rb1 含量具有顯著影響,回流時(shí)間和樣品稱取量的變化則無(wú)顯著影響。再結(jié)合A2>A1>A3、B3>B2>B1、C1>C3>C2,最終確定供試品溶液的制備工藝為:A2B3C1,即取本品粉末3 g,精密稱定,精密加入60%甲醇50 ml,稱定重量,放置過(guò)夜,置80 ℃水浴上微沸2 h,放冷,再稱定重量,用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò)。取續(xù)濾液,即得。

    2.3.3 陰性溶液的制備 按處方量的1∕10 稱取除三七外的其余藥材,制備缺三七的陰性制劑,再按2.3.2供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

    2.3.4 對(duì)照品溶液的制備 取人參皂苷Rb1 對(duì)照品適量,精密稱定,加60%甲醇制成1 ml 含人參皂苷Rb1 0.4 mg的溶液,即得。

    2.3.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl,按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖(圖7)。結(jié)果理論板數(shù)按人參皂苷Rb1 峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000;基線分離良好,分離度均大于1.5。

    圖7 復(fù)方仙草顆粒中人參皂苷Rb1含量測(cè)定HPLC圖

    2.3.6 線性性考察及線性范圍 人參皂苷Rb1 對(duì)照品溶液的制備:取人參皂苷Rb1 對(duì)照品適量,精密稱定,加60%甲醇制成人參皂苷Rb1 甲醇溶液(濃度為1.045 mg∕ml),備用。分別精密吸取上述人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml,各置5 ml量瓶中,加60%甲醇至刻度,搖勻,作為不同濃度的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述不同濃度的系列對(duì)照品溶液各10 μl,進(jìn)樣,測(cè)定,以對(duì)照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為:Y=243.96X-27.9(r=0.9999)。結(jié)果顯示,人參皂苷Rb1 對(duì)照品進(jìn)樣量在1.045~10.45 μg 范圍內(nèi),進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

    2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào):20180201),連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。結(jié)果:6 次測(cè)定的人參皂苷Rb1 峰面積分別為925.2、914.3、935.8、920.3、929.3、919.9,平均峰面積值為924.1,RSD=0.82%(n=6)。表明本法的重復(fù)性良好。

    2.3.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)20180201)約3 g,共6份,各精密稱定,按2.3.2項(xiàng)的方法平行制備6 份供試品溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果:6 份樣品測(cè)得人參皂苷Rb1 含量分別為5.962 mg∕g、6.011 mg∕g、6.041 mg∕g、5.995 mg∕g、5.986 mg∕g、6.015 mg∕g,人參皂苷Rb1 的平均含量為6.002 mg∕g,RSD= 0.45%(n=6)。表明本法的重現(xiàn)性良好。

    2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號(hào)20180201),照2.3.1 項(xiàng)測(cè)定條件,分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果:6 個(gè)不同時(shí)間測(cè)定的人參皂苷Rb1 含量分別為5.973 mg∕g、5.980 mg∕g、6.062 mg∕g、6.048 mg∕g、6.072 mg∕g、5.920 mg∕g,人參皂苷Rb1 的平均含量為6.009 mg∕g ,RSD=1.00%(n=6);表明供試品溶液中所含人參皂苷Rb1 在24 h 內(nèi)是穩(wěn)定的。

    2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取人參皂苷Rb1 對(duì)照品適量,置于500 ml容量瓶中,加60%甲醇定容至刻度,搖勻,得人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液(0.2168 mg∕ml),備用。取已知人參皂苷Rb1含量的同一批樣品(20180201)約1.75 g 共6 份,置50 ml 量瓶中,精密稱定,分別加入上述人參皂苷Rb1 對(duì)照品溶液至刻度,搖勻。照2.3.1項(xiàng)擬定的條件測(cè)定,計(jì)算加樣回收率。結(jié)果:人參皂苷Rb1平均回收率為100.02%,RSD=1.45%(n=6)。見(jiàn)表4。

    2.3.11 樣品測(cè)定 取3 批樣品各適量,分別按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣平行測(cè)定2 次,記錄峰面積并計(jì)算樣品中人參皂苷Rb1含量,結(jié)果見(jiàn)表5。

    表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

    表5 3批復(fù)方仙草顆粒含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

    3 討 論

    試驗(yàn)中曾對(duì)制劑中豬殃殃、黃芪、甘草等進(jìn)行薄層鑒別,由于分離度達(dá)不到要求,或存在陰性干擾,故不作為該顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)。因此本試驗(yàn)對(duì)復(fù)方仙草顆粒中三七的顯微特征和三七、大黃2 種藥材的薄層色譜進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,三七的顯微特征明顯。薄層色譜中樣品供試液在與對(duì)照品溶液(對(duì)照藥材溶液)相對(duì)應(yīng)的位置顯相同的顏色和斑點(diǎn),陰性無(wú)干擾,重現(xiàn)性好。

    三七在處方中為臣藥。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,三七含有皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類、氨基酸類、多糖類等化學(xué)成分以及各種微量元素,其中人參皂苷Rg1、Rb1、R1 為三七主要有效成分[17-18],為提高本品質(zhì)量控制水平,應(yīng)對(duì)這些成分進(jìn)行含量測(cè)定。試驗(yàn)中,我們?cè)鱎g1、Rb1、R1 成分的含量測(cè)定方法,結(jié)果:Rg1、R1 存在陰性干擾,故考慮本品只對(duì)其中的人參皂苷Rb1 含量進(jìn)行質(zhì)量控制。經(jīng)全波長(zhǎng)掃描結(jié)果顯示,人參皂苷Rb1 在203 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收,因此選擇203 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

    本文采用HPLC 法測(cè)定人參皂苷Rb1 含量,經(jīng)方法學(xué)考察,本方法專屬性強(qiáng),無(wú)陰性干擾,精密度和準(zhǔn)確度均較高,具有良好的重復(fù)性和重現(xiàn)性,平均回收率達(dá)到100.02%,說(shuō)明本文建立的含量測(cè)定方法可行,可用于復(fù)方仙草顆粒的質(zhì)量控制。

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