不同作物秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的抑制及其生理指標(biāo)的影響

康曉宇， 韓篷慧， 張 先， 李范洙

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 吉林 133002)

生物質(zhì)熱解液(簡(jiǎn)稱熱解液)是利用快速熱解氣化技術(shù)[1]處理生物質(zhì)原料獲得的生物油精制過程中分離得到的水溶性物質(zhì)。據(jù)研究，其理化特性類似于木(竹)醋液[2]，木醋液相對(duì)于其他農(nóng)藥殘留難去除的問題，它毒性小、無殘留[3]。生物質(zhì)熱解液對(duì)植物病原菌具有良好的抑菌作用[4]以及對(duì)果實(shí)具有良好的保鮮效果[5-6]。而農(nóng)作物秸稈是綠色可再生生物質(zhì)資源，雖然秸稈可作為肥料、飼料、燃料和基料等多種利用途徑，但是因秸稈綜合利用產(chǎn)業(yè)化程度低、經(jīng)濟(jì)效益差和成本較高等原因，目前大部分秸稈仍是被直接燃燒或焚燒廢棄，造成資源浪費(fèi)，環(huán)境污染[7]。因此，為了提高秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物的利用率和利用途徑，從以作物秸稈為原料制備的生物油中分離獲得了不同作物秸稈熱解液，分析其化學(xué)組分，檢測(cè)出64種有機(jī)化合物，含有有機(jī)酸類、酮類、酚類和醇類等組分，其中，有機(jī)酸類相對(duì)含量最高，并且不同作物秸稈熱解液在化學(xué)組分及含量上有所不同[8]，這可能會(huì)導(dǎo)致其在抑菌、保鮮等功能性方面存在差異。

因此，該研究進(jìn)行了不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的抑菌試驗(yàn)，探討了不同秸稈熱解液的抑菌作用，旨在為以作物秸稈為原料的熱解液在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)及貯藏保鮮中的應(yīng)用，以及天然抑菌劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以稻草、稻殼、大豆秸稈、玉米芯和玉米秸稈為原料，粉碎過0.180 mm(80目)篩，利用LRY-15型生物質(zhì)快速熱解液化裝置，500 ℃ 進(jìn)行熱解獲得生物油。在生物油中加入等量的水，充分?jǐn)嚢瑁喑柿梁谏?，靜置1 h，取上層水相部分，即為粗熱解液[2]，進(jìn)行常壓蒸餾，收集約100 ℃時(shí)的蒸餾液，即為試驗(yàn)所用的熱解液。稻殼熱解液、稻草熱解液、大豆秸稈熱解液、玉米芯熱解液和玉米秸稈熱解液分別用RHB、RSB、SSB、CCB和CSB來標(biāo)記。

辣椒炭疽菌(Colletotrichumcapsici)由吉林省蔬菜花卉研究院提供。

1.2 主要試劑

PDA培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)、3,5-二硝基水楊酸、昆布多糖購自北京索萊寶科技有限公司；N-乙酰葡萄糖胺購自武漢荊楚陳氏醫(yī)藥化工有限公司；脫鹽蝸牛酶購自上海源葉生物科技有限公司；L-酪氨酸購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 抑菌率的測(cè)定

將辣椒炭疽菌接在含不同濃度(5.9、6.2、6.7、7.1、7.7、8.3、9.1、10.0、11.1和12.5 mL/L)熱解液的平板培養(yǎng)基中放置于28 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)照組的菌落直徑大于培養(yǎng)皿直徑2/3時(shí)，測(cè)量處理組辣椒炭疽菌的生長(zhǎng)直徑，計(jì)算得出熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的抑菌率[9]，每個(gè)濃度重復(fù)3次。

以橫坐標(biāo)為處理濃度的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為菌絲生長(zhǎng)的抑菌率幾率值，得出熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的毒力回歸方程，并求得熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的EC50值[10]。

1.3.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定

每個(gè)試管加入15 mL含不同濃度(抑菌率達(dá)到100%的幾個(gè)梯度濃度)熱解液的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，將菌餅接于試管中28 ℃培養(yǎng)，以試管內(nèi)完全無菌絲生長(zhǎng)為最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)。在MIC實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將試管中無菌絲生長(zhǎng)的菌餅取出，接種于PDA固體培養(yǎng)基中，并在28 ℃培養(yǎng)并觀察，以無菌絲生長(zhǎng)的最小濃度為最小殺菌濃度(Minimum Fugicide Concentration，MFC)[11]。抑菌率達(dá)到100%的不同秸稈熱解液有不同的濃度梯度。

1.3.3 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

取已培養(yǎng)4～5 d的辣椒炭疽菌的平板，制備菌絲塊。取2支燒杯，一個(gè)加20 mL無菌去離子水，另一個(gè)加20 mL用無菌去離子水稀釋至濃度為抑菌率達(dá)到50%(即EC50值)的熱解液溶液，每個(gè)燒杯中放入20個(gè)直徑為5 mm的菌絲塊。用電導(dǎo)儀分別測(cè)定處理后0～5 h的電導(dǎo)率，10 h后，將燒杯于沸水中加熱3～5 min致死，再次測(cè)定得到電導(dǎo)率為C′[12]，重復(fù)3次。相對(duì)電導(dǎo)率的計(jì)算公式如下式：

式中：C為各時(shí)間點(diǎn)電導(dǎo)率；C0為0 h時(shí)的電導(dǎo)率；C′為死處理的電導(dǎo)率。

1.3.4 蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)含量的測(cè)定

在試管中加入20 mL已配制好的PDA液體培養(yǎng)基和1塊菌餅，在28 ℃下靜置培養(yǎng)。3 d后加入5種不同原料的熱解液至EC50值的濃度，靜置培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)分別取1.5 mL培養(yǎng)液，放入離心管中10 000 r/min離心5 min，并測(cè)定上清液在260 nm(核酸)和280 nm(蛋白質(zhì))處的吸光值[12]。

1.3.5 菌絲總糖和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

將辣椒炭疽菌在含EC50濃度值熱解液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，挑取菌絲，過濾并洗掉培養(yǎng)基，冷凍干燥后備用。菌絲總糖含量的測(cè)定采用蒽酮試劑法，菌絲蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法[12]。

1.3.6 水解酶活性測(cè)定

按1.3.5處理的菌絲，采用DNS比色法測(cè)定β-1,3葡聚糖酶活性[13]；幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定采用DMAB比色法，蛋白酶活性采用福林試劑法測(cè)定[14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS17.0中Duncan多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的抑制作用

由表1可知，不同秸稈熱解液均對(duì)辣椒炭疽菌具有良好的抑菌作用，且隨著熱解液濃度的增加其抑菌率也提高，而不同秸稈熱解液具有不同的抑菌效果。當(dāng)SSB的濃度為7.1 mL/L、RHB和RSB的濃度為10.0 mL/L時(shí)，其抑菌率均超過50%，而CCB和CSB濃度為6.2 mL/L時(shí)，其抑菌率超過50%，濃度為10.0 mL/L時(shí)，抑菌率達(dá)到100%。

表1 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的抑菌率

注：RHB為稻殼熱解液；RSB為稻草熱解液；SSB為大豆秸稈熱解液；CCB為玉米芯兒熱解液；CSB為玉米秸稈熱解液；下同。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立的毒理方程和EC50值、EC90值及MIC值、MFC值見表2。由表可知，RSB的EC50值和EC90值分別為10.232和24.42 mL/L，遠(yuǎn)高于其它秸稈熱解液，其中，CCB的EC50值EC90值最小，分別為6.11和8.75 mL/L，其次是CSB，再次是SSB。同時(shí)，由表2的MIC和MFC測(cè)定結(jié)果可以看出，CCB的MIC和MFC值最低，分別為9.1和10.0 mL/L，其次是CSB，再次是RHB和SSB，而RSB的最高，分別為28.6和33.3 mL/L。綜上說明，不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的抑菌作用由強(qiáng)到弱的順序?yàn)镃CB>CSB>SSB>RHB>RSB。

表2 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的毒力測(cè)定結(jié)果

2.2 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌細(xì)胞膜透性的影響

2.2.1 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌液相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由圖1可知，用抑菌率為50%的5種秸稈熱解液處理辣椒炭疽菌后菌液的相對(duì)電導(dǎo)率迅速升高，之后基本趨于平緩，在整個(gè)測(cè)定時(shí)間段內(nèi)，熱解液處理組的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著高于對(duì)照組(圖1)。

由圖1可知，熱解液破壞了辣椒炭疽菌菌體的細(xì)胞膜，造成電解質(zhì)外滲，從而導(dǎo)致電導(dǎo)率升高[15]。處理1 h后，CCB處理組相對(duì)電導(dǎo)率為44.71%，為對(duì)照組的2.22倍，CSB處理組的相對(duì)電導(dǎo)率為36.36%，是對(duì)照組的1.65倍，而RSB處理組的相對(duì)電導(dǎo)率較低，是對(duì)照組的1.39倍。

圖1 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌液相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.2.2 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)外滲的影響

由表3可知，經(jīng)過熱解液處理后辣椒炭疽菌蛋白質(zhì)的釋放量均顯著高于對(duì)照組，不同秸稈熱解液中CCB處理的菌懸液中蛋白質(zhì)的含量最多，高達(dá)5.69 mg/mL，是對(duì)照組的4.34倍，其次是CSB處理組，為對(duì)照組的3.64倍，RHB處理組的蛋白質(zhì)釋放量低，是對(duì)照組的3.06倍。核酸釋放量的趨勢(shì)同蛋白質(zhì)，熱解液處理組的核酸釋放量均顯著高于對(duì)照組，其中CCB處理的菌懸液中核酸的含量最高，為193.42 μg/mL，其次是CSB處理組，而RHB處理組的核酸釋放量相對(duì)較低，僅為88.57 μg/mL。

表3 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌 蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)外滲的影響

注：不同字母表示處理間差異顯著(P≤0.05)，下同。

2.3 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌生理代謝的影響

2.3.1 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌菌絲蛋白質(zhì)和總糖含量的影響

由圖2可知，熱解液處理后的辣椒炭疽菌菌絲蛋白質(zhì)和總糖含量均顯著低于對(duì)照組，說明熱解液能夠抑制或干擾菌體蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的合成或吸收，不同秸稈熱解液中CCB處理組的蛋白質(zhì)和總糖含量最低，分別為122.35 mg/g和1.6%，CSB處理組次之，其蛋白質(zhì)和總糖含量分別為123.42 mg/g和1.85%，而含量較高的是RSB處理組，二者含量分別高達(dá)125.05 mg/g和5.02%。即菌絲蛋白質(zhì)和總糖含量大小順序?yàn)镃K>RSB>SSB>RHB>CSB>CCB。說明CCB和CSB對(duì)辣椒炭疽菌蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)代謝的影響較大，RSB的影響相對(duì)小。

圖2 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌蛋白質(zhì)和總糖含量的影響

2.3.2 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌菌絲細(xì)胞壁水解酶活性的影響

不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶活性的影響見圖3。

圖3 不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶活性的影響

由圖3可知，除RSB外，其他熱解液處理的辣椒炭疽菌幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶活性均顯著高于對(duì)照組，說明熱解液能夠誘導(dǎo)或激活上述3種酶，使其活性升高，從而降解細(xì)胞壁組分，破壞菌體細(xì)胞壁[17]。不同秸稈熱解液處理的辣椒炭疽菌細(xì)胞壁水解酶活性有差異，3種酶活性均最高的是CCB組，幾丁質(zhì)酶活性為1.03 U/(μg· s)，β-1，3-葡聚糖酶活性為15.364 U/(μg· s)，蛋白酶活性為6.865 U/(μg· s)，CSB處理組對(duì)3種酶活性的影響僅次于CCB處理組，而SSB和RHB處理組的幾丁質(zhì)酶和蛋白酶活性間無顯著差異，RSB處理組的3種酶活性最低，說明不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌細(xì)胞壁水解酶活性的影響大小不同。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

不同秸稈熱解液的EC50值大小順序?yàn)镽SB>RHB>SSB>CSB>CCB，說明CCB和CSB對(duì)辣椒炭疽菌的抑菌作用最強(qiáng)，其次為SSB，再次為RHB，RSB的作用最弱，且不同秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的MIC和MFC值進(jìn)一步證明了此結(jié)果，并證明秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌有殺菌作用。原料的種類對(duì)熱解液的理化特性有很大影響，不同秸稈熱解液中均含有有機(jī)酸類、酚類、酮類和醇類等化合物[8]，其組分類似于生物質(zhì)醋液[18]，但是其具體的物質(zhì)種類和含量上存在差異，不同秸稈熱解液中CSB的總酸含量最高，RSB的含量最低；CCB中有機(jī)酸和酚類物質(zhì)的相對(duì)含量較高，但不是最高[8]，不同秸稈熱解液理化特性的不同可能導(dǎo)致其在功能性方面存在差異。從而可知，秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的抑制作用可能與抑菌物質(zhì)的種類和含量均有關(guān)系，其抑菌效果可能來自于酸類以及酚類等化合物的直接抑菌作用[19]，也可能來源于多種物質(zhì)之間的協(xié)同作用。

熱解液處理的辣椒炭疽菌培養(yǎng)液的相對(duì)電導(dǎo)率以及蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)的滲出，其試驗(yàn)結(jié)果與木醋液對(duì)3種細(xì)菌的處理[20]結(jié)果基本一致。有機(jī)酸具有不同程度脂溶性，可與細(xì)胞膜中磷脂分子和脂多糖等成分互作，破壞膜穩(wěn)定性，同時(shí)加大胞內(nèi)滲透壓，引起細(xì)胞質(zhì)膜破裂，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄從而實(shí)現(xiàn)抑菌功能[21]。而秸稈熱解液中有機(jī)酸的相對(duì)含量高，因此，熱解液中存在的有機(jī)酸破壞病菌的膜完整性，致使胞內(nèi)大分子物質(zhì)外滲，影響其代謝活動(dòng)，可能是達(dá)到抑菌作用的主要途徑之一。不同秸稈熱解液對(duì)病菌胞膜的破壞作用有差異，不同秸稈熱解液中CCB和CSB的作用大于RHB、RSB、SSB，這與秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的抑菌效果相吻合。熱解液處理的辣椒炭疽菌絲的總糖和蛋白質(zhì)含量顯著低于對(duì)照組，這可能是熱解液中有機(jī)酸、酚類等抑菌物質(zhì)影響了菌體的物質(zhì)代謝，抑制了糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)的合成或吸收，導(dǎo)致對(duì)辣椒炭疽菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[16]。幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖作為細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，其合成和水解代謝都會(huì)影響細(xì)胞壁的功能，對(duì)細(xì)胞壁的完整性以及維持細(xì)胞滲透壓的穩(wěn)定都起著至關(guān)重要的作用。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，秸稈熱解液處理后菌絲中的幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶活性均升高，說明熱解液能夠誘導(dǎo)或激活相關(guān)酶活性，這可能會(huì)加快菌體細(xì)胞壁以及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能成分的降解，從而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的功能[22]。

3.2 結(jié)論

1) 從不同濃度秸稈熱解液的抑菌率可知，秸稈熱解液對(duì)辣椒炭疽菌具有良好的抑菌效果，但由于原料不同，其抑菌效果有差異。比較不同秸稈熱解液的EC50值、MIC和MFC值可得出：玉米芯熱解液對(duì)辣椒炭疽菌的抑菌效果最好，其次為玉米秸稈熱解液，稻草熱解液的抑菌效果最差。

2) 用秸稈熱解液處理辣椒炭疽菌后，菌絲的幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶活性顯著高于未處理組，菌絲的蛋白質(zhì)和總糖含量顯著低于未處理組，并且菌體培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)和核酸的釋放量以及相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照組。證明秸稈熱解液可能是通過破壞菌體細(xì)胞膜的完整性和物質(zhì)代謝的抑制等途徑起到抑菌作用。

3) 以農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈為原料的生物質(zhì)熱解液在辣椒綠色生產(chǎn)以及采后貯藏保鮮中的應(yīng)用研究需要進(jìn)一步的探討。