硫磺負(fù)離子添加劑對(duì)大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)

張劍鋒， 姜成哲*， 李 鎬， 片永泰

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院；2.延邊大學(xué)藥學(xué)院；3.延吉市宏大飼料有限公司:吉林 延吉 133000 )

礦物飼料添加劑是飼料添加劑的一種，因?yàn)樘烊伙暳系牡V物質(zhì)不能滿足動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，加上動(dòng)物體內(nèi)存在著對(duì)礦物質(zhì)吸收利用有抑制作用的因素，所以在動(dòng)物飼料中添加礦物飼料添加劑是十分必要的。目前我國(guó)常用的礦物飼料添加劑有食鹽、碳酸鈣骨粉等，新開發(fā)的添加劑有石灰?guī)r，沸石粉和膨潤(rùn)土等[1-2 ]。

硫的排泄途徑主要有經(jīng)糞排泄和尿排泄2種，飼料添加劑中無機(jī)硫超量時(shí)，才有可能使動(dòng)物產(chǎn)生厭食、失重、便秘、腹瀉及抑郁等毒性反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可引起動(dòng)物死亡[3-4]。

硫磺負(fù)離子飼料添加劑是延吉市宏大飼料有限公司采用納米技術(shù)加工電氣石粉、硫磺礦物粉與鍺礦粉，按特殊加工工藝制作而成，其主要成分為硫磺粉、電氣石粉、石粉、大豆粉及鍺礦粉。目前已有報(bào)道硫磺負(fù)離子飼料添加劑能夠提高延邊黃牛背最長(zhǎng)肌中鮮味氨基酸、不飽和脂肪酸和必需氨基酸的含量，降低飽和脂肪酸的含量；對(duì)黃牛的養(yǎng)分表觀消化率和生長(zhǎng)性能的提高有很大影響；可降低延邊黃牛血液中甘油三酯與總膽固醇含量，并且可以提高血液中免疫球蛋白、高密度脂蛋白的含量；還可以提高牛肉中粗蛋白的含量。硫磺負(fù)離子在急性毒性方面屬于無毒級(jí)物質(zhì)[5-6]。

該試驗(yàn)以硫磺負(fù)離子飼料添加劑飼喂大鼠90 d，研究其亞慢性毒性作用，為硫磺負(fù)離子飼料添加劑的安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

硫磺負(fù)離子飼料添加劑購(gòu)自于吉林省延吉市宏大飼料有限公司。專利號(hào)：201210031981.7，主要成分：硫磺粉46%、電氣石粉38%、石粉7%、大豆粉5%、鍺礦粉4%。

1.2 動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

清潔級(jí)SD大鼠80只，雌雄各半，清潔級(jí)，體重在200 g以上，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠飼養(yǎng)于延邊大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物室，動(dòng)物室的溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，每天12 h日光燈照明，清潔級(jí)顆粒飼料飼養(yǎng)，動(dòng)物飼料在延邊大學(xué)動(dòng)物中心加工，試驗(yàn)過程中大鼠自由攝食顆粒飼料和飲水。

1.3 主要儀器設(shè)備

常規(guī)解剖器械，UV759CRT紫外可見光分光光度計(jì)購(gòu)自于上海佑科儀器儀表有限公司，CT15RT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自于上海天美科學(xué)儀器有限公司，DG8全自動(dòng)血液生化分析儀購(gòu)自于南京華東有限責(zé)任公司。

1.4 方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)適應(yīng)觀察20 d后，分別將雌雄大鼠隨機(jī)分成4組，每組雌雄大鼠各10只，分別為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。對(duì)照組用普通飼料飼養(yǎng)，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別以含有0.3%、0.9%和2.7%硫磺負(fù)離子的飼料飼養(yǎng)。連續(xù)飼喂90 d。

1.4.2 試驗(yàn)方法和觀察指標(biāo)

每日給大鼠添加飼料和飲水，觀察記錄大鼠飲食飲水、外部特征(毛發(fā)、皮膚、眼和黏膜的變化)、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)，記錄有無異常的中毒癥狀或死亡的，每周稱量大鼠體重及攝食量并記錄。飼喂90 d后，雌雄大鼠用乙醚麻醉后進(jìn)行采血和剖檢，系統(tǒng)解剖腦、心、肺、肝、胃、脾、胸腺、小腸、大腸、腸系膜淋巴結(jié)、腎、腎上腺、睪丸、卵巢、子宮等臟器情況，記錄所見異常變化。用電子天平稱取腦、心、肝、胸腺、脾、肺、腎、腎上腺、睪丸、子宮重量，測(cè)定其臟器重量系數(shù)。臟器系數(shù)以每100 g體重所對(duì)應(yīng)的臟器質(zhì)量來表示。

1.4.3 血液樣品的采集及血常規(guī)測(cè)定

用乙醚將大鼠麻醉后，打開腹腔在后腔靜脈采集血液2份，分別置于2 mL離心管中，其中，1份加10%EDTA抗凝劑少許在4 ℃條件下保存，另1份3 500 r/min離心15 min后取上清于-20 ℃保存?zhèn)溆?。然后取抗凝血進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.4.4 血生化指標(biāo)檢測(cè)

將采集的大鼠血清采用DG8全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定其中的鉀(K)、鈉(NA)、氯(CL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、膽堿酯酶(CHE)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、清球比(A/G)、總膽固醇(CHO)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、磷(P)、鈣(GA)、葡萄糖(GIU)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫磺負(fù)離子添加劑的大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)處理對(duì)大鼠體重的變化

試驗(yàn)期間各組動(dòng)物的基本情況良好，無厭食、死亡和其它異常行為，通過每周對(duì)大鼠體重的記錄，發(fā)現(xiàn)雌性高劑量組在第28天和第49天時(shí)，與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，其余各組與對(duì)照組相比，無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 硫磺負(fù)離子添加劑對(duì)大鼠體重變化的影響

注：*表示與對(duì)照組相比，P<0.05。

2.2 硫磺負(fù)離子添加劑的大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)處理對(duì)大鼠臟器系數(shù)的變化

硫磺負(fù)離子添加劑的大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)各組大鼠末期(90 d)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，試驗(yàn)中期高劑量組雌性大鼠肺的臟器系數(shù)高于對(duì)照組，并且差異顯著(P<0.05)，其余各組與對(duì)照組相比，均無顯著性差異(P>0.05)；試驗(yàn)?zāi)┢诘蛣┝拷M雄性大鼠腎臟的臟器系數(shù)與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P<0.05)，中劑量組雌性大鼠胸腺的臟器系數(shù)與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P<0.05)，其余各組與對(duì)照組相比，均無顯著性差異(表2)。

表2 硫磺負(fù)離子添加劑對(duì)大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)臟器系數(shù)影響(X±SD)

注：*表示與對(duì)照組本比，P<0.05。

2.3 硫磺負(fù)離子添加劑大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)各組大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果

試驗(yàn)雌雄性大鼠末期低、中、高3個(gè)劑量組的血液學(xué)檢查結(jié)果與對(duì)照組相比，均無顯著性差異(表3)。

表3 硫磺負(fù)離子添加劑對(duì)大鼠血液學(xué)檢查結(jié)果

2.4 硫磺負(fù)離子添加劑大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)各組大鼠血清學(xué)檢查結(jié)果

試驗(yàn)?zāi)┢诖菩鄞笫蟾鱾€(gè)試驗(yàn)組的血清學(xué)檢查結(jié)果與對(duì)照組相比，無顯著性差異(表4)。

表4 硫磺負(fù)離子添加劑對(duì)大鼠血清生化檢查結(jié)果(X±SD)

2.5 硫磺負(fù)離子添加劑大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)各組大鼠組織學(xué)檢查結(jié)果

通過光學(xué)顯微鏡對(duì)組織切片的觀察，未發(fā)現(xiàn)組織有異常。

3 討論與結(jié)論

動(dòng)物的體重可以大致反映動(dòng)物體在各生長(zhǎng)發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、健康狀態(tài)和生理狀況。試驗(yàn)期間各組試驗(yàn)動(dòng)物基本情況良好，無厭食、死亡和其它異常行為出現(xiàn)。試驗(yàn)組大鼠體重變化處于平穩(wěn)狀態(tài)，僅發(fā)現(xiàn)雌性高劑量組在第4周(28 d)和第7周(49 d)時(shí)，與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，體重平均水平低于對(duì)照組。這種現(xiàn)象可能是一些不確定因素(例如大鼠一段時(shí)間內(nèi)食欲不好，加上硫磺負(fù)離子劑量過高導(dǎo)致飼料適口性差)造成的，李應(yīng)超等[7]在酸棗仁口服液雛雞亞慢性毒性試驗(yàn)時(shí)也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，并認(rèn)為這并不代表試驗(yàn)藥物對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性。

試驗(yàn)?zāi)┢谛坌源笫笤囼?yàn)組體重的平均值大于對(duì)照組，這表明硫磺負(fù)離子飼料添加劑對(duì)雄性大鼠的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。原因可能是試驗(yàn)初期，試驗(yàn)組大鼠的飼料由普通飼料突然變換為含有硫磺負(fù)離子的飼料大鼠有些不適應(yīng)，加上硫磺負(fù)離子對(duì)胃腸有一定的刺激作用。隨著大鼠的適應(yīng)，飼料利用率也開始相對(duì)上升。雌性大鼠和雄性大鼠在生長(zhǎng)發(fā)育方面有一定的差異，這也導(dǎo)致了雌性和雄性大鼠對(duì)硫磺負(fù)離子的利用效果不同。

該試驗(yàn)臟器系數(shù)的結(jié)果顯示，試驗(yàn)?zāi)┢谕M大鼠肺的臟器系數(shù)沒有顯著性差異，試驗(yàn)?zāi)┢诘蛣┝拷M雄性大鼠腎臟的臟器系數(shù)與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P<0.05)，中劑量組雌性大鼠胸腺的臟器系數(shù)與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P<0.05)，而與之相對(duì)應(yīng)的高劑量組都沒出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。這顯然不符合劑量—反應(yīng)關(guān)系，并且高劑量組大鼠腎臟未見明顯的病理組織學(xué)變化，故認(rèn)為是非特異性的病理改變。

試驗(yàn)?zāi)┢诟鹘M大鼠紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量以及中性百分比、淋巴百分比、其它百分比都與對(duì)照組沒有顯著性差異，血細(xì)胞數(shù)值在正常范圍內(nèi)[8]，說明硫磺負(fù)離子飼料添加劑沒有對(duì)血常規(guī)造成不良的影響。

血清生化指標(biāo)是臨床診斷和治療疾病的重要依據(jù)，試驗(yàn)?zāi)┢趯?duì)照組和試驗(yàn)組大鼠血清生化指標(biāo)都在正常范圍內(nèi)[8]，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。

最近以來，隨著很多學(xué)者對(duì)天然產(chǎn)物和微量元素的多項(xiàng)毒理學(xué)及基礎(chǔ)研究[9-14]和飼料營(yíng)養(yǎng)學(xué)者及飼料企業(yè)不斷優(yōu)化飼料配方以及改進(jìn)飼料加工技術(shù)[15]，我國(guó)的飼料產(chǎn)業(yè)將不斷發(fā)展。

總之，硫磺負(fù)離子飼料添加劑喂養(yǎng)大鼠90 d沒有產(chǎn)生毒性，最適添加量為0.9%。