牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)禽多殺性巴氏桿菌ptfA基因DNA疫苗免疫效果的影響

杜珍奇，宮 強(qiáng)，牛明福，秦翠麗，任國(guó)艷，馬麗蘋(píng)，伍家發(fā)，張 彬

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/ 食品微生物河南省工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023)

由禽多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)病引起的禽霍亂是一種接觸性傳染病，呈世界性分布，在我國(guó)依然是常見(jiàn)的禽類(lèi)多發(fā)病之一，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了一定的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于該病的治療主要采用抗生素，雖然效果較好，但也存在產(chǎn)生耐藥性風(fēng)險(xiǎn)及藥物殘留等問(wèn)題，影響產(chǎn)蛋率。對(duì)于該病的預(yù)防，目前臨床上常用的疫苗包括弱毒活疫苗和滅活疫苗兩種，其中弱毒活疫苗是我國(guó)禽疫苗中研究較多的一類(lèi)。但Pm 抗原結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，且易發(fā)生變異，導(dǎo)致目前商品化弱毒疫苗的免疫效果并不是特別理想?，F(xiàn)有的市售弱毒苗存在免疫期短、保護(hù)力低、副作用偏大等問(wèn)題。而滅活苗的免疫效果尚不及弱毒疫苗，因此有必要研制新型有效的疫苗。包括重組亞單位疫苗、DNA 疫苗、缺失突變活疫苗等在內(nèi)的多殺性巴氏桿菌病新型疫苗均有相關(guān)研究報(bào)道[1-5]。其中DNA 疫苗因具有制備方便、成本低廉、可同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為疫苗學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[6]。本實(shí)驗(yàn)室前期制備了PmptfA基因的裸DNA 疫苗和殼聚糖納米DNA 疫苗，雖然均可為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供一定的保護(hù)，但仍不及弱毒活疫苗[7]。因此，需采取措施進(jìn)一步提高其免疫效果。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上由牡丹籽粕中提取蛋白，酶解后獲得酶解產(chǎn)物，以其為佐劑與PmptfA基因的DNA 疫苗混合后免疫動(dòng)物，并對(duì)其誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平及攻毒保護(hù)效果進(jìn)行了檢測(cè)，為Pm 病DNA 疫苗及新型疫苗佐劑的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 Pm 強(qiáng)毒株CVCC474 購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。Pm 弱毒活疫苗為齊魯動(dòng)物保健品公司產(chǎn)品。1日齡雛雞購(gòu)自河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院。限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB 公司；HRP 標(biāo)記的兔抗雞IgG 購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司；雞IL-2、IL-4 檢測(cè)試劑盒為嘉美生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；菠蘿蛋白酶為Sigma 公司產(chǎn)品；牡丹籽粕由本實(shí)驗(yàn)室保存；重組蛋白PtfA(rPtfA)由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2ptfA基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 常規(guī)方法提取Pm CVCC474 菌株的基因組DNA (引物略)，以其為模板，PCR 擴(kuò)增ptfA基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，經(jīng)BamHⅠ/EcoRⅠ酶切后與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM83，提取質(zhì)粒酶切鑒定后獲得含ptfA基因的重組質(zhì)粒，命名為pcP。

1.3 牡丹籽蛋白的提取 采用堿提酸沉法提取牡丹籽蛋白[8]。將牡丹籽粕粉碎后按照1∶25 的比例加入蒸餾水，以NaOH 調(diào)節(jié)pH 值為9.25，53 ℃水浴加熱68 min 后高速離心取上清，以HCL 調(diào)節(jié)pH 值為3.5，高速離心，將沉淀冷凍干燥后獲得牡丹籽蛋白粉，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物的制備 將牡丹籽蛋白粉溶于去離子水，置于80 ℃水浴中預(yù)熱20 min 后調(diào)節(jié)pH 為6.5，加入菠蘿蛋白酶，48 ℃水浴作用4 h，置于沸水浴滅活10 min，以冰浴冷卻后10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)真空濃縮，冷凍干燥后獲得牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 動(dòng)物免疫 大量制備ptfA基因的重組質(zhì)粒pcP及空載體pcDNA3.1(+)。將120 只1日齡雛雞飼養(yǎng)至6 周齡時(shí)隨機(jī)平均分為6 組，分別為DNA 疫苗組、佐劑-DNA 疫苗組、灌胃組、弱毒疫苗組、pcDNA3.1(+)組和PBS 組。灌胃組將凍干的牡丹籽酶解產(chǎn)物以生理鹽水配制成5 mg/mL 的溶液進(jìn)行灌胃，每只雞每天灌胃0.2 mL，連續(xù)灌胃15 d，期間其它各組正常飼養(yǎng)，灌胃結(jié)束后對(duì)各組實(shí)驗(yàn)雞同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫，免疫方式為股四頭肌注射。DNA 疫苗組和灌胃組將pcP 質(zhì)粒調(diào)整濃度為1 μg/μL 后進(jìn)行免疫，每只雞免疫200 μL。佐劑-DNA 疫苗組向pcP 質(zhì)粒中添加凍干的牡丹籽酶解產(chǎn)物使其終濃度為25 %且調(diào)整DNA 含量為 1 μg/μL，隨后每只雞注射200 μL。pcDNA3.1(+)組的雞每只注射濃度為1 μg/μL 的空載體 200 μL。PBS 對(duì)照組雞每只注射200 μL 1×PBS (pH7.2)。以上各組均免疫 3 次，每次間隔2 周。弱毒活疫苗組僅于初次免時(shí)肌注1 羽份/雞。

1.6 免疫雞抗體檢測(cè) 初次免疫后每周采血，分離血清，分別以純化的rPtfA 蛋白和Pm 全菌體為包被抗原，以待檢血清(1 ∶100)為一抗，以兔抗雞IgG-HRP (1∶2 000)為二抗，進(jìn)行間接ELISA 試驗(yàn)，在OD490nm處測(cè)定吸收值以確定各組免疫雞的血清特異性抗體水平，共檢測(cè)6 周。

1.7 淋巴細(xì)胞增殖水平測(cè)定 各免疫組雞分別于每次免疫后2 周時(shí)無(wú)菌心臟采血，分離外周血淋巴細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以RPMI1640 培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL。96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入50 μL 細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)孔和陰性對(duì)照孔各設(shè)3 個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn) 孔每孔加入 50 μL 10 μg/mL 的ConA，陰性對(duì)照孔每孔加入50 μL RPIM1640 培養(yǎng)液，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)60 h 后每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。然后每孔加100 μL SDS-HCL，繼續(xù)作用2 h 終止反應(yīng)，測(cè)定OD570nm吸光值，計(jì)算刺激值SI=OD570nm(實(shí)驗(yàn)孔)/OD570nm(陰性對(duì)照孔)。

1.8 細(xì)胞因子分泌水平的測(cè)定 每次免疫2 周后，采血分離外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL。按上述同樣方法制備ConA 誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞，37 ℃ 5 % CO2培養(yǎng)60 h 后，吸取培養(yǎng)上清離心收集后-20 ℃保存。采用相應(yīng)檢測(cè)試劑盒對(duì)各組免疫雞分泌的IL-2 和IL-4 水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 動(dòng)物攻毒試驗(yàn) 第3 次免疫2 周后，對(duì)各免疫組的雞以5LD50/ 只肌肉注射Pm 強(qiáng)毒菌株CVCC474進(jìn)行攻毒。攻毒后繼續(xù)飼養(yǎng)觀察15 d，記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡數(shù)量，評(píng)價(jià)各疫苗的保護(hù)效果。

2 結(jié) 果

2.1 血清抗體水平檢測(cè)結(jié)果 初次免疫后每周采血，采用ELISA 方法測(cè)定各組免疫雞的特異性抗體水平，結(jié)果顯示。以rPtfA 蛋白為包被抗原時(shí)，檢測(cè)到的DNA 疫苗組、佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組免疫雞的血清抗體水平明顯高于弱毒活疫苗組(p＜0.05)。而以全菌體為包被抗原時(shí)檢測(cè)到的抗體水平則反之，弱毒活疫苗組顯著高于上述3 組(p＜0.05)。但無(wú)論以rPtfA 蛋白還是全菌體為包被抗原，DNA 疫苗組、佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組雞的血清抗體水平之間則無(wú)明顯差異(p＞0.05) (圖1)。表明牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物作為佐劑或預(yù)先灌胃對(duì)ptfA 基因DNA疫苗誘導(dǎo)的血清抗體水平均無(wú)明顯促進(jìn)作用。

2.2 外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果 每次免疫2 周后，各組免疫雞采血并分離制備外周血淋巴細(xì)胞懸液，以ConA 刺激后，MTT 法檢測(cè)其增殖情況。結(jié)果顯示，初次免疫后各疫苗組雞之間的SI 值無(wú)明顯差異(p＞0.05)。二免后弱毒疫苗組 SI 值明顯高于DNA 疫苗組、佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組(p＜0.05)，且極顯著高于pcDNA3.1(+)空載體組和PBS 組(p＜0.01)，但DNA 疫苗組、佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組之間的SI 值則差異不顯著(p＞0.05)。第3 次免疫后，弱毒疫苗組的SI 值仍顯著高于佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組(p＜0.05)，且極顯著高于 DNA 疫苗組(p＜0.01)，佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組之間無(wú)顯著差異(p＞0.05)，但均顯著高于DNA 疫苗組(p＜0.05) (圖2)。表明牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物可在一定程度上提高ptfA 基因DNA 疫苗誘導(dǎo)的免疫雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖水平。

2.3 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 每次免疫后2 周時(shí)制備ConA 刺激的免疫雞外周血淋巴細(xì)胞懸液，測(cè)定其分泌的IL-2 和IL-4 水平，結(jié)果顯示。初次免疫后各疫苗組雞外周血淋巴細(xì)胞分泌的IL-2 和IL-4 水平均無(wú)顯著差異(p＞0.05)。2 免和 3 免后，佐劑 -DNA 疫苗組和灌胃組雞分泌的IL-2 的量顯著高于DNA 疫苗組(p＜0.05)，但低于弱毒疫苗組(p＜0.05)，且弱毒疫苗組極顯著高于DNA 疫苗組(p＜0.05)。2 免后，DNA 疫苗組、佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組分泌的IL-4 水平無(wú)顯著差異(p＞0.05)，但均低于弱毒疫苗組(p＜0.05)。3 免后弱毒疫苗組雞的IL-4 水平顯著高于佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組(p＜0.05)，且極顯著高于DNA 疫苗組(p＜0.01)，佐劑 -DNA 疫苗組雞雖比灌胃組雞分泌IL-4 的量稍高，但兩者無(wú)顯著差異(p＞0.05)，且均明顯高于 DNA 疫苗組(p＜0.05) (圖3)。表明牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物作為佐劑和預(yù)先灌胃對(duì)ptfA 基因DNA 疫苗誘導(dǎo)免疫雞外周血淋巴細(xì)胞分泌IL-2 和IL-4 的能力均有一定的增強(qiáng)作用。

2.4 動(dòng)物攻毒試驗(yàn)結(jié)果 3 免2 周后攻毒，連續(xù)觀察15 d，記錄各組雞的存活情況，結(jié)果顯示。pcDNA3.1(+)和PBS 對(duì)照組的雞分別在攻毒后第5 d 和第6 d 全部死亡。弱毒疫苗組的雞在攻毒后第4 d開(kāi)始出現(xiàn)死亡，第5 d 后存活數(shù)保持不變。DNA 疫苗組、佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組均在攻毒后第3 d開(kāi)始有雞死亡，在第7 d～8 d 后不再出現(xiàn)死亡雞(圖4)。攻毒15 d 后計(jì)算弱毒疫苗組、DNA 疫苗組、佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組的保護(hù)率分別為85%、55%、70 %和60 %。表明牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物作為佐劑和預(yù)先灌胃均可提高ptfA 基因DNA 疫苗的保護(hù)效果，且以其作為佐劑時(shí)效果更優(yōu)，但其提供的保護(hù)效果均不如弱毒疫苗組。

3 討 論

禽霍亂是影響禽類(lèi)健康的重要疫病之一，現(xiàn)有傳統(tǒng)疫苗存在許多不足之處，因此研制新型疫苗勢(shì)在必行。本研究室前期以Pm 的ompH、ompA和ptfA基因構(gòu)建了相應(yīng)的DNA 疫苗，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上述DNA 疫苗的保護(hù)效果均不及弱毒活疫苗，以ompH和ompA基因融合的DNA 疫苗的免疫效果雖優(yōu)于單價(jià)DNA 疫苗，但也僅與弱毒疫苗相當(dāng)[9]。因此，需采取措施如使用新型疫苗佐劑等進(jìn)一步提高Pm DNA 疫苗的免疫效果。

生物蛋白經(jīng)蛋白酶解后的主要產(chǎn)物為多肽，許多生物活性肽具有較好的保健功能，如抗氧化肽、降壓肽、免疫活性肽等。免疫活性肽是一類(lèi)存在于生物體內(nèi)具有免疫功能的多肽，在體內(nèi)一般含量較低，結(jié)構(gòu)多樣，是一種細(xì)胞信號(hào)傳遞物質(zhì)，可通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌等多種方式行使其生物學(xué)功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。免疫活性肽的相關(guān)研究已成為免疫學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，包括大豆多肽、花生多肽、小米多肽等在內(nèi)的多種多肽的免疫調(diào)節(jié)作用均有相關(guān)研究[10-13]。且目前也有研究顯示某些多肽可增強(qiáng)DNA 疫苗的免疫效果[14-15]。

牡丹屬于芍藥科芍藥屬多年生木本植物，是我國(guó)的傳統(tǒng)名花之一，不僅具有極高的觀賞價(jià)值，還具有一定的藥用和食用價(jià)值。牡丹籽作為生產(chǎn)丹皮的副產(chǎn)物，其油脂含量較高，目前主要用于油料加工的原料，牡丹籽榨油后的籽粕中含有豐富的蛋白，含量可達(dá)20 %～30 %[16-17]。因此有必要對(duì)其中的蛋白尤其是其酶解后的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的研究和利用。

本實(shí)驗(yàn)提取牡丹籽蛋白并以菠蘿蛋白酶進(jìn)行了酶解，研究了酶解產(chǎn)物對(duì)PmptfA基因DNA 疫苗在雞體內(nèi)免疫效果的影響?？贵w檢測(cè)結(jié)果顯示以rPtfA蛋白和Pm 全菌體為包被抗原時(shí)，灌胃組和佐劑-DNA 疫苗組均不能提高ptfA 基因DNA 疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清抗體水平。以rPtfA 蛋白為包被抗原時(shí)檢測(cè)到的DNA 疫苗組、佐劑-DNA 疫苗組和灌胃組的血清抗體水平高于弱毒疫苗組，而以全菌體為包被抗原時(shí)檢測(cè)結(jié)果則反之，其原因應(yīng)與疫苗所含抗原成分有關(guān)，當(dāng)以rPtfA 蛋白包被時(shí)，包被抗原成分與DNA 疫苗相似，而弱毒疫苗免疫動(dòng)物后機(jī)體會(huì)產(chǎn)生針對(duì)多種抗原的抗體，因此檢測(cè)到的針對(duì)單一抗原的抗體水平較低，低于其它三組，反之以全菌體包被時(shí)亦是如此。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞因子分泌水平的測(cè)定結(jié)果則顯示牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物通過(guò)預(yù)先灌胃或作為佐劑均對(duì)ptfA 基因DNA 疫苗誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖水平和IL-2、IL-4 分泌水平均具有一定的促進(jìn)作用，表明其對(duì)該DNA 疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答具有一定的增強(qiáng)作用。攻毒保護(hù)率是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的直觀指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物或以其為佐劑均可在一定程度上提高PmptfA基因DNA 疫苗為實(shí)驗(yàn)雞提供的保護(hù)率，尤以佐劑-DNA 疫苗組效果較好，但仍達(dá)不到弱毒疫苗的保護(hù)水平。為進(jìn)一步提高其免疫效果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可通過(guò)調(diào)整牡丹籽蛋白酶解產(chǎn)物與DNA 疫苗的比例，或?qū)γ附猱a(chǎn)物中的免疫活性肽純化和結(jié)構(gòu)鑒定后以其為佐劑研究其效應(yīng)，也可嘗試以其它蛋白酶或多種蛋白酶聯(lián)合酶解牡丹籽蛋白后研究其作為DNA 疫苗佐劑的效果。