利用小鼠骨骼肌細(xì)胞持續(xù)表達(dá)單鏈胰島素類似物進(jìn)行1型糖尿病模型鼠的長(zhǎng)效基因治療

楊平，蘇若珂，鄧璐，楊月瑤，王剛

(四川大學(xué)生物材料工程研究中心，成都610064)

1型糖尿病是由于過(guò)度免疫反應(yīng)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞被破壞，致使胰島素缺乏，進(jìn)而引起高血糖和一系列威脅生命的并發(fā)癥。該類患者需要每日注射胰島素來(lái)維持體內(nèi)血糖的正常水平，這給患者帶來(lái)許多的麻煩、痛苦和風(fēng)險(xiǎn)?；蛑委熞云浜?jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、來(lái)源充足、療效持久等優(yōu)勢(shì)引起大眾關(guān)注，且以腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、裸質(zhì)粒等作為臨床試驗(yàn)中的代表(Yoon &Jun，2002；Handorfetal.，2015)。然而，前三者來(lái)源于病毒，存在感染性、容量有限、操作復(fù)雜等局限性，而相對(duì)安全的裸質(zhì)粒卻有嚴(yán)重的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低下問(wèn)題。骨骼肌作為基因治療的重要平臺(tái)之一，有以下特點(diǎn)：(1)是重要的糖代謝組織，在全身分布廣泛，且肌纖維的使用壽命較長(zhǎng)、再生能力較強(qiáng)，即使受損后也能繼續(xù)發(fā)揮生物學(xué)功能(Blaverietal.，1999)；(2)一些哺乳動(dòng)物的組織，尤其是骨骼肌，能夠自發(fā)地吸收不與脂質(zhì)絡(luò)合的外來(lái)質(zhì)粒(Konetal.，1999)；(3)高度血管化的肌肉允許重新合成的蛋白質(zhì)分泌到體循環(huán)中(Kessleretal.，1996；Olfertetal.，2001)。因此，骨骼肌是利用裸質(zhì)粒作為基因治療載體進(jìn)行胰島素異位分泌的潛在平臺(tái)之一。然而，肌肉、肝臟等組織由于缺乏β細(xì)胞特定反應(yīng)酶而無(wú)法直接利用胰島素基因表達(dá)出高活性成熟胰島素。因此，本研究首先將胰島素基因序列中的C肽換成靈活的柔性肽linker(GGGGS)3(Kuferetal.，1997)，再使用Pluronic L64-電脈沖體系來(lái)提高裸質(zhì)粒的體內(nèi)傳遞效率(Liuetal.，2014)，旨在通過(guò)這套外源胰島素基因在骨骼肌原位高效傳遞的系統(tǒng)來(lái)提高1型糖尿病小鼠的體內(nèi)基因治療效果，以實(shí)現(xiàn)胰島素長(zhǎng)期、有效的分泌，進(jìn)而能為減少患者每日注射胰島素的身心痛苦提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(川)2015-030]預(yù)訂足量6～8周齡雄性BALB/c小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每籠放置6～8只小鼠，并且在濕度45%～65%、21 ℃的環(huán)境中飼養(yǎng)，動(dòng)物房規(guī)范提供12 h日照和12 h黑夜環(huán)境。所有實(shí)驗(yàn)均得到相關(guān)倫理委員會(huì)認(rèn)可，并且按照規(guī)定和制度操作[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2013-07]。所有實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組：(1)正常小鼠(NC)組；(2)以pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒為對(duì)照的糖尿病小鼠，并且進(jìn)行Pluronic L64-電脈沖治療，即L/E-pcDNA3.1(+)組；(3)僅使用含單鏈胰島素類似物基因的裸質(zhì)粒治療組，即pcDNA-INS組；(4)以含單鏈胰島素類似物基因的pcDNA-INS質(zhì)粒和Pluronic L64-電脈沖進(jìn)行聯(lián)合治療的糖尿病小鼠，即L/E-pcDNA-INS組?？崭寡撬脚c生存率最初檢測(cè)時(shí)以每組12只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在單次治療后的4周內(nèi)進(jìn)行觀察和檢測(cè)，其余指標(biāo)為每次每組4只進(jìn)行取樣檢測(cè)。

1.2 試劑及儀器

相關(guān)試劑材料主要包括：質(zhì)粒小量提取試劑盒(Omega)、限制性內(nèi)切酶及相關(guān)試劑(Fermentas)、膠回收試劑盒(Omega)、連接酶及相關(guān)試劑(Invitrogen)、質(zhì)粒大量提取試劑盒(Invitrogen)、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(Thermo)、胰島素ELISA試劑盒(mlbio)、鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma)、血糖檢測(cè)試紙(羅氏)、Pluronic L64(Sigma-Aldrich)、相關(guān)抗體和染色劑(Cloud-Clone Corp和Abcam)、pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室前期購(gòu)買(mǎi)并且保存、含有胰島素類似物基因的質(zhì)粒PUC57由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成并提供。相關(guān)儀器主要包括：凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDocTM XRS+，Bio-Rad)，NanoDrop2000(Thermo)、SDZ-Ⅴ型電脈沖治療儀(華佗)、多功能酶標(biāo)儀(Varioskan Flash，Thermo)、血糖檢測(cè)儀(羅氏)、數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)粒的制備與鑒定從NCBI上找到所需胰島素基因序列(NM_008386.4)，分析信號(hào)肽、胰島素B鏈、胰島素A鏈、胰島素C肽等各部分的序列，將C肽的序列刪除，替換成柔性肽序列(GGGGS)3，并在兩端加上酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ和BamHⅠ)，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，并構(gòu)建到PUC57載體上。將空載體pcDNA3.1(+)或PUC57質(zhì)粒(含胰島素類似物基因)在含氨芐抗生素的平板上活化，進(jìn)行質(zhì)粒小提鑒定，再根據(jù)設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行膠回收、連接反應(yīng)等操作，構(gòu)建好含胰島素的載體pcDNA-INS后，將其進(jìn)行酶切鑒定后測(cè)序，確認(rèn)無(wú)誤后對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行大量提取。將所需質(zhì)粒濃度調(diào)至約5 000 ng·μL-1進(jìn)行分裝，-20 ℃(短期)或-80 ℃(長(zhǎng)期)保存。

1.3.2 模型建立及治療STZ放在低溫、干燥、避光環(huán)境中保存，按照要求配制1%枸櫞酸緩沖液(pH4.2～4.5)，4 ℃預(yù)冷。將小鼠禁食不禁水喂養(yǎng)過(guò)夜，并以180～250 mg每公斤體質(zhì)量一次性腹腔注射STZ溶液，對(duì)照組以同樣方式注射不含STZ的等量1%枸櫞酸緩沖液。注射后第3天開(kāi)始檢測(cè)小鼠血糖值，大于16.7 mmol·L-1并且穩(wěn)定7～14 d則視為糖尿病模型構(gòu)建成功。治療時(shí)，NC組注射等體積的生理鹽水。質(zhì)粒配制及Pluronic L64-電脈沖體系的使用：以生理鹽水稀釋終濃度0.1%L64與60 μL質(zhì)粒形成治療混合物，室溫放置5 min，并將小鼠兩側(cè)的脛骨前肌脫毛，在兩側(cè)等量注射治療混合物，1 h后對(duì)小鼠2條腿的脛骨前肌進(jìn)行電脈沖治療(參數(shù)設(shè)置為5 Hz，3 min)，單點(diǎn)單次注射，觀察4周左右。

1.3.3 血糖和體質(zhì)量的檢測(cè)采用電子天平和血糖檢測(cè)儀分別對(duì)小鼠體質(zhì)量與血糖進(jìn)行檢測(cè)，每次測(cè)量血糖之前都將小鼠禁食不禁水過(guò)夜處理，次日用羅氏血糖采集針扎出小鼠尾巴的血滴或者用剪尾法采集小鼠血滴。每周至少檢測(cè)1次血糖水平。

1.3.4 生存率檢測(cè)及小鼠形體觀察從治療當(dāng)天開(kāi)始，每日觀察小鼠的外形和生存情況等，記錄每次死亡的小鼠，于第4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)各組小鼠進(jìn)行拍照記錄。

1.3.5 胰島素檢測(cè)(1)胰島素含量檢測(cè)：使用眼球摘除術(shù)收集小鼠血樣，4 ℃ 3 000 r·min-1離心20 min，仔細(xì)收集上清，4 ℃臨時(shí)保存，-20 ℃短期保存，-80 ℃長(zhǎng)期保存，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行胰島素ELISA檢測(cè)。(2)胰島素免疫組化檢測(cè)：將小鼠引頸法處死后，用解剖剪小心取出胰腺、肌肉等組織器官，用4%多聚甲醛固定液處理后脫水、包埋再切片，切片放入染色缸染色，并且進(jìn)行抗體孵育，再使用顯色試劑盒處理，洗滌后用蘇木精輕度復(fù)染，再封片。最后將制好的樣品在室溫下保存，并且用BA400Digital顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果觀察和圖片采集。

1.3.6 蘇木精-伊紅(HE)染色病理檢測(cè)將小鼠引頸法處死后，用解剖剪小心取出心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺及肌肉等所需的組織器官，并將其用預(yù)冷后的1×磷酸緩沖液(PBS)洗滌后放入15 mL離心管中，再注入4%多聚甲醛固定液，4 ℃?zhèn)溆?。脫水、包埋后切片，將切片放入染色缸進(jìn)行蘇木精染色，充分洗滌后再用伊紅染液染色，再充分洗滌并且使用中性樹(shù)膠封片。最后將制好的樣品在室溫下保存，并且用BA400Digital顯微攝像系統(tǒng)觀察結(jié)果和采集圖片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Two-Way ANOVA或t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05表示數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含胰島素類似物基因的載體(pcDNA-INS)構(gòu)建及結(jié)果分析

1.5%瓊脂糖凝膠電泳將構(gòu)建好的pcDNA-INS質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，其片段大小為250～500 bp，且完整的pcDNA-INS質(zhì)粒、pcDNA3.1(+)質(zhì)粒以及酶切后的pcDNA-INS載體大小和相對(duì)位置較為準(zhǔn)確(圖1：A)。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示其基因序列正確，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作(圖1：B)。

圖1 質(zhì)粒鑒定及胰島素類似物基因測(cè)序Fig.1 Plasmids identification and gene sequence of insulin analogueA.質(zhì)粒鑒定的電泳結(jié)果：M.Marker，1.構(gòu)建完成的pcDNA-INS質(zhì)粒載體(未酶切)，2.pcDNA-INS質(zhì)粒載體雙酶切鑒定，3.pcDNA3.1(+)空載體；B.pcDNA-INS質(zhì)粒載體上胰島素類似物基因的測(cè)序結(jié)果A.plasmid identification：M.Marker，1.complete pcDNA-INS plasmid，2.pcDNA-INS plasmid identified by double enzyme digestion，3.pcDNA3.1(+)plasmid；B.gene sequence of insulin analogue on pcDNA-INS plasmid vector

2.2 糖尿病小鼠模型的建立

糖尿病小鼠血糖水平為(24.3±5.74)mmol·L-1，而正常小鼠血糖水平為(4.8±1.01)mmol·L-1，2組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.266，P<0.05)。此外，糖尿病小鼠的體質(zhì)量顯著降低，為(18.67±4.22)g，而正常小鼠的體質(zhì)量為(22.42±3.06)g，2組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.445，P<0.05)。胰腺組織HE染色結(jié)果顯示，糖尿病小鼠的胰島細(xì)胞遭到了嚴(yán)重?fù)p害，模型構(gòu)建結(jié)果可靠(圖2)。

2.3 各組小鼠的血糖水平變化

在治療后第3天開(kāi)始檢測(cè)每組小鼠的血糖水平，結(jié)果顯示，NC組小鼠保持正常的血糖水平(約5 mmol·L-1)；L/E-pcDNA3.1(+)組小鼠的血糖水平較高，與NC組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；pcDNA-INS組小鼠的血糖水平波動(dòng)較大，與NC組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；L/E-pcDNA-INS組的小鼠血糖水平明顯下降，且在第1周后與NC組接近，與其他2組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖2 正常小鼠(左)與鏈脲佐菌素誘導(dǎo)小鼠(右)的胰腺蘇木精-伊紅染色結(jié)果Fig.2 Hematoxylin-eosin staining pancrea results of normal (left)and streptozotocin-induced mice (right)

圖3 各組小鼠治療后的血糖變化Fig.3 Blood glucose trends of mice in different groups after treatments與NC組相比，** P<0.01，*** P<0.001；與L/E-pcDNA-INS組相比，▲▲▲ P<0.001；與L/E-pcDNA3.1(+)組相比，△ P<0.05，△△ P<0.01；下同Compared with normal control group，** P<0.01，*** P<0.001；compared with L/E-pcDNA-INS group，▲▲▲ P<0.001；compared withL/E-pcDNA3.1(+)group，△ P<0.05，△△ P<0.01，△△△ P<0.001；the same below

2.4 各組小鼠的血清胰島素含量變化

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，3組糖尿病小鼠血清胰島素水平間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是顯著低于NC組(P<0.05)。在治療后第2周，pcDNA-INS組的胰島素水平明顯升高，并且顯著高于L/E-pcDNA3.1(+)組(P<0.05)，與NC組和L/E-pcDNA-INS組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而 L/E-pcDNA-INS組與NC組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在治療后第4周，L/E-pcDNA-INS組的胰島素水平雖然降低了一些，但與NC組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且與pcDNA-INS組、L/E-pcDNA3.1(+)組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。pcDNA-INS組在治療4周后顯著低于 NC組和L/E-pcDNA-INS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組小鼠治療后的血清胰島素變化Fig.4 Serum insulin contents of mice in different groups after treatments

2.5 糖尿病小鼠生存率情況及免疫組化結(jié)果

治療4周內(nèi)，NC組和L/E-pcDNA-INS組(12/12)的生存率均為100%，L/E-pcDNA3.1(+)組、pcDNA-INS組的生存率分別為50%(6/12)、67%(8/12)，2組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其中，L/E-pcDNA3.1(+)組與NC組或L/E-pcDNA-INS組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5：A)。在第4周時(shí)，取4組小鼠的胰腺和肌肉組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠胰腺均處于受損狀態(tài)，且胰腺胰島素含量顯著少于正常小鼠(圖5：B)，而L/E-pcDNA-INS組小鼠骨骼肌胰島素含量明顯高于其他3組(圖5：C)。

圖5 各組小鼠治療后的生存情況(A)及胰腺(B)和肌肉(C)的免疫組化結(jié)果Fig.5 Survival condition (A)and immunohistochemical results of pancreas (B)and muscle (C)A：與L/E-pcDNA3.1(+)組相比，☆ NC組，P<0.05，★ L/E-pcDNA-INS組，P<0.05；B，C：1～4.NC組，L/E-pcDNA3.1(+)組，pcDNA-INS組，L/E-pcDNA-INS組；下同A：compared with L/E-pcDNA3.1(+)group，☆ NC group，P<0.05，★ L/E-pcDNA-INS group，P<0.05；B，C：1-4.NC group，L/E-pcDNA3.1(+)group，pcDNA-INS group，L/E-pcDNA-INS group；the same below

2.6 各組小鼠的形體變化及病理檢查結(jié)果

治療4周后，L/E-pcDNA-INS組毛色雖有一定暗淡、粗糙現(xiàn)象出現(xiàn)，但脫毛現(xiàn)象較輕，且其整體形態(tài)與正常小鼠較為接近(圖6：A1)。L/E-pcDNA3.1(+)組和pcDNA-INS組則有明顯的脫毛現(xiàn)象，且毛色更加粗糙，整體形態(tài)更小，肌肉有不同程度的萎縮，且皮膚血管較為明顯(圖6：A2～A4)。此外，HE染色結(jié)果顯示，L/E-pcDNA3.1(+)組和pcDNA-INS組小鼠各部位有不同程度的病變，如脾臟組織出現(xiàn)中心淋巴細(xì)胞減少且細(xì)胞變性壞死現(xiàn)象，肺組織有肺炎及肺泡萎陷現(xiàn)象、肌肉組織發(fā)生變性壞死等，而L/E-pcDNA-INS組的組織病變情況明顯較輕，其組織炎癥較少，且肌肉組織沒(méi)有明顯壞死，更接近NC組的情況(圖6：B)。

圖6 各組小鼠治療后的形體特征(A)及HE染色結(jié)果(B)Fig.6 Appearances (A)and HE staining results (B)of mice after treatment

3 討論

隨著社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和進(jìn)步，人們的生活方式和飲食習(xí)慣發(fā)生了較大變化，導(dǎo)致全球糖尿病患者逐漸增加，預(yù)計(jì)到2030年，全球糖尿病人數(shù)約達(dá)到5.22億(Navarro-Gonzalez &Mara-Fernandez，2008；Whitingetal.，2011)。1型糖尿病患者需要每日注射胰島素維持體內(nèi)血糖的正常水平，這給患者帶來(lái)許多痛苦和風(fēng)險(xiǎn)。基因治療能為1型糖尿病患者帶來(lái)長(zhǎng)期治療效果的福音。目前裸質(zhì)粒治療雖然安全性較高，但是其體內(nèi)傳遞效率較低，因此需要將含有胰島素基因的外源質(zhì)粒有效導(dǎo)入糖尿病生物體內(nèi)，才能產(chǎn)生良好的治療效果。骨骼肌是重要的糖代謝組織之一，對(duì)維持體內(nèi)血糖平衡起著重要作用，且在全身的分布范圍較廣，比肝臟、胰腺、腎臟等有著更強(qiáng)的操作性和更高的容錯(cuò)率。因此，骨骼肌是人們理想中外源胰島素基因傳遞的靶場(chǎng)所之一。在自然條件下，胰島素基因轉(zhuǎn)錄翻譯出的C肽對(duì)胰島素的折疊和構(gòu)象起著至關(guān)重要的作用，但其結(jié)構(gòu)冗長(zhǎng)且剛性較大，影響胰島素活性的發(fā)揮(Abaietal.，1999；Huaetal.，2008)。因此，胰島素原需要在胰島β細(xì)胞中經(jīng)過(guò)特定的酶切掉C肽后形成成熟胰島素，進(jìn)而發(fā)揮生理作用。這意味著當(dāng)外源胰島素基因試圖在非β細(xì)胞(如肝臟和肌肉組織)中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，很難得到高活性的成熟胰島素(Fukazawaetal.，2006；Hanetal.，2011)。為了解決這一難題，可以使用柔性肽linker(GGGGS)3(Kuferetal.，1997)取代C肽，實(shí)現(xiàn)胰島素A、B鏈的連接及不需要酶切掉連接區(qū)域的雙重目標(biāo)。

從20世紀(jì)開(kāi)始，人們將電脈沖法應(yīng)用到與細(xì)胞膜通透性改變的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，并且取得了一定成效(Coster，1965)。在電脈沖領(lǐng)域的研究中，高、低2種電壓聯(lián)用的方法效果較佳。在這種方法中，短時(shí)高壓脈沖會(huì)促進(jìn)細(xì)胞膜通透性的提升，而相對(duì)作用時(shí)間較長(zhǎng)的低電壓則會(huì)使DNA發(fā)生電泳現(xiàn)象從而加快入胞速度(Bureauetal.，2000)，但高壓電脈沖可能會(huì)對(duì)組織造成不可修復(fù)的損傷和功能缺陷，而降低電壓則會(huì)降低基因傳遞效率(Hartikkaetal.，2001)。因此，人們?cè)诓粩嗵剿骱线m的替代方案來(lái)改變細(xì)胞膜的通透性，并且抵消高電壓的作用和傷害，普朗尼克非離子型電中性的生物材料，是一類由兩端聚氧乙烯(PEO)組成的親水鏈和中間聚氧丙烯(PPO)組成的親油鏈共同組成的兩親性三嵌段共聚物(Kabanovetal.，2002)。在普朗尼克濃度超過(guò)臨界膠束濃度時(shí)，其PPO部分可以與親油性材料或藥物結(jié)合形成內(nèi)核部分，而外部的PEO親水鏈部分則可以形成外殼。這時(shí)，普朗尼克的結(jié)構(gòu)能夠起到保護(hù)內(nèi)部材料或藥物以及提高整體溶解度的作用(Batrakova &Kabanov，2008)。因此，普朗尼克是一種生物安全性較高、生物相容性較好的生物材料，常用作藥物傳遞載體、藥物乳化劑、緩釋材料等(Alakhovetal.，2001)。

本實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作已經(jīng)構(gòu)建了一套以L64-電脈沖體系介導(dǎo)的骨骼肌基因傳遞系統(tǒng)。Liu等(2014)在其研究工作中指出L64的加入可以使電脈沖作用下的裸質(zhì)粒傳遞效率得到顯著提升。He等(2019)將L64-電脈沖體系分別與聚乙烯亞胺(PEI)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)等生物材料聯(lián)用，使得裸質(zhì)粒體內(nèi)基因傳遞的效率得到進(jìn)一步提升。Chen等(2015)以細(xì)胞系為模型研究了不同濃度L64及L64加入的先后順序?qū)騻鬟f效率的影響機(jī)制，并且發(fā)現(xiàn)L64主要是具有與細(xì)胞膜相似的結(jié)構(gòu)從而擾動(dòng)細(xì)胞膜，提高細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)外源基因的入胞。本實(shí)驗(yàn)室由L64獨(dú)特結(jié)構(gòu)對(duì)生物膜的影響聯(lián)想到了從仿生學(xué)角度構(gòu)建新型三嵌段分子——類磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)和反磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，并且研究了2種共聚物的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，以及其對(duì)骨骼肌細(xì)胞基因傳遞效率的影響和機(jī)制(Puetal.，2014)。在外源質(zhì)粒注射小鼠肌肉組織后，Pluronic L64-電脈沖系統(tǒng)能有效提高外源胰島素基因的有效表達(dá)。因此，在成功建立了1型糖尿病小鼠模型后，使用Pluronic L64-電脈沖體系和pcDNA-INS進(jìn)行聯(lián)合治療，糖尿病小鼠血糖得到了有效控制并且其他相關(guān)病癥和指標(biāo)得到了最大的緩解。此外，免疫組化結(jié)果顯示，治療4周后，3組糖尿病小鼠的胰腺組織依然受損嚴(yán)重，且胰島素表達(dá)量較少，而L/E-pcDNA-INS組的肌肉組織含量相對(duì)較高，這說(shuō)明L/E-pcDNA-INS組病癥的緩解并不是由于其被破壞β細(xì)胞的重生引起，而確實(shí)為外源基因治療效果。HE染色結(jié)果表明，長(zhǎng)期高血糖對(duì)機(jī)體的傷害很嚴(yán)重，經(jīng)過(guò)治療后的小鼠相對(duì)癥狀較輕，尤其以L/E-pcDNA-INS治療方案為代表，在極大程度上緩解了1型糖尿病小鼠的病癥，并且與正常小鼠相比，Pluronic L64-電脈沖體系和pcDNA-INS聯(lián)合治療對(duì)小鼠的機(jī)體沒(méi)有明顯毒副作用，是一種較為安全、可靠的、具有潛力的治療方法。

綜上所述，本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期工作提供了一套安全、高效的以裸質(zhì)粒和Pluronic L64-電脈沖體系為基礎(chǔ)的1型糖尿病骨骼肌基因治療系統(tǒng)，為實(shí)現(xiàn)胰島素的長(zhǎng)期、有效分泌提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。