偽狂犬病毒的gE蛋白胞外區(qū)真核表達(dá)以及單克隆抗體制備

郎巧利 吳夢(mèng) 黃楠 何琦琳 葛良鵬 楊希

（重慶市畜牧科學(xué)院生物工程研究所，重慶 402460）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是的一種由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起的，能引發(fā)多種動(dòng)物奇癢、發(fā)熱、腦脊髓炎的急性傳染病，又稱(chēng)Aujeszky病。其主要感染豬，仔豬感染后表現(xiàn)為嚴(yán)重的中樞神經(jīng)癥狀，引發(fā)急性死亡，死亡率可達(dá)100%。成年豬感染后可長(zhǎng)期潛伏帶毒，引發(fā)種豬不育、妊娠母豬繁殖障礙等癥狀，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。

PRV是豬皰疹病毒I型病毒，屬于皰疹病毒科和α-皰疹病毒亞科，是雙鏈線狀DNA病毒。其中，gE是PRV重要的毒力基因，全長(zhǎng)1.7 kb，位于病毒基因組US區(qū)，編碼的蛋白屬于I型跨膜糖蛋白［3］，在介導(dǎo)細(xì)胞之間病毒的擴(kuò)散、細(xì)胞的感染融合、病毒粒子的釋放以及病毒侵襲神經(jīng)系統(tǒng)等方面均起著重要作用［4-5］。近年來(lái)，PRV已在很多國(guó)家養(yǎng)豬業(yè)中得到凈化，中國(guó)也頒布了相關(guān)的凈化計(jì)劃。gEELISA診斷技術(shù)和gE基因缺失疫苗作為目前偽狂犬病防控的主要手段，是偽狂犬病能否凈化的關(guān)鍵［6］。

目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道中［7-14］，PRV gE蛋白的表達(dá)方式主要有原核表達(dá)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)和酵母細(xì)胞表達(dá)3種。然而，原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是包涵體蛋白不易純化、蛋白修飾不完整、表達(dá)的蛋白生物活性低。昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是效率比較低，載體構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所能表達(dá)的外源蛋白基本為非分泌蛋白，不能表達(dá)帶有完整N聯(lián)聚糖的真核糖蛋白。而酵母表達(dá)系統(tǒng)存在克隆基因的表達(dá)量低，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，不正確的蛋白糖基化及抗細(xì)胞分裂，培養(yǎng)上清多糖濃度高不利于純化等缺點(diǎn)。與上述3種表達(dá)系統(tǒng)相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖然成本偏高，但表達(dá)的蛋白基本是可溶性蛋白，便于純化和產(chǎn)業(yè)化，且其翻譯后再加工修飾產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)，就活性而言，遠(yuǎn)勝于原核、昆蟲(chóng)細(xì)胞及酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，最接近于天然蛋白質(zhì)。

為了表達(dá)PRV gE蛋白，本研究設(shè)計(jì)了2種重組表達(dá)方式［gE-6×His和 gE-mouse Fc（gE-mFc）］，將其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)HEK293F細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，比較其表達(dá)情況，以期獲得表達(dá)量高純度好的分泌性gE蛋白。用PRV滅活全病毒免疫小鼠，利用獲得的gE蛋白通過(guò)間接ELISA篩選和IFA鑒定出9株穩(wěn)定性和特異性好的分泌陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，以期為PRV診斷試劑的開(kāi)發(fā)奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、病毒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 pcDNA3.4載體購(gòu)自invitrogen；pcDNA3.4-mFc2載體由重慶市畜牧科學(xué)院生物工程所保存；偽狂犬病全病毒株和gE缺失株由成都安迪斯生物技術(shù)有限責(zé)任公司贈(zèng)予；SP2/0細(xì)胞和PK-15細(xì)胞均保存于重慶市畜牧科學(xué)院生物工程所；HEK293F瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)試劑盒購(gòu)自北京諾進(jìn)生物技術(shù)有限公司；6-8周齡Balb/C小鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自全式金公司；胰蛋白胨（Tryptone）和酵母提取物（Yeast extract）購(gòu)自 OXOID；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、TaqDNA聚合酶、DNA限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；Ni-NTA純化柱和Protein G純化柱均購(gòu)自GE公司；陰離子純化柱購(gòu)自博格?。ㄉ虾＃┥锛夹g(shù)有限公司；蛋白濃縮管購(gòu)自eppendorf公司；弗氏佐劑購(gòu)自sigma公司；ClonaCellTM-HY培養(yǎng)基D購(gòu)自STEMCELL公司；1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；HT培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；電融合液購(gòu)自BTX公司；鼠抗his單克隆抗體購(gòu)自santa cruz公司；抗鼠IgG（H+L）的熒光二抗購(gòu)自invitrogen；羊抗鼠IgG-Fab HRP抗體購(gòu)自sigma公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 gE-6×His重組蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)NCBI發(fā) 表 的PRV gE基 因 序 列（GenBank：KX266909.1），對(duì)gE蛋白信號(hào)肽在http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)址在線預(yù)測(cè)，對(duì)gE蛋白跨膜區(qū)在http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網(wǎng)址在線預(yù)測(cè)。找出gE蛋白信號(hào)肽、胞外區(qū)序列并在N端加上Kozak sequence和HindIII酶切位點(diǎn)，C端加上His標(biāo)簽和EcoRI酶切位點(diǎn)進(jìn)行合成，構(gòu)建入pcDNA3.4真核表達(dá)載體中。質(zhì)粒測(cè)序正確后，命名為 pcDNA3.4-gE-6×His。

1.2.2 gE-mFc重組蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建 從pcDNA3.4-gE-6×His載體中擴(kuò)增目的片段，并在兩端加入HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)，（擴(kuò)增上游引物：5'-aagcttGCCACCATGCG-3'；擴(kuò)增下游引物：5'-TGAAGTAATAAGaattc-3'）將目的片段構(gòu)建入實(shí)驗(yàn)室已有的含小鼠IgG2-Fc基因片段（705 bp）的pCDNA3.4-mFc真核表達(dá)載體中。質(zhì)粒測(cè)序正確后，命名為pCDNA3.4-gE-mFc。

1.2.3 重組gE蛋白的表達(dá)、純化和鑒定 將已鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃，200r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，收取菌液進(jìn)行質(zhì)粒無(wú)內(nèi)毒素提取，將大提的質(zhì)粒用0.45 μm濾膜過(guò)濾后備用。準(zhǔn)備HEK293F細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293F細(xì)胞按0.8×106cells/mL密度進(jìn)行傳代至200 mL培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染時(shí)，準(zhǔn)備2個(gè)無(wú)菌EP管各加入2 mL HEK293F基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入200 μg質(zhì)粒DNA和600 μL 轉(zhuǎn)染試劑，混勻室溫孵育5 min。將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液快速加入DNA稀釋液中，室溫孵育15-20 min。將 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑混合液快速加入細(xì)胞懸液，分別在轉(zhuǎn)染 48 h、96 h、144 h 后加入HEK293F補(bǔ)料培養(yǎng)基10 mL，待細(xì)胞活率降至60%左右時(shí)，離心收取細(xì)胞上清液，進(jìn)行Western blot鑒定其表達(dá)情況。表達(dá)的gE-6×His蛋白用Ni-NTA柱和陰離子交換柱純化，gE-mFc蛋白用Protien G柱純化，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定純化情況。

1.2.4 小鼠免疫 將PRV全病毒用5×PEG8000-NaCl進(jìn)行純化濃縮，并溶于PBS中，用Nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得病毒濃度。向病毒溶液中加入0.1%-0.2%的甲醛37℃滅活過(guò)夜，取終濃度為2 mg/mL的滅活PRV全病毒，以1∶1（V/V）加入弗氏佐劑，接種6-8周齡Balb/C小鼠，每間隔2周免疫一次。首次免疫，加弗氏完全佐劑，皮下多點(diǎn)注射，200 μL/只；再次免疫，加弗氏不完全佐劑，腹腔注射，200 μL/只。三免一周后采微量尾血包被PRV滅活全病毒進(jìn)行ELISA測(cè)定，抗體效價(jià)達(dá)到1∶10000以上的小鼠，雜交瘤融合前3 d，取200 μg抗原不加佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.2.5 單克隆抗體的制備 取SP2/0細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞按1∶5混合，加入電融合液進(jìn)行電融合，融合后細(xì)胞用ClonaCellTM-HY半固體培養(yǎng)基D培養(yǎng)，10-14 d后挑取單克隆至HT培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3 d后觀察培養(yǎng)基顏色變黃以后，取細(xì)胞上清，以gE-mFc表達(dá)蛋白為檢測(cè)抗原包被ELISA板，以羊抗鼠IgG-Fab HRP抗體為二抗進(jìn)行間接ELISA，篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆株。將陽(yáng)性克隆全部?jī)龃?，并進(jìn)行有限稀釋?zhuān)瞄g接ELISA檢測(cè)，直至單克隆全陽(yáng)性為止，擴(kuò)大培養(yǎng)高陽(yáng)性的單克隆，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定單克隆抗體 將PK-15細(xì)胞傳代至24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，分別接種PRV全病毒株和PRV gE缺失株，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。24 h后待細(xì)胞出現(xiàn)輕微病變，用-20℃預(yù)冷的甲醇室溫固定10 min，PBS洗3遍，5%BSA 37℃封閉1 h，加入待檢的雜交瘤培養(yǎng)上清，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3遍，避光加入1∶1000稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1 h，PBS洗3遍，在熒光顯微鏡下觀察熒光。

2 結(jié)果

2.1 gE蛋白序列生物信息學(xué)分析

通過(guò) http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網(wǎng)站對(duì)gE蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，可知gE蛋白1-430位氨基酸位于細(xì)胞膜外（胞外區(qū)）、431-453位氨基酸位于跨膜區(qū)、454-578位氨基酸位于胞質(zhì)內(nèi)（胞內(nèi)區(qū)），其中胞外區(qū)的1-430位氨基酸是gE蛋白的主要抗原區(qū)域，結(jié)果如圖1。通過(guò)http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP網(wǎng)站對(duì)gE蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)，可知1-20位氨基酸是gE蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果如圖2。因此，本研究擬表達(dá)gE蛋白胞外區(qū)的1-430位氨基酸。 通 過(guò) https：//www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GLYCOSITE/glycosite.html網(wǎng)站預(yù)測(cè)gE蛋白胞外區(qū)N-糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其共有5個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，結(jié)果如圖3。通過(guò)http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/網(wǎng)站預(yù)測(cè)gE蛋白胞外區(qū)O-糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其分別第25、27、30、31、36、40、42、305、393、410、411、425位氨基酸共有12個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)。

2.2 表達(dá)載體的鑒定

如圖4所示，用HindIII和EcoRI對(duì)測(cè)序正確的pcDNA3.4-gE-6×His質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果得到大小與預(yù)期的1335 bp和5987 bp一致的兩條帶。如圖5所示，用HindIII和PvuI對(duì)測(cè)序正確的pcDNA3.4-gE-mFc質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到大小與預(yù)期的1480 bp和6529 bp一致的兩條帶。

圖1 gE蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖2 gE蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

圖3 gE蛋白胞外區(qū)N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖4 pcDNA3.4-gE-6×His質(zhì)粒酶切鑒定

圖5 pcDNA3.4-gE-mFc質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 gE-6×His蛋白表達(dá)、純化和鑒定

取pcDNA3.4-gE-6×His轉(zhuǎn)染的HEK293F細(xì)胞上清，用濃縮管濃縮10倍，將原液和濃縮液以30 μL體積上樣SDS-PAGE 電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗滌后，用1∶1000稀釋的鼠抗His單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，再用1∶10000稀 釋 Alexa FluorTM680 donkey anti-mouse IgG（H+L）室溫孵育1 h后顯色，結(jié)果如圖6。由結(jié)果可知，與原液比較，濃縮后樣品能夠在100 kD和70 kD成功檢測(cè)到目的蛋白。說(shuō)明gE-6×His蛋白成功表達(dá)，但表達(dá)量很低，表達(dá)的目的蛋白分子量和預(yù)期的（45 kD）比較偏大，可能是糖基化修飾所致。

將轉(zhuǎn)染pcDNA3.4-gE-6×His質(zhì)粒的細(xì)胞上清先后用Ni-NTA柱和陰離子交換柱進(jìn)行純化，純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如圖7，發(fā)現(xiàn)gE-6×His蛋白進(jìn)行2次純化后，其純度仍然不高，且蛋白穩(wěn)定性太差，蛋白在濃縮和純化的過(guò)程出現(xiàn)沉淀和降解，分析可能是蛋白的結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，聚集性太強(qiáng)。

圖6 gE-6×His蛋白表達(dá)Westernblot鑒定圖

2.4 gE-mFc蛋白表達(dá)、純化和鑒定

為解決gE-6×His蛋白遇到的表達(dá)量低，蛋白穩(wěn)定性太差，且不能純化到純度較高的蛋白的問(wèn)題。本研究重新設(shè)計(jì)了pcDNA3.4-gE-mFc質(zhì)粒，表達(dá)得到gE-mFc蛋白。取pcDNA3.4-gE-mFc轉(zhuǎn)染的HEK293F細(xì)胞上清，以30 μL體積上樣SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h，洗滌后，用1∶10000稀釋Alexa FluorTM680 donkey anti-mouse IgG（H+L）室溫孵育1 h后顯色，結(jié)果如圖8。由結(jié)果可知，樣品能夠在100 kD到190 kD之間成功檢測(cè)到目的蛋白。說(shuō)明gE-mFc蛋白成功表達(dá)，且表達(dá)量較gE-6×His有明顯提高，但由于糖基化修飾，表達(dá)的目的蛋白分子量較預(yù)期（70 kD）偏大。

圖7 gE-6×His蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

圖8 gE-mFc蛋白表達(dá)Westernblot鑒定圖

將轉(zhuǎn)染pcDNA3.4-gE-mFc質(zhì)粒的細(xì)胞上清用Protein G柱進(jìn)行純化，純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如圖9，發(fā)現(xiàn)gE-mFc蛋白進(jìn)行純化后，其純度較gE-6×His蛋白有明顯提高，且蛋白穩(wěn)定性好，不會(huì)出現(xiàn)蛋白沉淀和降解的情況。

2.5 雜交瘤細(xì)胞株的獲得

為了快速獲得gE單克隆抗體，本研究選擇在蛋白表達(dá)初期利用PRV滅活全病毒免疫小鼠，細(xì)胞融合后，再利用表達(dá)的gE-mFc蛋白進(jìn)行篩選。經(jīng)細(xì)胞融合和ELISA 初步篩選，得到20株陽(yáng)性克隆，又進(jìn)行2次單克隆，直至所有克隆孔的陽(yáng)性反應(yīng)率達(dá)100%，最后獲得9株穩(wěn)定分泌的能和gE-mFc表達(dá)蛋白發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞株（圖10）。

圖9 gE-mFc蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

圖10 ELISA篩選特異性gE-mFc單克隆抗體

2.6 IFA鑒定gE單克隆抗體特異性

IFA檢測(cè)gE單克隆抗體與PRV全病毒株和PRV gE缺失株特異性結(jié)合反應(yīng)。結(jié)果顯示（圖11），9株gE單克隆抗體4A、2E、4C、8E、8E-10F、8F、6C、10F和8D均能與PRV全病毒株反應(yīng)，而不能與PRV gE缺失株以及對(duì)照的PK-15細(xì)胞反應(yīng)，證明9株單克隆抗體能特異性結(jié)合PRV的gE蛋白。

圖11 IFA鑒定gE蛋白單克隆抗體特異性

3 討論

PRV gE蛋白由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)構(gòu)成，研究已發(fā)現(xiàn)了6個(gè)抗原表位，其中5個(gè)抗原位于N端52-238位氨基酸［15］。由于gE蛋白是一種非必需的囊膜糖蛋白，PRV缺失gE基因后不會(huì)影響其復(fù)制和免疫原性，但毒力卻大大減弱，目前gE基因缺失疫苗廣泛使用于全國(guó)各大豬場(chǎng)，gE蛋白成為了區(qū)分PRV疫苗株和野毒株的重要標(biāo)志性蛋白。因此，可溶性gE蛋白和gE特異性單克隆抗體在PRV的防治和凈化過(guò)程中起著重要的作用。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)的手段預(yù)測(cè)了gE蛋白的信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和糖基化位點(diǎn)。根據(jù)在線程序signalP4.1預(yù)測(cè)其信號(hào)肽位于1-20位氨基酸。根據(jù)TMHMM2.0預(yù)測(cè)其21-430位氨基酸位于細(xì)胞膜外（胞外區(qū)）、431-453位氨基酸位于跨膜區(qū)、454-578位氨基酸位于胞質(zhì)內(nèi)（胞內(nèi)區(qū)）。

根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.4-gE-6×His和pcDNA3.4-gE-mFc兩種表達(dá)載體，將gE胞外區(qū)域（21-430 aa）分別與6×His和mFc融合表達(dá)。結(jié)果顯示gE-6×His能夠在HEK293F細(xì)胞中表達(dá)，且有糖基化修飾。但其表達(dá)量很低，蛋白穩(wěn)定性差，容易出現(xiàn)沉淀。利用Ni-NTA柱和陰離子交換柱進(jìn)行純化后，純度仍很低，這可能是蛋白折疊過(guò)程中His被包裹在內(nèi)，暴露太差的原因。而將標(biāo)簽換成mFc后，蛋白表達(dá)量大大增加，蛋白穩(wěn)定性也較好，利用Protein G柱一次純化后即獲得純度高達(dá)85%的蛋白。

同時(shí)本研究選用了mouse Fc和gE蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，在后期利用其免疫小鼠，可以產(chǎn)生更多gE抗體，而盡可能減少Fc抗體的產(chǎn)生。IgG-Fc融合蛋白是將生物活性蛋白與IgG的鉸鏈區(qū)和 Fc片段（CH2、CH3 功能區(qū)）進(jìn)行基因重組而表達(dá)的融合蛋白，早已廣泛應(yīng)用于人蛋白的表達(dá)［16］。加入的Fc片段能顯著提高融合蛋白的半衰期和穩(wěn)定性［17］，并且能提高融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)量，有利于融合蛋白的純化與檢測(cè)［18-19］。本研究將鼠IgG2-Fc片段與gE蛋白胞外區(qū)進(jìn)行融合表達(dá)，產(chǎn)生的gE-mFc蛋白不僅穩(wěn)定性好，且便于純化與檢測(cè)，能更好地應(yīng)用于PRV診斷試劑的開(kāi)發(fā)，同時(shí)也為今后制備更多的鼠單克隆抗體提供了好的思路。

無(wú) 論 是 gE-6×His還 是gE-mFc蛋 白， 在HEK293F懸浮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)后，獲得的蛋白均略大于理論值。通過(guò)生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)gE蛋白胞外區(qū)包含5個(gè)潛在的N-糖基化修飾位點(diǎn)和12個(gè)潛在的O-糖基化修飾位點(diǎn)。這也與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致。周金龍等［11］通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、敖敬群等［13］通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的gE蛋白均出現(xiàn)蛋白大小大于理論值的情況。本研究中使用的HEK293F表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，較昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)有更復(fù)雜的翻譯后修飾加工體系，因此，兩次表達(dá)的gE-6×His蛋白和gE-mFc蛋白都得到比目的蛋白大的兩條帶，可能是HEK293F表達(dá)后對(duì)其進(jìn)行翻譯后修飾加工如糖基化修飾所致。

近年來(lái)，已有很多關(guān)于PRV gE單克隆抗體的制備相關(guān)的文章［20-22］，市面上也有很多PRV gEELISA試劑盒，但其抗原大多是通過(guò)原核表達(dá)的gE蛋白，篩選出來(lái)的抗體與天然病毒結(jié)合能力不強(qiáng)。本研究通過(guò)哺乳細(xì)胞表達(dá)的gE-mFc蛋白具有穩(wěn)定性好、半衰期長(zhǎng)、便于純化和鑒定及蛋白活性更接近天然蛋白等優(yōu)點(diǎn)。且其mouse Fc標(biāo)簽是鼠的抗體Fc段，不會(huì)在小鼠免疫時(shí)產(chǎn)生免疫原性。但為了快速獲得gE單克隆抗體，本研究選擇在蛋白表達(dá)初期利用PRV滅活全病毒免疫小鼠，用哺乳細(xì)胞表達(dá)的gE-mFc蛋白進(jìn)行ELISA篩選，獲得的抗體也能更好地與天然病毒結(jié)合，通過(guò)IFA進(jìn)一步鑒定其特異性，獲得了9株單克隆抗體都能特異性與gE蛋白結(jié)合，為今后建立特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和結(jié)合能力高的PRV診斷試劑提供了條件。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.4-gE-6×His和 pcDNA3.4-gE-mFc， 并 在 HEK293F細(xì) 胞中表達(dá)得到gE-6×His和gE-mFc可溶性蛋白。利用gE-mFc蛋白成功篩選到9株能特異性與gE蛋白結(jié)合的單克隆抗體，為今后PRV診斷試劑的開(kāi)發(fā)奠定了良好的理論基礎(chǔ)。