應用CRISPR技術敲除MDA-MB-231細胞系的NODAL基因的研究

李念峰 方天星 倪玉芳 曾凡才

（西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學實驗室，瀘州 646000）

NODAL 是 TGF-β（Transforming growth factor-β）超家族成員之一，最初發(fā)現NODAL作為一個重要的形態(tài)發(fā)生素分子，主要在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用［1］。隨著生物個體的生長發(fā)育，NODAL基因表達逐漸關閉，成年后僅發(fā)現在胎盤、子宮內膜和發(fā)育期乳腺等少數幾種生殖相關的正常組織中表達。后有研究發(fā)現NODAL在黑色素瘤細胞中重新表達，又陸續(xù)發(fā)現它在乳腺癌、膠質瘤、前列腺癌、胰腺癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌和肝癌等腫瘤細胞中高表達，且可能與這些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關［2-5］。綜合文獻分析和我們的研究經驗發(fā)現，研究NODAL分子的功能具有一定的復雜性［3-6］。首先，在核酸和蛋白表達水平上準確檢測NODAL表達存在一定的難度。最初發(fā)現NODAL存在促腫瘤作用的美國西北大學Hendrix MJ 實驗室根據他們多年的研究經驗提出在mRNA水平不易檢測到NODAL基因的表達，分析多個實驗室在核酸和蛋白水平檢測NODAL表達的結果并不一致［7］。我們在研究過程中也面臨同樣的困惑。其次，TGF-β超家族不僅成員眾多，而且這些細胞因子與受體存在一個配體可與多個受體結合，一個受體又可接受多個配體信號的特點［8］。TGF-β超家族至少有35個成員，它們屬于細胞因子。傳遞這些細胞因子信號到胞內的受體屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，根據結構和功能不同分為Ⅱ型受體和I型受體，哺乳動物有5種II型受體和7種I型受體［9］。例如，研究發(fā)現NODAL分子至少可通過ALK4或ALK7兩個I型受體傳遞信號，而ALK4和ALK7受體則還可接受包括NODAL分子在內的其它多種 TGF-β 超家族成員的信息［4，8，10-11］。最后，不同研究結果之間相互矛盾。多數研究認為NODAL基因具有促腫瘤作用，但有部分研究認為NODAL分子有抑制腫瘤的作用［12］。

研究基因功能的常用技術是基因敲除（Gene knock-out）或基因敲低（Gene knock-down）。已報道的文獻均采用的基因敲低NODAL表達后觀察對腫瘤細胞功能的影響。由于基因敲低技術一般不容易將基因表達完全抑制，另一方面這種抑制作用對基因表達的影響也是暫時。鑒于NODAL基因研究的復雜性，本研究擬通過基因敲除以及恢復該基因表達以進一步研究NODAL基因在腫瘤細胞中的功能。并且還可通過敲除NODAL基因驗證NODAL抗體的特異性。

乳腺癌在中國女性中發(fā)病率最高，死亡率位居所有癌癥的第6位［13］。其中三陰性乳腺癌的預后最差，因此本研究選取三陰性乳腺癌細胞株MDAMB-231作為基因敲除的靶細胞，采用CRISPR/Cas9技術敲除該細胞內NODAL基因，為進一步揭示NODAL基因在乳腺癌細胞中的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 MDA-MB-231細胞株、UCATMCRISPR/Cas9快速構建及活性檢測試劑盒、AIOTMgene KO Cell Line Kit（ProuR）、CRISPR 質 粒 均 購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司。嘌呤霉素（Puromycin）購自北京索萊寶科技有限公司。質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自廣州Omega飛揚生物工程有限公司。限制性核酸內切酶、T4連接酶購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，細胞培養(yǎng)相關試劑購自美國Thermo公司。

1.1.2 主要實驗儀器 細胞培養(yǎng)箱、PCR儀、凝膠成像儀、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡、生物安全工作臺。

1.2 方法

1.2.1 敲除方案及Cas9/sgRNA質粒構建 利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 查 找NODAL基因信息，分析NODAL基因生物學特征，根據NODAL基因CDS區(qū)結構及性質，確定敲除位點，制定敲除NODAL基因第二外顯子的敲除方案（圖1）。以MDA-MB-231細胞系cDNA為模板，設計引物并用PCR擴增靶位點序列，測序確認靶序列與GenBank中的NODAL基因參考序列一致，并利用此序列信息設計sgRNA，以確保Cas9/sgRNA的效率。

利用CRISPR在線設計工具（http：//CRISPR.mit.edu/），在NODAL基因第二外顯子位置5'端設計了7條sgRNA序列，即sgRNA1-7，3'端設計了4條sgRNA序列，即sgRNA8-11（表1），由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成sgRNA oligo及其互補鏈。

圖1 敲除方案示意圖

表1 sgRNA oligo設計

sgRNA oligo經變性-退火之后形成sgRNA oligo雙鏈，利用UCATMCRISPR/Cas9快速構建及活性檢測試劑盒連入BbsI核酸內切酶處理后的PCS質粒載體中，通過測序驗證，確定構建成功后，分別命名為PCS-sgRNA1-PCS-sgRNA11。利用UCATMCRISPR/Cas9快速構建及活性檢測試劑盒檢測PCS-sgRNA活性，經數據分析，在5'端和3'端選擇最佳PCS-sgRNA質粒用于下一步實驗。

1.2.2 打靶載體構建 基于同源重組修復機制敲除目標基因的原理，打靶載體由位于靶位點上游的左同源臂（L-arm，LR）和下游的右同源臂（R-arm，

RR）以及兩者之間的嘌呤霉素抗性基因PuroR構成。因此，分別在NODAL基因第二外顯子上游和下游設計引物克隆同源臂，設計克隆左同源臂的PCR引 物 F：5'-CGATGGTACCGAAGCTTCTGGGTGCA TGTGATTGC-3'，下劃線處為KpnⅠ酶切位點，R：5'-CGATGTCGACAGAGGTTGGAGTAGAGCATAAGG AGC-3'，下劃線處為SalⅠ酶切位點，擴增產物片段大小為1285 bp；右同源臂PCR引物F：5'-CGATA CGCGTTTGGAATCACACTGTTCCAGCCACAG-3'，下劃線處為MluⅠ酶切位點，R：5'-CGATGCGGCCGC CTACCTTTAGCTCTGTGCTTGTTTTGTG-3'，下劃線處為NotⅠ酶切位點，擴增產物片段大小為1491 bp。上述4條引物中5' CGAT均為添加的酶切保護堿基。采用相應引物PCR擴增，經凝膠電泳鑒定后膠回收，利用AIOTMgene KO Cell Line Kit試劑盒將LR、RR、PuroR經一步克隆一起連入LScKO-4G質粒中，構建LScKO-LR-RR質粒。再利用HindⅢ+SalⅠ、XhoⅠ+BamHⅠ、EcoRⅠ+NotⅠ等限制性核酸內切酶組合酶切鑒定打靶載體，最終通過測序確認是否構建成功。

1.2.3 電轉及篩選 以1350 V電壓將作用于5'端和3'端的PCS-sgRNA質粒以及打靶載體質粒按質量比1∶1∶1轉染入MDA-MB-231細胞中。無CO2條件下培養(yǎng)至細胞達到80%及以上融合度時，加入2μg/mL嘌呤霉素進行藥物篩選，直至無大量細胞死亡時，取部分細胞提取基因組DNA，然后進行混合基因型PCR鑒定。

1.2.4 混合基因型PCR鑒定及單細胞克隆挑選 如果電轉后在靶位點發(fā)生了同源重組，打靶載體提供的外源PuroR基因DNA會與靶位點DNA整合。因此，可在左同源臂上設計一條引物HR-F：5'-TGGTTGTCTTGGGTGTGTGGAACAG-3'，在PuroR外源基因靠近左同源臂端設計一條引物HR-P-F：5'-CTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAG-3'，擴增產物片段大小為1782 bp。同理，在右同源臂上設計一條引物HR-R：5'-CAGAGGCCACTTGTGTAGCG-3'，在PuroR外源基因靠近右同源臂端設計一條引物HRP-R：5'-CAATTCACATCCTAGATGGGCAGGTC-3'，擴增產物片段大小為1780 bp（圖2）。取部分經電轉且嘌呤霉素篩選后存活的細胞，提取基因組DNA作為模板，如果這兩對引物能夠擴增出預期大小的條帶，說明電轉后有細胞發(fā)生了同源重組，可進行單細胞克隆挑選。

圖2 等位基因同源重組PCR基因型鑒定引物位置示意圖

1.2.5 單細胞克隆基因型鑒定

1.2.5.1 等位基因同源重組PCR鑒定 等位基因同源重組PCR鑒定同步驟1.2.4，差別僅在于此處是鑒定單細胞克隆的基因型（圖2）。

1.2.5.2 等位基因移碼突變PCR鑒定 本研究共設計兩個Cas9/sgRNA酶切作用位點，在靠近左同源臂的作用位點兩端設計一對引物FS-F：5'-GCTGCTTAGAGCGGTTTCAGATGGA-3'和FS-R：5'-GTCGGATGAAACTCCTCCCCAACAG-3'，野生型基因擴增產物片段大小為493 bp，如果發(fā)生了移碼突變，擴增產物片段大小非常相似，只能通過測序判斷基因型（圖3）。

圖3 等位基因移碼突變PCR鑒定引物位置示意圖

1.2.5.3 等位基因大片段缺失PCR鑒定 在設計的兩個Cas9/sgRNA酶切作用位點的兩端，設計一對引物，Del-F：5'-TTGTCCCAGGTCACCTTTTCCTTGG-3'和 Del-R：5'-TTCTTCCTCCACCACCTCCTAGACC-3'，野生型基因擴增產物片段大小為1462 bp，發(fā)生同源重組的基因擴增產物大小為3151 bp，如果是發(fā)生了大片段缺失的片段大小約為620 bp（圖4）。最終通過測序確定單細胞克隆是否發(fā)生等位基因大片段缺失。

圖4 等位基因大片段缺失PCR鑒定引物位置示意圖

1.2.6 NODAL蛋白水平鑒定 將基因型鑒定為陽性的單細胞克隆擴大培養(yǎng)，提取細胞總蛋白，經SDSPAGE電泳并轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別用NODAL一抗（Abcam，Cat# ab55676，1∶1000）和 β-actin一抗（1∶10000）4℃孵育過夜，1×TBST清洗后，用山羊抗鼠（1∶5000）、山羊抗兔（1∶5000）二抗溶液中室溫孵育1 h，1×TBST再次清洗后，用化學發(fā)光儀檢測NODAL蛋白表達情況。

1.2.7 統(tǒng)計分析 Cas9/sgRNA質粒的活性檢測，利用SPSS 19.0軟件將五次重復所得到的數據通過方差檢驗計算每組的平均值±標準誤差，并以Con組為1作為標準，計算各組相對sgRNA活性。

2 結果

2.1 Cas9/sgRNA質粒構建及活性鑒定

基于sgRNA的設計原則，5'端設計了7條sgRNA，3'端設計了4條sgRNA，分別與CRISPR載體質粒PCS連接，經測序確認成功構建11個作用于NODAL基因靶序列的 Cas9/sgRNA質粒。使用SSA reporter assay檢測sgRNA活性，各PCS-sgRNA質粒顯示出不同程度的活性。根據質?；钚圆⒔Y合sgRNA設計網站顯示這幾條sgRNA的不同特異性等因素綜合考慮，最終5'端選擇PCS-sgRNA1（圖5-A），3'端選擇PCS-sgRNA8（圖5-B）兩種Cas9/sgRNA質粒進行后續(xù)基因敲除實驗。

圖5 Cas9/sgRNA質?；钚詸z測

2.2 打靶載體構建

以MDA-MB-231乳腺癌細胞基因組DNA為模板，用設計的PCR引物分別擴增左、右同源臂，電泳結果（圖6-A）顯示片段大小與預期相符。將左、右同源臂與試劑盒中的PuroR基因一起克隆至LScKO-4G質粒中，構建LScKO-LR-RR質粒，然后使用限制性核酸內切酶酶切驗證打靶載體。根據實驗設計，如果用Hind Ⅲ+SalⅠ雙酶切打靶載體質粒，電泳后應觀察到3條帶，大小應分別為1264 bp、2727 bp和4059 bp；如果用XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切打靶載體質粒，電泳后也應觀察到3條帶，條帶大小分別為386 bp、2228 bp和5436 bp；而如果用EcoRⅠ+NotⅠ雙酶切打靶載體質粒，電泳后也應觀察到3條帶，條帶大小分別為768 bp、2754 bp和4528 bp。應用這3種組合酶酶切打靶質粒的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示片段大小與預期一致（圖6-B）。只是XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切后產生的386 bp和EcoRⅠ+NotⅠ雙酶切產生的768 bp兩條帶均由于DNA片段小，結合EB染料少，觀察到的條帶弱，在本圖中未能清晰展示（圖6-B）。最終經測序確認，打靶載體構建成功。

2.3 基因型鑒定

2.3.1 混合基因型鑒定 以電轉并經嘌呤霉素篩選后存活的部分細胞提取基因組DNA作為模板，采用鑒定基因重組的引物擴增DNA片段。根據實驗設計，如果外源的PuroR基因與NODAL基因第二外顯子靶位點發(fā)生重組，利用外源基因5'端位置附近設計的PCR引物擴增的產物大小為1782 bp，外源基因3'端位置附近設計的PCR引物擴增的產物大小為1780 bp。這兩對引物的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果與預期大小均一致（圖7），說明至少在部分細胞中PuroR基因與NODAL基因靶位點發(fā)生了同源重組，可挑取單細胞克隆進行后續(xù)實驗。

2.3.2 等位基因同源重組基因型鑒定 單細胞克隆等位基因同源重組基因型鑒定與混合基因型鑒定原理一樣，不同之處在于本鑒定是以單細胞克隆中提取的DNA作為PCR擴增的模板。PCR產物預期大小也是5'端為1782 bp，3'端為1780 bp。將挑取的15個單細胞克隆的基因組DNA作為模板，PCR產物電泳結果顯示，在15個單細胞克隆中，僅有C1單細胞克隆的5'端PCR產物條帶較弱，其余單細胞克隆條帶強，且與預期大小相符（圖8-A）；而在15個單細胞克隆的3'端PCR產物中，C1單細胞克隆未觀察到與預期大小一致的條帶，B6單細胞克隆的目標條帶較弱，其余單細胞克隆均有與較強的目標條帶（圖8-B）。最終選擇A4、B4、B6、C2、E4、F3、F4和H3共8個單細胞克隆的PCR產物進行測序，測序結果顯示這8個單細胞克隆的NODAL等位基因均發(fā)生了同源重組。

圖6 打靶載體構建

2.3.3 等位基因移碼突變基因型鑒定 通過等位基因同源重組基因型鑒定陽性的單細胞克隆，僅能證明至少有一個NODAL基因的等位基因發(fā)生了重組替換。但是癌細胞至少有2個以上的等位基因。此外，當Cas9/sgRNA復合體在靶位點剪斷DNA雙鏈后，細胞除可利用同源重組的修復機制外，還可利用非同源末端連接的修復機制修復DNA損傷，從而造成靶基因發(fā)生移碼突變，同樣可達到敲除基因的效果。因此，需進行移碼突變基因型進行鑒定。利用擴增等位基因移碼突變的引物進行PCR擴增，結果顯示：15個單細胞克隆中，除B4、C2、F4三個單細胞克隆外，其余12個單細胞克隆均擴增出大小約為490 bp的條帶（圖9-A），將其中A4、B6、E4、F3和H3五個單細胞克隆的PCR產物進行了全長測序。測序結果經比對分析，發(fā)現B6、E4、F3和H3四個單細胞克隆擴增產物是野生型片段（擴增序列與NODAL基因參考序列完全一致，比對結果未展示），說明在這4個細胞克隆中，至少還有一個野生型NODAL基因拷貝。僅有A4單細胞克隆在NODAL基因mRNA序列的642位插入了一個T堿基（圖9-B），該插入T堿基位于PCR產物正向測序峰圖的191位，且峰形完整（圖9-C），反向測序峰圖在相應位置也有完整峰形的該插入T堿基（結果未展示）。上述結果表明，A4單細胞克隆在第二外顯子區(qū)域插入非三的整倍體堿基，發(fā)生等位基因移碼突變。

圖7 混合克隆細胞基因型鑒定

圖8 等位基因同源重組PCR鑒定

圖9 等位基因移碼突變基因型鑒定

2.3.4 等位基因大片段缺失基因型鑒定 由于本研究采用雙位點剪切靶序列，還可能發(fā)生基因大片段缺失的情況。利用檢測大片段缺失的引物進行PCR擴增。結果（圖10-A）顯示，8個單細胞克隆僅E4、F3、F4和H3單細胞克隆能擴增出的大小約為620 bp的條帶，說明這4個單細胞克隆可能發(fā)生了等位基因大片段缺失。將F3約620 bp的PCR產物克隆并測序的結果進行基因組BLAST比對，結果（圖10-B）顯示在10號染色體上NODAL基因位置從編號70434736 bp到70435576 bp部分發(fā)生DNA片段缺失，大小為840 bp。同樣方法還分析了E4、F4和H3單細胞克隆的測序結果，結果與F3類似，其中E4缺失了848 bp基因組片段，F4缺失了840 bp基因組片段，H3缺失了840 bp基因組片段（基因組BLAST比對結果未展示）。

綜合分析等位基因同源重組、等位基因移碼突變和等位基因大片段缺失這3種PCR基因型鑒定及測序結果，總結為表2。結果顯示；A4，B4，C2 和F4四個單細胞克隆的NODAL基因均被敲除，B6，E4，F3和H3四個單細胞克隆的NODAL基因被部分敲除。

2.4 蛋白表達鑒定

將已進行基因型鑒定的單細胞克隆全部擴大培養(yǎng)，提取總蛋白進行了NODAL蛋白表達檢測。結果顯示在8個單細胞克隆中，檢測到B4、E4、F3三個單細胞克隆的NODAL蛋白表達水平有不同程度降低，A4、B6兩個單細胞克隆檢測不到NODAL蛋白的表達，其他3個單細胞克隆NODAL蛋白表達變化不大（圖11）。說明A4、B6在蛋白水平鑒定為敲除NODAL基因的單細胞克隆。

圖10 等位基因大片段缺失基因型鑒定

3 討論

自1993年克隆NODAL基因以來，發(fā)現該基因主要在胚胎發(fā)育過程中有重要作用［14］。至2006年Hendrix實驗室發(fā)現NODAL在黑色素瘤中有促腫瘤作用，后續(xù)研究發(fā)現在其它多種腫瘤中也有同樣作用［15-16］。檢索到關于NODAL在腫瘤細胞中功能的文獻均采用基因敲低技術抑制NDOAL的表達，未見敲除NDOAL基因細胞系的報道。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231中成功敲除NODAL基因。

CRISPR/Cas9基因編輯技術是繼ZFNs、TALENs技術之后的第三代基因編輯技術。該技術是在向導RNA的指導下，核酸內切酶Cas9蛋白可將靶DNA在特定位點剪斷，造成DNA雙鏈斷裂的損傷，再借助細胞自身具有的非同源末端連接和同源重組修復的機制，引發(fā)剪切位點的DNA堿基插入或缺失以及DNA片段的替換，最終使靶基因被敲除［17］。為了提高敲除效率，本研究提供了有同源片段的打靶載體，通過同源重組機制達到敲除基因的目的。本實驗利用CRISPR/Cas9基因編輯技術精確剪切MDAMB-231乳腺癌細胞系NODAL基因第二外顯子5'端和3'端處兩個位點后，再通過同源重組機制將外源嘌呤霉素抗性基因替換NODAL基因的Exon2，從而達到敲除NODAL基因的目的。CRISPR/Cas9基因編輯技術具有操作簡單、實驗周期短、成本較低等優(yōu)點，廣泛用于各種生物學、醫(yī)學研究［18］。

表2 基因型鑒定匯總

圖11 Western blot檢測NODAL蛋白表達

NODAL分子除TGF-β超家族成員所具有的信號轉導復雜性外，它還具有在mRNA和蛋白表達水平檢測的復雜性。mRNA表達水平不易檢測，存在較復雜的剪接異構體，以及反義轉錄本和環(huán)狀轉錄本［19-20］。而NODAL蛋白表達雖然容易檢測，但是不同文獻報道的蛋白質分子量差異較大［7］。已報道的NODAL前體蛋白的分子量范圍為35-48 kD，成熟肽的分子量范圍是13-17 kD，且不易在細胞裂解液中檢測到NODAL成熟肽。我們在研究過程中也同樣面臨NODAL分子在mRNA和蛋白水平檢測的問題，以至于我們對NODAL抗體的特異性持懷疑態(tài)度，先后購買了5種NODAL抗體進行檢測，檢測結果差別較大。由于基因敲除是驗證抗體特異性的好方法，通過本研究對NODAL基因的敲除和驗證，發(fā)現僅有Abcam（ab55676）和Santa Cruz（W65）兩種抗體的結果更可信。

鑒于NODAL研究的復雜性，本研究從等位基因的同源重組、移碼突變和大片段缺失3個方面鑒定單克隆細胞的基因型，以便于在基因組水平分析靶細胞的NODAL基因被敲除情況。結果發(fā)現B6單細胞克隆雖然還存在野生型的NODAL基因拷貝，但是卻檢測到NODAL蛋白不表達或很低表達，這說明即使有殘留NODAL基因拷貝但表達效率已很低。由于癌細胞的染色體是非整倍體，基因存在多個拷貝，完全敲除癌細胞的基因有一定難度。如果經一輪敲除僅獲得部分基因拷貝敲除的細胞，可將此細胞再進行一輪敲除，可提高成功率。本研究還發(fā)現雖然有的單細胞克隆鑒定為NODAL基因被部分或完全敲除，但是卻未影響NODAL蛋白的表達，甚至有蛋白表達增加的趨勢。這些問題還有待進一步探究。此外，后續(xù)我們還將利用這些敲除細胞進行體外和體內實驗，以研究NODAL基因在乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲、轉移和代謝等方面的作用。

4 結論

應用CRISPR/Cas9基因編輯技術并利用DNA斷裂損傷后同源重組和非同源重組修復的機制，最終獲得基因型和蛋白表達鑒定為NODAL基因被敲除的單細胞克隆，為進一步研究NODAL分子在乳腺癌細胞中的功能提供了重要支撐。本研究還發(fā)現有一些單細胞克隆雖然基因型鑒定為陽性，但是NODAL蛋白的表達并不降低，其原因還有待進一步研究。