雜糧早餐粉對砷致小鼠肝臟毒性的拮抗作用

李雅濤,儀慧蘭

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

砷(As)是自然界中分布廣泛的一種類金屬元素。人體攝入As的主要途徑之一是飲用含砷水。全球有超過2億人飲用水As含量超過WHO的最高限值10 μg/L[1],我國新疆、內(nèi)蒙古和山西等省份均存在飲用水砷超標(biāo)地區(qū)[2]。

居民飲用水As含量超標(biāo)嚴(yán)重威脅身體健康,長期飲用含As水會引發(fā)機(jī)體多系統(tǒng)損傷,增加生殖、神經(jīng)、心血管系統(tǒng)和Ⅱ型糖尿病的患病率,出現(xiàn)肝損傷、肝纖維化等[3-5]。As進(jìn)入人體后主要在肝臟中進(jìn)行甲基化代謝[6],五價(jià)的砷酸鹽可被谷胱甘肽(GSH)還原成三價(jià)亞砷酸鹽,之后經(jīng)氧化甲基化生成一甲基砷酸鹽(MMAV),MMAV經(jīng)還原生成一甲基亞砷酸鹽(MMAⅢ),MMAⅢ進(jìn)一步氧化甲基化生成有機(jī)砷化合物二甲基砷酸鹽(DMAV),在GSH作用下DMAV被還原生成二甲基亞砷酸鹽(DMAⅢ)[7]。As在細(xì)胞內(nèi)的甲基化代謝過程產(chǎn)生了大量活性氧自由基(ROS),還消耗細(xì)胞內(nèi)源性GSH和硫氧還原蛋白[7]。As暴露導(dǎo)致肝臟組織中ROS水平升高,體內(nèi)的氧化還原平衡被打破,引起組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激,繼而出現(xiàn)肝臟組織損傷[6,8]。

基于對As毒性作用過程的認(rèn)知,采用維生素C(VC)、維生素E(VE)、葡萄籽提取物等抗氧化劑緩解砷毒性取得一定效果[5,9],但有關(guān)利用飲食干預(yù)慢性As中毒的報(bào)道鮮見。因此,探索通過飲食調(diào)節(jié)預(yù)防慢性As中毒是一條新的有效途徑。本研究以課題組利用山西省特色產(chǎn)品小米和核桃為原料配制的早餐粉作為干預(yù)食物,觀察其對飲水型As染毒小鼠肝臟損傷的影響,以期為科學(xué)飲食預(yù)防As毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雜糧早餐粉沖劑的配制

選用小米和核桃為原料,將各原料采用不同的焙烤時(shí)間熟化,通過混料設(shè)計(jì)的方法,用“雙盲法”進(jìn)行感官評分[10],以感官評分為評價(jià)指標(biāo),獲得早餐粉最佳配方(質(zhì)量百分比):小米29.9%、核桃19.70%、黃豆23.00%、白糖24.40%、黃原膠3.00%。將烘烤熟化的原料粉碎,過80目篩后按比例混勻。早餐粉樣液的配制:取1 g早餐粉加水溫高于90℃的水7 mL或14 mL拌均,既為14.3%或7.15%(質(zhì)量/體積)的早餐粉沖劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理

選用昆明種雄性小鼠40只,體重23±2 g,購自山西省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為4組。實(shí)驗(yàn)期間小鼠喂食山西醫(yī)科大學(xué)提供的專用全價(jià)大顆粒飼料,自由攝食與飲水。對照組小鼠飲用蒸餾水,砷染毒組飲用含10 mg/L As的亞砷酸鈉水溶液,連續(xù)60 d。雜糧早餐粉干預(yù)組在飲用10 mg/L As水的同時(shí)灌胃7.15%或14.3%的早餐粉沖劑,灌胃劑量參照文獻(xiàn)略作改動[11],每3天1次。動物室溫度24±2℃,相對濕度40%～60%,自然采光。

染毒期間觀察小鼠整體狀況,記錄飲水量,測量小鼠體重。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物解剖與取材

禁食12 h后,質(zhì)量百分比為1%的戊巴比妥鈉麻醉,稱重,迅速打開腹腔取出肝臟,冷生理鹽水浸洗,濾紙吸干表面浮水,稱肝臟重。取部分肝臟用質(zhì)量百分比為4%中性甲醛固定,其余肝臟組織經(jīng)液氮冷凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)檢測

取凍存的肝組織,加入冷生理鹽水,制成10%(質(zhì)量百分比)的組織勻漿,3 000 r/min低溫離心10 min,取上清液檢測其中氧化應(yīng)激指標(biāo)。超氧化物歧化酶(SOD)活性,還原型谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)含量采用南京建成生物科技有限公司試劑盒檢測;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用DTNB直接法測定;谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性采用CDNB比色法;蛋白含量測定用考馬斯亮藍(lán)比色法。

1.5 組織切片制備

取甲醛固定24 h的肝組織,制備石蠟切片。肝組織用乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切成4～5 μm厚的切片。蘇木素-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPASS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用Duncan方法進(jìn)行多重比較,分析不同處理組間的差異顯著性。圖中用相同小寫字母表示差異不顯著,不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般情況及肝臟臟器系數(shù)

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,實(shí)驗(yàn)動物未出現(xiàn)死亡。小鼠的行走、飲食正常。根據(jù)小鼠飲水量計(jì)算砷攝入量,As組和As+早餐粉組小鼠每天平均攝入As的量為1.731 mg/kg體重。各組肝臟臟器系數(shù)無明顯差異(P>0.05)。

2.2 肝臟組織的氧化應(yīng)激與氧化損傷

飲用含10 mg/L As的水60 d后,小鼠肝臟組織中抗氧化酶SOD、GSH-Px和GST的活性顯著下降,抗氧化小分子GSH含量下降,H2O2和MDA含量顯著增高(P<0.05)(圖1),表明砷染毒組小鼠肝臟組織發(fā)生了氧化脅迫和氧化損傷效應(yīng)。

攝入As的同時(shí)灌胃雜糧早餐粉,小鼠肝臟組織中GSH和H2O2含量與As組無顯著差異(P>0.05),SOD、GSH-Px和GST活性顯著高于As組(P<0.05),與對照組水平接近,MDA含量顯著低于As組(P<0.05)。結(jié)果表明,攝入一定量的雜糧早餐粉能提高動物肝組織抗氧化能力,降低As對小鼠肝臟的氧化脅迫,減緩As暴露所致小鼠肝臟組織的氧化損傷。

注:A:對照;B:As;C:As+7.15%早餐粉;D: As+14.3%早餐粉圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同小寫字母表示差異不顯著Fig.1 Arsenite-induced oxidative stress in mouse livers and related antagonistic effects of grain breakfast圖1 砷對小鼠肝臟組織的氧化脅迫及早餐粉干預(yù)效應(yīng)

2.3 肝臟組織切片觀察

肝臟組織HE染色后觀察發(fā)現(xiàn),對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞形態(tài)正常,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列,無炎性細(xì)胞浸潤(圖2)。As組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂,肝索結(jié)構(gòu)不清,明顯的炎性細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞水腫,肝竇擴(kuò)張充血。與As組相比,As+7.15%早餐粉組肝小葉結(jié)構(gòu)的邊界變得較清楚,肝組織損傷減輕,As+14.3%早餐粉組肝組織炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象減少,肝小葉基本恢復(fù)正常,肝索走向正常。

3 討論

已有研究表明,As對機(jī)體的損傷與其引發(fā)組織氧化脅迫和氧化損傷有關(guān)[6,8-9,12]。機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)與多種疾病的發(fā)生有關(guān)。本研究中,通過飲用含As水誘發(fā)了實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟組織的氧化脅迫和結(jié)構(gòu)損傷,符合現(xiàn)有研究關(guān)于As毒性與氧化脅迫關(guān)聯(lián)的描述,說明本條件下肝臟的損傷與氧化脅迫存在一定的關(guān)系。采用具有較強(qiáng)體外抗氧化能力的雜糧早餐粉灌胃,降低了As暴露造成的肝臟毒性效應(yīng),同期氧化脅迫指標(biāo)改變,說明降低氧化脅迫可以減輕As的肝臟毒性。

臟器系數(shù)是反應(yīng)某個(gè)臟器受損的有效和靈敏的指標(biāo),可反映一種化學(xué)物質(zhì)對其的綜合毒性作用。研究報(bào)道,雄性C57BL/6小鼠飲用含5 mg/L或50 mg/L As的水溶液180 d后,肝臟臟器系數(shù)顯著升高[13]。本研究小鼠飲用含10 mg/L As的水60 d后,As暴露組肝臟臟器系數(shù)未見明顯變化,經(jīng)不同劑量的雜糧早餐粉干預(yù)后肝臟臟器系數(shù)也未見顯著性差異,與上述文獻(xiàn)結(jié)果不一致,可能與小鼠品系、暴露時(shí)間等不同有關(guān)。

As在肝臟中進(jìn)行甲基化代謝的過程中產(chǎn)生大量ROS,并消耗胞內(nèi)還原型GSH和硫氧還原蛋白,引發(fā)組織的氧化應(yīng)激和氧化損傷[7]。本研究中小鼠通過飲水?dāng)z入As后肝臟GSH含量、SOD、GSH-Px和GST活性下降,H2O2和MDA的含量顯著增高,這與以往的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[3,14-15],說明As暴露會使內(nèi)源性抗氧化酶活性抑制,抗氧化物質(zhì)消耗增大,機(jī)體清除自由基的能力降低,導(dǎo)致膜脂過氧化產(chǎn)物MDA水平升高,肝臟組織氧化損傷。As與巰基(—SH)有極高的親和力,與含—SH的酶、功能蛋白及小分子結(jié)合,使含巰基的抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)活性被抑制,可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS累積,促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激[15]。由于GSH是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì),可直接清除自由基,在毒物解毒過程中發(fā)揮重要作用;GSH-Px是機(jī)體重要的含巰基抗氧化酶,以GSH為底物催化過氧化物的分解;GST能夠代謝小分子的氫過氧化物,保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損害。SOD是機(jī)體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化酶,它可以高效地清除生物氧化產(chǎn)生的超氧陰離子,使之轉(zhuǎn)化為H2O2,然后H2O2被酶分解產(chǎn)生O2和H2O。因此,As暴露期間肝臟組織抗氧化酶活性和抗氧化分子含量的降低,導(dǎo)致了肝臟組織的損傷。

采用雜糧早餐粉干預(yù)降低了As暴露引發(fā)的實(shí)驗(yàn)動物肝臟氧化損傷,可能與雜糧早餐粉含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、花色苷、多酚類和維生素等均衡營養(yǎng)成分有關(guān)。雜糧早餐粉主要成分之一的小米含有多酚類物質(zhì),是主要的抗氧化活性成分[16],其中的大量酚羥基,極易被氧化,且可作為氫供體,將活性態(tài)氧自由基還原成活性比較弱的三線態(tài)氧,從而減少氧自由基的產(chǎn)生。多酚類物質(zhì)可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性和機(jī)體抗氧化酶基因表達(dá),進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的氧化應(yīng)激能力,發(fā)揮其抗氧化作用[17];黃豆中的色氨酸和酪氨酸作為氫供體與自由基結(jié)合形成中間體,可阻斷自由基所致的鏈?zhǔn)椒磻?yīng),有效防止As引起的氧化應(yīng)激[18];同時(shí)雜糧早餐粉中的α-亞麻酸可上調(diào)SOD基因的表達(dá)水平,提高SOD活性[19]。因此,雜糧早餐粉提供的均衡營養(yǎng)成分能夠提高肝臟組織酶和非酶抗氧化劑的水平,阻止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),增強(qiáng)肝臟組織的抗氧化能力。本研究將黃豆高含量的賴氨酸與小米中低含量的賴氨酸混合食用,起到氨基酸互補(bǔ)作用,提高了復(fù)配式粗雜糧蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值。與使用外源性抗氧化劑VC 、VE降低As毒性[9]相比,本研究采用的雜糧早餐粉在增強(qiáng)抗氧化功能的同時(shí)提供了人體所需的均衡營養(yǎng)成分,在食用營養(yǎng)早餐的同時(shí)可補(bǔ)充豐富的抗氧化成分,是一種有效干預(yù)As毒性的餐食。作為即食型早餐粉,雜糧早餐粉的使用將為高As飲用水地區(qū)的居民提供一種預(yù)防慢性As毒性的方便途徑。

本文通過飲用含As水誘發(fā)了實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟組織的氧化脅迫和氧化損傷,雜糧早餐粉能通過增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力,緩解As攝入對肝臟組織的氧化脅迫,減輕肝組織的病變程度,說明雜糧早餐粉對預(yù)防As毒性有一定的功效。