黃芪甲苷抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞凋亡*

聶 佩， 孟凡靜， 張金國， 尉希清

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院， 山東 濟(jì)寧 272067； 2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)二科， 山東 濟(jì)寧 272092)

心肌細(xì)胞凋亡參與多種心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，如心肌梗死(myocardial infarction，MI)和心力衰竭(heart failure，HF)等，凋亡通路的激活導(dǎo)致了心肌細(xì)胞的丟失從而導(dǎo)致心臟功能障礙。血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)是由血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的作用下，水解產(chǎn)生的多肽物質(zhì)。既往研究發(fā)現(xiàn)高血壓合并心血管疾病及心力衰竭患者中Ang II水平顯著升高，并表明Ang II參與了心肌細(xì)胞肥大及凋亡[1-2]。黃芪甲苷(astragaloside IV，ASIV)是從中藥黃芪中提取出的有效活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)作用[3-4]。有研究表明ASIV可逆轉(zhuǎn)Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[5]，但其對(duì)Ang II介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是否具有保護(hù)作用，及其具體機(jī)制尚不明確。本研究以Ang II誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，并初步探討了其相關(guān)機(jī)制，為ASIV在心血管疾病方面的應(yīng)用提供了更有力的證據(jù)，為心血管疾病的治療提供了新方向。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞及試劑

心肌H9c2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自 Gibco；ASIV購自南京春秋生物技術(shù)有限公司；Ang II購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自北京Apuris生物技術(shù)有限公司；Bax兔多克隆抗體、Bcl-2兔多克隆抗體、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)兔多克隆抗體、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)兔多克隆抗體、β-actin兔多克隆抗體和羊抗兔IgG-HRP均購自ABclonal Technology；一步法 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DAPI和ECL 顯影液購自碧云天生物技術(shù)研究所；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen。

2 方法

2.1心肌H9c2細(xì)胞的培養(yǎng) 心肌H9c2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，在 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底面積的90%左右時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代或凍存。

2.2Ang II及ASIV的配制 Ang II溶于PBS中，配制成1 000 μmol/L母液，根據(jù)需要濃度再行稀釋。ASIV粉劑先用DMSO溶為溶劑，再溶于含有 10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，DMSO濃度不得超過0.1%[4]。

2.3shRNA轉(zhuǎn)染 構(gòu)建并篩選Nrf-shRNA質(zhì)粒，以3 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參照 Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染 4 h 后更換有血清 DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4H9c2細(xì)胞的分組及處理 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后鋪于6孔板或96孔板，待細(xì)胞長至80%左右時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)。轉(zhuǎn)染前實(shí)驗(yàn)分為以下6組：(1)對(duì)照(control)組：心肌 H9c2細(xì)胞普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，未做任何處理；(2)ASIV組：心肌 H9c2細(xì)胞中加入100 μmol/L濃度ASIV培養(yǎng)24 h；(3)Ang II組：心肌 H9c2細(xì)胞加入1 μmol/L濃度Ang II培養(yǎng)24 h；(4)Ang II+ASIV 25 μmol/L組：用25 μmol/L濃度ASIV預(yù)處理心肌 H9c2細(xì)胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang II培養(yǎng)24 h；(5)Ang II+ASIV 50 μmol/L組：用50 μmol/L濃度ASIV預(yù)處理心肌 H9c2細(xì)胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang II培養(yǎng)24 h；(6)Ang II+ASIV 100 μmol/L組：用100 μmol/L濃度ASIV預(yù)處理心肌 H9c2細(xì)胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang II培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染后分為以下8組：(1)NC+control組：NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，未做任何處理；(2)NC+Ang Ⅱ組：NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，加入1 μmol/L濃度AngⅡ培養(yǎng)24 h；(3)NC+ASIV組：NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，加入100 μmol/L濃度ASIV培養(yǎng)24 h；(4)NC+Ang Ⅱ+ASIV組：NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，用100 μmol/L濃度ASIV預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang Ⅱ培養(yǎng)24 h；(5)shRNA+control組：shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，未做任何處理；(6)shRNA+Ang Ⅱ組： shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，加入1 μmol/L濃度Ang Ⅱ培養(yǎng)24 h；(7)shRNA+ASIV組：shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，加入100 μmol/L濃度ASIV培養(yǎng)24 h；(8)shRNA+Ang Ⅱ+ASIV組：shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，用100 μmol/L濃度ASIV預(yù)處理H9c2心肌細(xì)胞30 min，再加入1 μmol/L濃度Ang Ⅱ培養(yǎng)24 h。

2.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化鋪于96孔板中，使最終密度為每孔4×103，培養(yǎng)12 h后給予藥物干預(yù)，24 h后加入CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h后用酶標(biāo)儀于450 nm測(cè)定吸光度(A)值，630 nm作為參考波長進(jìn)行雙波長測(cè)定。

2.6TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后種于6孔板的玻璃爬片上，給予不同藥物干預(yù)后，用PBS洗滌1次，再用4%多聚甲醛固定。每張玻片上加入100 μL TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3次后加入含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍片。

2.7DCFH-DA標(biāo)記法檢測(cè)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的水平 在6孔板的玻璃爬片中給予不同藥物干預(yù)，去除培養(yǎng)基后，加入DCFH-DA 1 mL在37 ℃下培養(yǎng)20 min，然后在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍片。

2.8Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平 心肌H9c2細(xì)胞按上述方法進(jìn)行藥物干預(yù)后，每孔加入蛋白裂解液裂解，提取各組H9c2細(xì)胞的蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，蛋白定量及變性后通過 Western blot 檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平，具體操作參考文獻(xiàn)[6]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。首先通過單因素方差分析明確各組數(shù)據(jù)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對(duì)于有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，明確哪兩組間存在差異。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞活力及生長情況的影響

分別用0、0.01、0.1、1、10和100 μmol/L濃度的Ang II干預(yù)心肌 H9c2細(xì)胞24 h，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，Ang II可抑制心肌 H9c2細(xì)胞的活力，且呈濃度依賴性,其中1、10和100 μmol/L較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，見圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以1 μmol/L的Ang II為干預(yù)濃度。以0、6.25、12.5、25、50和100 μmol/L的ASIV預(yù)處理心肌 H9c2細(xì)胞30 min, 再使用1 μmol/L Ang II干預(yù)24 h，結(jié)果顯示ASIV可逆轉(zhuǎn)Ang II對(duì)心肌 H9c2細(xì)胞活力的抑制作用，且呈濃度依賴性，其中(6.25～100)μmol/L與0 μmol/L(即Ang II組)相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以25、50和100 μmol/L的ASIV為梯度干預(yù)濃度。圖3為對(duì)照組、ASIV組、Ang II組和Ang II+ASIV(25、50和100 μmol/L)組心肌 H9c2細(xì)胞的生長狀態(tài)，可以看出:對(duì)照組與ASIV組的細(xì)胞形態(tài)大致相同，呈長梭狀，胞漿豐富，排列有序；Ang II組心肌細(xì)胞呈短梭形，排列紊亂，可見漂浮死亡細(xì)胞；Ang II+ASIV組的細(xì)胞可見100 μmol/L ASIV預(yù)處理組的細(xì)胞狀態(tài)與對(duì)照組細(xì)胞相似。

Figure 1.The effects of Ang II at different concentrations on the viability of H9c2 cardiomyocytes. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 不同濃度Ang II對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響

Figure 2.The effects of ASIV at different concentrations on the viability of H9c2 cardiomyocytes induced by Ang II. Mean±SD.n=5.*P<0. 05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖2 不同濃度ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞活力的影響

Figure 3.The effects of ASIV on the growth of H9c2 cardiomyocytes treated with Ang II.

圖3 ASIV對(duì)Ang II干預(yù)的心肌 H9c2細(xì)胞生長情況的影響

2 ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示，與對(duì)照組相比，Ang II組的細(xì)胞凋亡率明顯增高，ASIV可呈濃度依賴性降低Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡(P<0.05)，見圖4。Ang II組的Bax蛋白表達(dá)較對(duì)照組呈明顯上升趨勢(shì)(P<0.05)，Ang II+ASIV組則較Ang II組下降(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)則與之相反(P<0.05)，且隨ASIV干預(yù)濃度不同呈劑量依賴性，見圖5。

Figure 4.The effects of ASIV on the apoptosis of H9c2 cardiomyocytes induced by Ang II (×100). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖4 ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞凋亡的影響

3 ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的影響

與對(duì)照組相比，ASIV組ROS水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，Ang II組的ROS水平顯著增加，Ang II+ASIV組的ROS水平較Ang II組呈濃度依賴性降低(P<0.05)，見圖6,表明ASIV可降低Ang II誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。

Figure 5.The effects of ASIV on the levels of apoptosis-related proteins in the H9c2 cardiomyocytes induced by Ang II were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖5 Western blot檢測(cè)ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌 H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 6.The effects of ASIV on ROS production in the H9c2 cells induced by Ang II (×200). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖6 ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)心肌 H9c2細(xì)胞ROS生成的影響

4 ASIV對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Ang II組的Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)較對(duì)照組呈明顯下降趨勢(shì)，Ang II+ASIV組則可上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)(P<0.05)，且隨ASIV干預(yù)濃度不同呈劑量依賴性，見圖7。這一結(jié)果提示ASIV抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用可能與Nrf2/HO1信號(hào)通路有關(guān)。

Figure 7.The effects of ASIV on the protein expression of Nrf2 and HO-1 in the H9c2 cells were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsAng II group.

圖7 Western blot檢測(cè)ASIV對(duì)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

5 轉(zhuǎn)染后ASIV對(duì)ROS水平及Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證ASIV是通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路而發(fā)揮作用，我們對(duì)H9c2細(xì)胞進(jìn)行Nrf2-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后干預(yù)顯示,與NC+control組相比，NC+AngⅡ組及shRNA+AngⅡ組ROS水平升高，Nrf2和HO-1 蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與NC+AngⅡ組相比，NC+Ang II+ASIV組ROS水平降低，Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05)，shRNA+AngⅡ組及shRNA+AngⅡ+ASIV組ROS水平升高，Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖8。這一結(jié)果提示ASIV是通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)Nrf2/HO1信號(hào)通路而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

討 論

黃芪是一種傳統(tǒng)中藥，其有效成分ASIV具有強(qiáng)大的抗炎、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激、抗哮喘、抗糖尿病和免疫調(diào)節(jié)等多重藥理作用[7]。此外，ASIV還可逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大，抑制心肌纖維化，改善心室重塑，從而發(fā)揮保護(hù)心臟的作用，但其具體作用機(jī)制仍不夠明確。本研究利用Ang II誘導(dǎo)心肌H9c2細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞凋亡具有濃度依賴性的抑制作用，并進(jìn)一步探討其對(duì)ROS水平及Nrf2/HO-1通路蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)ASIV能降低Ang II誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，上調(diào)Nrf2和HO-1的表達(dá)水平，且這一作用在Nrf2-shRNA轉(zhuǎn)染后被消除，表明ASIV可能通過降低ROS水平，并介導(dǎo)Nrf2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是維持正常細(xì)胞更新及組織內(nèi)穩(wěn)定的重要部分，是受損細(xì)胞死亡、正常細(xì)胞替代的運(yùn)行機(jī)制，是一個(gè)活躍的、具有能量依賴性的細(xì)胞死亡機(jī)制[8]。心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的心肌細(xì)胞丟失是影響心臟結(jié)構(gòu)和功能的重要因素，在HF的發(fā)展進(jìn)程中占主導(dǎo)地位。心肌細(xì)胞凋亡參與了心肌肥厚大鼠模型的建立及HF患者的心肌損害發(fā)生[9]。有研究表明，在心臟肥大的進(jìn)展過程中，心臟多由同心性肥大向偏心性肥大發(fā)展，導(dǎo)致心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致心力衰竭[10]。另有研究表明，心肌細(xì)胞凋亡與心肌成纖維細(xì)胞的活化及肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致心肌細(xì)胞的丟失，造成心功能惡化，最終導(dǎo)致心室重塑甚至心力衰竭[11]。Ang II是RAAS系統(tǒng)的主要介導(dǎo)者，其可通過引起血壓升高，從而影響心血管功能。此外，它還可以直接調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生理學(xué)，對(duì)心肌的收縮，心肌細(xì)胞的代謝，心肌細(xì)胞的凋亡及心肌的肥厚性生長均有明顯作用[12]。本研究通過Ang II誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明ASIV可提高心肌 H9c2細(xì)胞活性，降低Ang II誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而發(fā)揮抗凋亡作用，這與以往的研究相一致。Mei等[4]通過構(gòu)建大鼠心肌肥厚模型，驗(yàn)證了ASIV可抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為減輕氧化應(yīng)激、降低calpain活性，及抑制calpain-1蛋白表達(dá)。Guan[13]等發(fā)現(xiàn)ASIV可抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡, 并進(jìn)一步證實(shí)其與激活線粒體上ATP敏感性鉀通道及減輕心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載相關(guān)。

Figure 8.The effects of ASIV on ROS level (A) and Nrf2/HO-1 signaling pathway (B) after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC+control group;&P<0.05vsNC+Ang II group;△P<0.05vsshRNA+control group;▲P<0.05vsNC+Ang II+ASIV group.

圖8 轉(zhuǎn)染后檢測(cè)ASIV對(duì)ROS水平及Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是心臟病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素之一，參與了心肌肥厚、心肌重塑、糖尿病性心肌病甚至心力衰竭的發(fā)生及發(fā)展[14-15]，其中ROS水平的增加是誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損害的主要因素之一[16]。有研究表明，ROS是正常細(xì)胞有氧代謝的副產(chǎn)物，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用，但過量的ROS將通過細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至壞死。在Ang II的介導(dǎo)的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、DNA等細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的破壞過程中可見ROS的大量產(chǎn)生[17]。另有研究表明，Ang II可直接抑制心肌細(xì)胞存活機(jī)制，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)ROS和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)大量產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)心肌纖維化[18-19]。本研究通過檢測(cè)Ang II對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，發(fā)現(xiàn)Ang II可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，而ASIV可降低ROS水平，減輕氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡作用，這與既往研究結(jié)果相一致。既往有研究通過構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型，發(fā)現(xiàn)ASIV可通過降低心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平、上調(diào)心肌細(xì)胞Hes1蛋白表達(dá)而調(diào)控心肌細(xì)胞Notch1/Hes1信號(hào)通路，從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[20]。

Nrf2是氧化還原穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞抗氧化防御的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在內(nèi)源及外源性應(yīng)激下，通過與啟動(dòng)子區(qū)ARE結(jié)合，調(diào)節(jié)抗氧化防御基因如HO-1的表達(dá)[21-22]。在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病型心肌病等心血管疾病中，細(xì)胞氧化還原平衡被打破，Nrf2表現(xiàn)出高度敏感性[25]。另有研究通過構(gòu)建心肌肥厚模型發(fā)現(xiàn)，Nrf2的介導(dǎo)抑制了Ang II誘導(dǎo)的心肌肥厚，進(jìn)一步表明Nrf2/HO-1信號(hào)通路參與了心臟損傷的調(diào)控進(jìn)程[24]。既往研究表明，細(xì)胞間過量產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)Nrf2的靶向抗氧化基因發(fā)揮保護(hù)作用；相反，Nrf2防御系統(tǒng)激活通過調(diào)節(jié)ROS和炎癥過程減輕氧化應(yīng)激損傷[25-26]。另有研究表明，楊梅素可通過增強(qiáng)Nrf2和HO-1基因的表達(dá)對(duì)糖尿病心肌病具有潛在的保護(hù)作用，從而減輕氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和纖維化[27]。此外，有研究證實(shí)，人參皂苷Rg1可通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路來保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧損傷，其作用與保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害相關(guān)[28]。ASIV作為一種抗氧化劑，已被證實(shí)在神經(jīng)元中通過抑制ROS生成并激活Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮作用，但在心肌細(xì)胞中作用機(jī)制尚不明確。本研究通過Ang II誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，檢測(cè)Nrf2及其下游基因HO-1的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ASIV可抑制Ang II誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中Nrf2及HO-1蛋白水平的下降，上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后這一作用被消除，從而表明ASIV通過Nrf2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，我們通過對(duì)凋亡率的檢測(cè)、ROS水平、凋亡蛋白及Nrf2/HO-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)的研究，發(fā)現(xiàn)ASIV對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用，其作用與降低ROS水平，減輕氧化應(yīng)激，并介導(dǎo)Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)。但本研究僅從心肌細(xì)胞株即H9c2細(xì)胞層面探討了ASIV對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用及其機(jī)制，仍需進(jìn)一步從原代心肌細(xì)胞及大鼠體內(nèi)進(jìn)行探究，以期為ASIV對(duì)心血管疾病的保護(hù)作用提供新的理論依據(jù)，為ASIV在心血管疾病領(lǐng)域的應(yīng)用開拓了更廣闊的前景。