姜黃素通過IL-6/STAT3信號通路調(diào)控Th17/Treg平衡治療潰瘍性結(jié)腸炎*

陳光華, 陳教華， 張磊昌

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科， 江西 南昌 330006)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性腸道疾病，病程漫長，反復(fù)發(fā)作，發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[1]。UC的病因十分復(fù)雜，發(fā)病機制尚不十分明確，但多數(shù)學(xué)者認為UC是一種自身免疫性疾病[2-3]。Fonseca-Camarllo等[4]發(fā)現(xiàn),輔助性T細胞17(T helper 17 cells，Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells， Treg)比例失衡引起的促炎/抑炎因子失衡是UC的發(fā)病機制之一。這2個T細胞亞群在免疫功能中發(fā)揮了重要作用，Th17可分泌促炎因子白細胞介素17(interleukin-17, IL-17)，促進腸道炎癥發(fā)生，而Treg細胞可抑制炎癥反應(yīng)。研究證明，IL-6在調(diào)節(jié)Th17和Treg細胞之間的平衡中起重要作用，IL-6和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導(dǎo)Th17細胞的發(fā)育；相反，IL-6抑制TGF-β誘導(dǎo)的Treg分化[5]?，F(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究也已經(jīng)證實了IL-6/STAT3信號通路在UC的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，可通過靶向阻斷IL-6/STAT3信號通路來治療UC疾病[6-7]。近年來，大量研究證實姜黃素對UC具有治療作用，但具體的作用機制尚不十分明確。本研究將姜黃素用于治療葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的UC模型小鼠，并通過檢測IL-6、STAT3及p-STAT3蛋白的水平，以及Th17和Treg細胞的水平及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，來探究姜黃素是否通過IL-6/STAT3信號通路調(diào)控Th17/Treg平衡以有效治療UC，進一步探討姜黃素治療UC的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動物 健康SPF級雌性BALB/c小鼠50只，鼠齡6～7周，體質(zhì)量18～22 g，購于重慶騰鑫生物技術(shù)公司，許可證號為SYXK(渝)2018-005。

1.2藥物與試劑 DSS和姜黃素(Sigma)；小鼠抗IL-6單克隆抗體(批號ab9324)、兔抗STAT3單克隆抗體(批號ab68153)和兔抗磷酸化STAT3(p-STAT3)單克隆抗體(批號ab76315)(Abcam)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(Millipore，GS0914，0.45 μm)；II 抗Goat anti-Rabbit IgG(Jackson，批號03118A)；化學(xué)發(fā)光劑AB液(Thermo)；CD4-PerCP、CD25-APC、CD45RA-PE、IL-17-Alexa Fluor?488(BD PharmingenTM)；FoxP3-PE-Cyanine7(eBioscience)；CD3e-PE-CF594和CD8a-BV510(BD HorizonTM)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo scientific)；兔抗大鼠FOXP3、RORγt和β-actin多克隆抗體(Santa Cruz)。

1.3儀器 CKX41光鏡(Olympus)；Chemidoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；RM2145切片機(Leica)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek)；流式細胞儀(Beckman)。

2 方法

2.1分組及建模 50只健康雌性BALB/c小鼠隨機分為5組，每組10只。正常對照組每日自由進飲用水，每日腹腔注射1 mL生理鹽水，共7 d；模型組每日自由飲用5% DSS溶液，每日腹腔注射1 mL的25 mL/L乙醇溶液，共7 d；姜黃素低劑量組飲用5% DSS溶液，每日腹腔注射姜黃素懸液1次(按15 mg/kg的劑量溶于25 mL/L乙醇1 000 μL)，共7 d；姜黃素中劑量組飲用5% DSS溶液，每日腹腔注射姜黃素懸液1次(按60 mg/kg的劑量溶于25 mL/L乙醇1 000 μL)，共7 d；姜黃素高劑量組飲用5% DSS溶液，每日腹腔注射姜黃素懸液1次(按120 mg/kg的劑量溶于25 mL/L乙醇1 000 μL)，共7 d。于末次給藥結(jié)束后，禁食12 h后全部處死小鼠，收集結(jié)腸組織，分別置于4%多聚甲醛固定，液氮中備用。

2.2結(jié)腸組織的病理學(xué)評分 取出小鼠結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(3 μm)，液氮中備用。遵循HE染色步驟，在光鏡下觀察、拍照并進行病理學(xué)評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2.3Western blot法檢測IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt和FOXP3的蛋白水平 將結(jié)腸組織置于勻漿器內(nèi)同時加入400 μL RIPA裂解液(含PMSF)于冰上勻漿30 min，將裂解液移至1.5 mL離心管中，于4 ℃、12 000 r /min離心5 min，-80 ℃保存上清，Lowry法測定總蛋白量。每個樣品取10 μL并加入等量的2×loading buffer，金屬浴98 ℃ 10 min。SDS-PAGE每孔上樣15 μL，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，膜用5%脫脂奶粉+1% BSA室溫封閉1 h，按1 ∶1 000加入 I 抗，4 ℃搖床過夜，TBST洗3次，每次10 min；按1 ∶5 000加入II抗，室溫反應(yīng)1 h，TBST洗3次，每次15 min；等體積混合ECL AB液，與PVDF膜共孵育1 min，放入Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀曝光，以GAPDH為內(nèi)參照。

表1 組織損傷評分的標(biāo)準(zhǔn)

2.4Th17和Treg細胞水平的檢測 提取小鼠結(jié)腸固有層黏膜單個核細胞：取小鼠結(jié)腸組織，冰PBS沖洗腸內(nèi)容物，剖開腸道，剪成4～5 cm的片段；放入10 mL 去Mg2+、Ca2+的HBSS孵育液(含1 mmol/L-DTT、1 mmol/L-EDTA和10% FBS)，37 ℃搖床40 r/min孵育20 min(2次)去除黏液和上皮細胞；用眼科剪將組織盡量剪碎，放入5 mL含0.5 g/L collagenase D、0.5 g/L DNase I、3 g/L dispase Ⅱ及10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃搖床100 r/min消化15～20 min，將消化好的細胞懸液經(jīng)200目細胞過濾篩濾過，若組織沒消化完全，再重新加入消化液重復(fù)1次；細胞懸液離心300×g10 min，棄上清，加入5 mL DMEM重懸細胞， 300×g離心10 min，沉淀用8 mL 40% Percoll重懸；取15 mL離心管底部加入4 mL 80% Percoll，用槍頭吸取細胞懸液小心鋪于表面，密度梯度離心800×g離心 20 min；把界面層細胞吸入新15 mL離心管，加入10 mL PBS， 300×g離心10 min,棄上清；再用PBS重懸后進行臺盼藍染色和細胞計數(shù)、備用。在24孔培養(yǎng)皿中加入2 μL白細胞混合刺激劑/106個細胞，放入5% CO2、37 ℃恒溫箱培養(yǎng)5 h，室溫避光與抗CD4、CD25和CD45RA抗體孵育15 min；按照操作手冊細胞破膜后避光與抗FOXP3和IL-17抗體孵育20 min，上流式細胞儀檢測Treg細胞及Th17細胞的水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

全部資料應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及SNK-q檢驗，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分

正常對照組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細胞無減少，未見黏膜糜爛、出血，未見炎性細胞浸潤；模型組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，腺體排列紊亂或缺失，腺腔不規(guī)則擴張，黏膜及黏膜下層血管高度擴張、充血，潰瘍巨大、深達肌層，以中性粒細胞和淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤；姜黃素中劑量組小鼠結(jié)腸腺體破壞較輕，結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，炎性細胞浸潤深度較模型組明顯變淺，炎性細胞數(shù)量也顯著減少，炎癥程度明顯減輕；姜黃素低劑量組和高劑量組可見黏膜少量修復(fù)，腺體排列不整齊，大量炎性細胞浸潤，與模型組相比略有減輕，說明低劑量和高劑量的姜黃素對UC疾病沒有很好的治療效果，見圖1。

病理學(xué)評分結(jié)果顯示模型組小鼠組織損傷評分顯著高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素中劑量組病理評分大幅度降低(P<0.05)；姜黃素低劑量組、高劑量組和模型組之間的評分差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見表2。

2 姜黃素對小鼠結(jié)腸組織IL-6、STAT3和p-STAT3蛋白水平的影響

模型組小鼠結(jié)腸組織IL-6、STAT3和p-STAT3的蛋白水平均較正常組顯著增高(P<0.05)；姜黃素中劑量組IL-6、STAT3和p-STAT3的蛋白水平均較模型組明顯降低(P<0.05)；姜黃素低劑量組和高劑量組與模型組之間蛋白水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖2。

3 姜黃素對小鼠結(jié)腸固有層黏膜Th17和Treg細胞水平的影響

模型組的Th17細胞水平最高，Treg細胞的水平最低。與模型組相比，中劑量姜黃素可顯著降低Th17細胞的水平，而顯著升高Treg細胞的水平(P<0.05)，使其接近正常組水平；姜黃素低劑量組和高劑量組的Th17和Treg細胞水平均接近模型組，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖3、表2。

4 姜黃素對小鼠結(jié)腸組織RORγt和FOXP3蛋白表達的影響

模型組小鼠結(jié)腸組織中RORγt蛋白的表達顯著高于正常組，而FOXP3的表達顯著低于正常組(P<0.05)；與模型組相比，中劑量的姜黃素能有效降低RORγt的蛋白表達，并且顯著升高FOXP3的表達(P<0.05)，接近正常組水平；姜黃素低劑量組和高劑量組RORγt和FOXP3的蛋白表達水平接近模型組，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖4。

Figure 1.Colonic histopathological changes of mice in each group (×200).

圖1 小鼠結(jié)腸組織的組織病理學(xué)觀察

表2 小鼠結(jié)腸組織的組織病理學(xué)評分和結(jié)腸固有層黏膜Th17和Treg細胞水平的比較

Table 2.Comparisons of the histological score and the levels of Th17 and Treg in the colon tissues of the mice in each group (Mean±SD.n=10)

GroupHistological scoreTh17 (%)Treg (%)Normal control01.72±0.70 10.16±0.95 UC model6.28±0.15?4.32±0.57?7.28±1.30?Curcumin (low dose)5.46±0.22?4.08±0.62?7.35±0.83?Curcumin (medium dose)1.25±0.12#2.03±0.31#9.88±0.92#Curcumin (high dose)2.83±0.13#3.96±0.75?7.40±1.28?

*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsUC model group．

討 論

UC是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種常見類型，發(fā)病機制較復(fù)雜，免疫反應(yīng)異常在UC發(fā)生中起重要作用[8-9]。CD4+T細胞亞群在免疫調(diào)節(jié)方面具有至關(guān)重要的作用，Th17細胞是新型CD4+T細胞亞群，在誘導(dǎo)自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，RORγt是其特有轉(zhuǎn)錄因子。Th17可分泌IL-17A(IL-17)、IL-17F、IL-22、IL-6和TNF-α多種效應(yīng)因子，IL-17可通過誘導(dǎo)趨化因子和多種促炎細胞因子(比如IL-6和TNF-α)來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與自身免疫性疾病的發(fā)生[10]。此外，Treg在維持免疫穩(wěn)態(tài)和預(yù)防自身免疫性疾病方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠抑制自身免疫的發(fā)生，F(xiàn)OXP3是其標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Treg通過分泌IL-4、IL-10和TGF-β等細胞因子來參與多種免疫性疾病[11]。

在我們的研究中證實，與模型組相比，中劑量姜黃素可顯著降低Th17細胞水平，而顯著升高Treg細胞水平，中劑量的姜黃素能有效降低RORγt的表達，并且顯著升高FOXP3的表達。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Th17和Treg之間的平衡對免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，且Th17和Treg在分化過程中可進行相互轉(zhuǎn)化[12-13]，我們的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在這個過程中發(fā)揮著一定的作用。Yang等[14]研究發(fā)現(xiàn)在DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠中Th17和Treg細胞的比例都是升高的，在UC中存在Th17和Treg的免疫失衡。因此，調(diào)控Th17和Treg的平衡是治療IBD的有效方法。近期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對IBD模型小鼠具有很好的療效[15-16]。姜黃素具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用，但對IBD的作用機制尚不明確。龐艷華等[17]研究認為，姜黃素治療DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的可能機制是抑制NF-κB及細胞因子TNF-α和IL-6等的表達。我們推測，姜黃素可有效促進Treg的轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的表達而抑制Th17的轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達，從而調(diào)節(jié)Th17/Treg的分化平衡緩解UC小鼠的炎癥反應(yīng)。

Figure 2.Western blot analysis of IL-6, STAT3 and p-STAT3 protein expression levels in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsUC model group.

圖2 Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織IL-6、 STAT3 and p-STAT3的蛋白水平

Figure 3.The images of flow cytometry for analyzing the levels of Th17 and Treg cells in the lamina propria mucosa of the colon in the mice of each group.

圖3 流式細胞術(shù)分析小鼠結(jié)腸固有層黏膜Th17和Treg細胞的水平

Figure 4.Western blot analysis of FOXP3 and RORγt protein expression levels in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsUC model group.

圖4 Western blot檢測小鼠結(jié)腸組織FOXP3和RORγt的蛋白水平

在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，姜黃素中劑量組IL-6、STAT3和p-STAT3的蛋白水平均明顯降低，接近正常組。IL-6是一種多效細胞因子，在許多免疫系統(tǒng)中起重要作用，可以調(diào)節(jié)多種免疫細胞的增殖和分化。IL-6因在Th17和Treg分化及相互轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用而在UC中起調(diào)節(jié)炎癥的作用，IL-6的過度表達會導(dǎo)致Th17和Treg細胞之間的分化失衡，已有研究表明，控制IL-6的表達會調(diào)節(jié)Th17介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Bromberg等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在UC模型小鼠結(jié)腸固有層黏膜中存在Th17/Treg細胞的失衡，并且IL-6的水平是升高的，認為是IL-6的局部水平升高參與了兩者之間的分化失衡從而導(dǎo)致了UC小鼠的免疫失衡。IL-6可與受體結(jié)合形成IL-6/sILR復(fù)合物形式，復(fù)合物與膜糖蛋白gp130相互作用，使與gp130組成性相關(guān)的JAK激酶磷酸化，從而使STAT3的表達增加，活化的JAK可使STAT3發(fā)生磷酸化而被激活，轉(zhuǎn)移到細胞核中后調(diào)節(jié)下游基因的表達，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[19]。目前，通過靶向阻斷IL-6/STAT3信號通路可以有效預(yù)防和治療UC疾病。Chen等[20]研究證實在DSS結(jié)腸炎模型中，IL-6和STAT3表達水平均升高，并且隨著病程程度的增加而增加。我們推測，本研究結(jié)果說明姜黃素可通過對該通路的調(diào)節(jié)而發(fā)揮對UC的治療作用。

本研究發(fā)現(xiàn)UC模型組中IL-6、STAT3和p-STAT3的蛋白水平較高，并且 Th17/Treg比例是失衡的，中劑量姜黃素治療后，蛋白水平下降，接近正常組水平，Th17/Treg的比例恢復(fù)平衡。因此，姜黃素可能通過IL-6/STAT3信號通路調(diào)控Th17/Treg的平衡來治療潰瘍性結(jié)腸炎。本研究為明確姜黃素治療UC的作用機制提供了理論依據(jù)。