玉米HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因ZmHOX32的克隆及功能探究

張 新，曹麗茹，張 軍，魏良明，張前進(jìn)，魏 昕，王振華，魯曉民

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002； 2.河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院，河南 南陽(yáng) 473000)

轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)可與下游靶基因DNA片段特異性結(jié)合，進(jìn)而抑制或者激活目標(biāo)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)植物逆境脅迫應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育的蛋白質(zhì)。同源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白(HD-Zip)是高等植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，包含高度保守的同源異型域(HD)，HD羧基末端與亮氨酸拉鏈域(LZ)緊密相連[1-2]。其中，由60或61個(gè)氨基酸組成的HD區(qū)域折疊成由3個(gè)α螺旋組成的三維空間結(jié)構(gòu)，可專(zhuān)一性識(shí)別目標(biāo)基因5′上游區(qū)的順式作用元件；LZ區(qū)一般由5～6個(gè)亮氨酸(Leu)殘基組成[3]。另外，有研究表明，HD-Zip只對(duì)高等植物特有的發(fā)育進(jìn)程具有至關(guān)重要的作用[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子雖然序列相似，但所發(fā)揮的功能多種多樣，如調(diào)控植物葉的發(fā)育、根毛的形成和避陰反應(yīng)等[3]。擬南芥HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因中的ATHB-1、ATHB-3、ATHB-13、ATHB-20和ATHB-23與子葉和葉的發(fā)育有關(guān)[5]。其中，ATHB-2基因的表達(dá)受遠(yuǎn)紅外光的調(diào)控，通過(guò)響應(yīng)3種不同的光敏色素，控制下胚軸的發(fā)育[6]。研究表明，ATHB12基因通過(guò)降低GA20氧化酶Ⅰ的表達(dá)量調(diào)控花序柄的生長(zhǎng)，且正向調(diào)節(jié)葉片發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞生長(zhǎng)[7]。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)向日葵HaHB-4基因，擬南芥的莖和節(jié)間距離變短，花絮更密，有利于植株對(duì)干旱的適應(yīng)[8]。也有報(bào)道，擬南芥中ATHB-5、ATHB-6、ATHB-7、ATHB-12基因均受干旱和外源脫落酸(ABA)誘導(dǎo)，說(shuō)明它們?cè)谑畻l件下可能起重要作用[9]。HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子與植物激素也存在一定的關(guān)系，水稻HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因Oshox4過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致半矮型表型，添加外源GA3亦不能復(fù)原[10]；HD-Zip家族成員Homeobox-leucinezipperproteinHOX22影響ABA的生物合成，通過(guò)介導(dǎo)ABA的信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控干旱和鹽脅迫的響應(yīng)[11]。

HD-Zip蛋白是參與非生物脅迫響應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，但關(guān)于HD-Zip的研究主要集中在擬南芥、水稻、向日葵等植物上[12]，而關(guān)于玉米HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)Ψ巧锩{迫和外源激素的應(yīng)答模式以及特異結(jié)合目標(biāo)靶基因的DNA片段等的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，對(duì)玉米HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族中的GRMZM2G178102(ZmHOX32)基因進(jìn)行克隆，利用生物信息技術(shù)分析ZmHOX32基因序列的基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化特征、啟動(dòng)子順式作用元件，并利用熒光定量技術(shù)分析干旱和外源ABA誘導(dǎo)下ZmHOX32基因的表達(dá)模式，為解析HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子在玉米逆境脅迫和信號(hào)傳導(dǎo)中的作用奠定基礎(chǔ)，并為篩選抗逆性強(qiáng)的玉米種質(zhì)資源提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供的玉米自選系鄭D58M。取大田生長(zhǎng)的鄭D58M植株并分為根、莖、芽、葉、雄穗、雌穗、花粉、胚、胚乳和營(yíng)養(yǎng)分生組織，作為測(cè)定ZmHOX32基因時(shí)空表達(dá)的樣品。挑選飽滿、大小均勻的鄭D58M籽粒播種到營(yíng)養(yǎng)土中，待玉米生長(zhǎng)至一葉一心時(shí)，將幼苗從營(yíng)養(yǎng)土中連根部輕輕拔起，清洗掉泥土后轉(zhuǎn)移至含有Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH值5.8)的盒子中，置于溫室(30 ℃光照培養(yǎng)16 h、26 ℃暗培養(yǎng)8 h，相對(duì)濕度為35%～55%)進(jìn)行水培。當(dāng)鄭D58M長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米苗進(jìn)行以下3個(gè)處理：Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(CK)、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+20% PEG、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液+100 mol/L ABA，處理6、12 h時(shí)分別取幼苗相同部位的葉片，然后將3個(gè)處理的幼苗均置于新鮮的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，36 h后再次取3個(gè)處理幼苗相同部位的葉片。以上所有大田和室內(nèi)樣品5株相同部位混勻作為1個(gè)樣品，每個(gè)部位共取3個(gè)樣品，之后將樣品迅速放入液氮，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 玉米總RNA提取及cDNA的合成

采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN，USA)提取玉米R(shí)NA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa大連)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 ZmHOX32基因的克隆

設(shè)計(jì)玉米HD-Zip基因家族中GRMZM2G178102(ZmHOX32)基因的特異擴(kuò)增引物(ZmHOX32-F：ATGGCGTCGGGCGGCT和ZmHOX32-R：TCACACGAAGGACCAGTTG)，利用擴(kuò)增引物進(jìn)行RT-PCR，RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，經(jīng)回收純化，連接至pMD18-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性單克隆送深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

1.4 ZmHXO32轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析

使用在線EXPASY中的Protparam對(duì)ZmHXO32轉(zhuǎn)錄因子的等電點(diǎn)(pI)、分子質(zhì)量(MW)、疏水性、穩(wěn)定性等屬性進(jìn)行計(jì)算；分別利用TMHMM Server、SOPMA和Softberry對(duì)ZmHXO32的蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，使用ExPASy網(wǎng)站的NetPhoS預(yù)測(cè)ZmHXO32的磷酸化位點(diǎn)；利用Plantcare預(yù)測(cè)ZmHOX32基因啟動(dòng)子的順式作用元件；利用MEGA軟件中的NJ法構(gòu)建ZmHXO32與其他物種同源蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；使用MEME在線分析工具對(duì)ZmHXO32的保守基序(motif)進(jìn)行分析，基序的最大數(shù)目設(shè)置為12。

1.5 ZmHOX3基因的表達(dá)分析

采用qRT-PCR定量分析ZmHOX3基因的表達(dá)情況。根據(jù)ZmHOX3基因序列設(shè)計(jì)特異熒光PCR引物ZmHOX32-QF：AGCTAGCTAGATGGCGTC和ZmHOX32-QR：ACCCGCTCGAGCGCCTCGA。以玉米18 S rRNA為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物18S1:5′-CCTGCGGCTTAATTGACTC-3′；18S2:5′-GTTAGCAGGCTGAGGTCTGG-3′。利用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad,USA)，參考SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，Japan)試劑盒程序，采用兩步法以不同部位和不同處理樣品的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。根據(jù)2-△△Ct法(△Ct=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=△Ct處理后-△Ct對(duì)照)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmHOX32基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析

利用RT-PCR擴(kuò)增ZmHOX32基因，得到大小約為3 000 bp的特異條帶(圖1A)，測(cè)序結(jié)果顯示，該基因序列包含1個(gè)完整的2 571 bp開(kāi)放閱讀框，編碼856個(gè)氨基酸，與全基因組序列已經(jīng)公布的玉米自交系B73的序列一致。序列分析顯示，ZmHXO32蛋白含有Homeobox、bZIP、START_ArGLABRA2_like和MEKHLA共 4個(gè)功能域(圖1B)，屬于典型的HD-Zip家族。

利用Protparam在線軟件分析ZmHXO32蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，ZmHXO32蛋白的分子質(zhì)量為93.17 ku，理論等電點(diǎn)為6.59，分子式為C4 084H6 482N1 164-O1 245S42；不穩(wěn)定指數(shù)為47.24，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；GRAVY值為-0.187，屬于親水性蛋白質(zhì)；TMHMM Server跨膜螺旋區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ZmHXO32蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域；SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ZmHXO32蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲占39.95%，β折疊占4.79%，α螺旋占40.89%，該蛋白質(zhì)主要以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。NetPhoS分析顯示，ZmHXO32蛋白分別含有49個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、27個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和10個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明ZmHXO32蛋白可能被絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸蛋白激酶激活，從而調(diào)控下游響應(yīng)基因的表達(dá)，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。

A.ZmHOX32 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，M.Trans2K DNA Marker,泳道1代表ZmHOX32基因的擴(kuò)增片段；B.ZmHXO32蛋白結(jié)構(gòu)域，1.Homeobox，2.bZIP，3.START_ArGLABRA2_like，4.MEKHLA

2.2 ZmHXO32的系統(tǒng)進(jìn)化及保守基序分析

利用NJ法構(gòu)建玉米ZmHXO32蛋白與其他單子葉和雙子葉植物同源蛋白質(zhì)的進(jìn)化樹(shù)(圖2)。由圖2可見(jiàn)，玉米ZmHXO32蛋白與谷子(Setariaitalica)、胡桃木(Panicumhallii)同源蛋白質(zhì)的進(jìn)化關(guān)系最為緊密。為了進(jìn)一步分析ZmHXO32蛋白及其他物種同源蛋白質(zhì)的保守性，利用MEME軟件鑒定了12個(gè)保守基序。由圖2可知，玉米ZmHXO32蛋白與谷子、胡桃木同源蛋白質(zhì)不僅同源性較高，保守基序數(shù)目及位置也一致，說(shuō)明不同物種間進(jìn)化樹(shù)遺傳距離越近，其基序相似度越高，親緣關(guān)系越近。另外，這些物種均含有這12種保守基序，說(shuō)明ZmHXO32蛋白在進(jìn)化中功能結(jié)構(gòu)域極為保守。

2.3 ZmHOX32基因啟動(dòng)子順式元件分析

為了進(jìn)一步解析ZmHOX32基因的功能，利用Plantcare預(yù)測(cè)ZmHOX32基因ATG上游2 000 bp的順式結(jié)合元件，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，ZmHOX32基因含有多種功能性響應(yīng)元件，除了啟動(dòng)子本身最基本的核心元件TATA-box、CAAT-box等外，還包含如ABRE、AuxRR-core、CAT-box、CCAAT-box、DRE、GC-motif、LTR、TC-rich repeats、TCA-element等結(jié)合位點(diǎn)。其中，ABRE參與ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑，響應(yīng)干旱應(yīng)答；AuxRR-core是生長(zhǎng)素響應(yīng)因子，在子葉、胚乳和側(cè)根發(fā)育中起重要作用；CAT-box調(diào)控植物的分生組織表達(dá)；CCAAT-box作為MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，或通過(guò)受MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控參與植物的逆境脅迫；DRE響應(yīng)干旱和鹽脅迫；GC-motif 在抗氧化反應(yīng)中起重要作用；LTR響應(yīng)低溫脅迫，啟動(dòng)低溫相關(guān)基因的表達(dá)；TC-rich repeats參與抵御植物的外界脅迫；TCA-element 參與水楊酸的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。另外，還發(fā)現(xiàn)大量光刺激應(yīng)答元件(TCCC-motif、G-box、GT1-motif和AE-box)，推測(cè)ZmHOX32基因可能還參與植物光合作用和調(diào)控植物開(kāi)花等光反應(yīng)。

帶數(shù)字的方框代表不同的基序

表1 ZmHOX32基因啟動(dòng)子順式元件分析

2.4 ZmHOX32基因的組織表達(dá)模式分析

為了解ZmHOX32基因的組織表達(dá)模式，利用qRT-PCR分析該基因在玉米生長(zhǎng)不同時(shí)期及不同組織的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，ZmHOX32基因在根、莖、芽、葉、雄穗、雌穗、花粉、胚、胚乳和營(yíng)養(yǎng)分生組織中均有表達(dá)，且在營(yíng)養(yǎng)分生組織中表達(dá)量最高；ZmHOX32基因在胚中的表達(dá)量較在胚乳中表達(dá)量高?？梢?jiàn)，ZmHOX32屬于組成型表達(dá)基因，但不同部位的表達(dá)量存在不同程度的差異，說(shuō)明ZmHOX32基因在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。

2.5 ZmHOX32基因?qū)Ω珊得{迫和ABA誘導(dǎo)的響應(yīng)模式分析

由圖4可見(jiàn)，與CK相比，PEG和ABA脅迫6、12 h時(shí)，ZmHOX32基因相對(duì)表達(dá)量均上升，且ABA脅迫下的表達(dá)量高于PEG脅迫；進(jìn)一步分析恢復(fù)正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)后36 h的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，PEG和ABA脅迫處理下ZmHOX32基因的表達(dá)量均較之前下降，與CK接近但均未達(dá)到正常水平。說(shuō)明ZmHOX32基因響應(yīng)干旱脅迫和ABA誘導(dǎo)，且受二者的正向誘導(dǎo)，即ZmHOX32基因可能在玉米響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中具有重要作用。

圖3 ZmHOX32基因在玉米不同組織中的表達(dá)模式

圖4 ZmHOX32基因響應(yīng)干旱和ABA脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)模式

3 結(jié)論與討論

HD-Zip結(jié)構(gòu)域在所有真核生物中存在高度保守的DNA序列基序[13]。由3個(gè)α螺旋折疊成的HD區(qū)域可專(zhuān)一性地識(shí)別目標(biāo)基因啟動(dòng)子上游區(qū)的順式DNA序列；亮氨酸拉鏈?zhǔn)堑鞍踪|(zhì)中常見(jiàn)的三維結(jié)構(gòu)基序，其蛋白質(zhì)含有ABA反應(yīng)元件，在種子和營(yíng)養(yǎng)組織中作為ABA信號(hào)傳導(dǎo)的重要參與者，是非生物脅迫(干旱、鹽、冷)響應(yīng)的關(guān)鍵區(qū)域[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，ZmHXO32蛋白序列主要以α螺旋方式存在，ZmHOX32基因啟動(dòng)子區(qū)域含有ABA和水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)合位點(diǎn)(ABRE和TCA-element)，也含有DRE、GC-motif、LTR、TC-rich repeats等抵御外界刺激和非生物脅迫的順式結(jié)合位點(diǎn)。說(shuō)明ZmHOX32基因在逆境脅迫和信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起重要作用。

本研究中，ZmHOX32基因?qū)儆诮M成型表達(dá)基因，在根、莖、芽、葉、雄穗、雌穗、花粉、胚、胚乳和營(yíng)養(yǎng)分生組織中均有表達(dá)，但ZmHOX32基因在營(yíng)養(yǎng)分生組織中表達(dá)量最高；在胚和胚乳中均有表達(dá)，但在胚中表達(dá)量較高，ZmHOX32基因在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。前人研究結(jié)果表明，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子基因家族的組織表達(dá)模式不盡相同，如擬南芥中的HD-Zip類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因大多數(shù)在表皮組織中特異表達(dá)，其中GL2/ATHB-10和PDF2調(diào)控細(xì)胞表皮特定基因的表達(dá)[15]；Zmhdz10基因也屬于組成型表達(dá)基因，但在葉片中表達(dá)水平最高[16]；水稻Oxshox1屬于組成型表達(dá)基因，在幼芽和成熟的葉片中呈現(xiàn)高表達(dá)[17]。可見(jiàn)，同一家族的基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫過(guò)程中的作用機(jī)制不同。

水稻Oshox4基因已被證實(shí)可提高水稻的抗旱性[10]。擬南芥Athb7基因受植物激素ABA調(diào)控，干旱脅迫下該基因上調(diào)表達(dá)[18]。采用ABA或者氯化鈉處理植物幼苗，發(fā)現(xiàn)ATHB-7、ATHB-12、ATHB-6和ATHB-40的表達(dá)量上調(diào)，而ATHB-3、ATHB-23、ATHB-5和ATHB-52的表達(dá)量降低1/2[15]；鹽處理使ATHB-1和ATHB-16表達(dá)量減少，但ABA對(duì)其表達(dá)量無(wú)影響[19]。本研究中，玉米ZmHOX32基因在PEG和ABA脅迫以及恢復(fù)正常時(shí)均受PEG和ABA的正向誘導(dǎo)，但ABA誘導(dǎo)下基因的表達(dá)量高于PEG模擬的干旱脅迫；進(jìn)一步分析恢復(fù)正常營(yíng)養(yǎng)液后36 h的玉米植株發(fā)現(xiàn)，ZmHOX32基因的表達(dá)量較PEG脅迫和ABA誘導(dǎo)6、12 h時(shí)的表達(dá)量均有所下降，但仍未達(dá)到正常水平，說(shuō)明植株受脅迫后，遭受一定程度的破壞，恢復(fù)正常生長(zhǎng)條件后雖有一定的補(bǔ)償作用，但補(bǔ)償效應(yīng)低于脅迫帶來(lái)的損傷。以上結(jié)果為研究ZmHOX32基因在逆境脅迫和激素傳導(dǎo)中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本研究克隆了玉米HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族的ZmHOX32基因，ZmHXO32蛋白屬于親水性蛋白質(zhì)，定位于細(xì)胞核內(nèi)；進(jìn)化樹(shù)和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，ZmHXO32蛋白與谷子(Setariaitalica)、胡桃木(Panicumhallii)同源蛋白質(zhì)的保守功能域完全一致，三者序列高度同源；ZmHOX32基因的啟動(dòng)子序列含有響應(yīng)激素(脫落酸和水楊酸)和非生物脅迫(干旱、鹽、冷)及光刺激的結(jié)合元件；qRT-PCR結(jié)果顯示，ZmHOX32基因?qū)儆诮M成型表達(dá)基因，在營(yíng)養(yǎng)分生組織中高表達(dá)，且正向響應(yīng)干旱脅迫和ABA誘導(dǎo)，在干旱脅迫和ABA信號(hào)傳導(dǎo)路徑中起重要作用。