胡蘿卜黑腐病生防放線菌G-1抑菌活性研究

張家榕，高振峰，李 娜，張曉宇

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031；3.山西科技新聞出版?zhèn)髅郊瘓F 今日農(nóng)業(yè)雜志社，山西 太原 030006)

胡蘿卜黑腐病作為一種由胡蘿卜黑腐交鏈孢(Alternariaradicina)引起的重要真菌病害，在全國各種植區(qū)均有發(fā)生，對我國胡蘿卜產(chǎn)量、品質(zhì)和產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要影響[1]。近年來，有關(guān)該病害的發(fā)生與防治已有相關(guān)報道，但同其他作物病害相比被重視程度較低，相關(guān)防治研究較為薄弱。目前，國內(nèi)主要有趙曉軍等[1-2]、周建波等[3-4]、羅真等[5]、李海波等[6]、周通[7]、牛國飛[8]對胡蘿卜黑腐病的發(fā)生規(guī)律、病原鑒定及生物學(xué)特性、化學(xué)防治、抗性品種篩選、采后貯藏保鮮危害等內(nèi)容進行了相關(guān)研究和報道。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜受該病原侵染不僅對其產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要影響，而且還會產(chǎn)生植物毒素影響人體健康，因此，有關(guān)胡蘿卜黑腐病防治的研究對提高種植區(qū)胡蘿卜產(chǎn)量、品質(zhì)和人體健康具有重要意義[9]。

化學(xué)防治作為植物病害防治的重要手段，在保障我國糧食安全中發(fā)揮重要作用。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)，百菌清藥劑和撲海因藥劑在防治該病害方面具有較好效果[1,5]，但隨著化學(xué)藥劑防治問題(殘留超標(biāo)、病原抗藥性增強和環(huán)境污染等)的凸顯、人們對高品質(zhì)安全農(nóng)產(chǎn)品需求的增加以及我國“減藥”方針的出臺，新型、綠色安全農(nóng)藥開發(fā)和防治技術(shù)研究迫在眉睫[10-11]。另外，為有效防治胡蘿卜黑腐病和緩解化學(xué)農(nóng)藥不合理使用引起的負面問題，國外還對該病原的生物防治進行了相關(guān)研究，例如研究發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)seudomonassp.MF416和ClonostachysroseaIK726生物菌劑對胡蘿卜黑腐病具有良好防效[12]；Pseudomonasspp.與熱水聯(lián)合處理胡蘿卜種子可有效防止胡蘿卜黑腐病發(fā)生[13]；菌株Ulocladiumatrum對胡蘿卜黑腐病防效顯著[14]，但在國內(nèi)還未見有關(guān)該病害生物防治的相關(guān)研究報道。

選用抗病微生物進行植物病害生物防治，近年來備受關(guān)注，并被廣泛研究。放線菌作為一種抗病微生物，是抗生素的主要產(chǎn)生菌之一，且所產(chǎn)抗生素種類較多，約占已報道種類的60%～80%，對多種植物病害具有良好防效，其植物病害防治應(yīng)用潛力明顯[15]。鑒于此，擬從胡蘿卜表層土壤中分離和篩選對胡蘿卜黑腐病病原具有良好抑制效果的放線菌菌株，并進行盆栽試驗效果驗證，旨在篩選對該病原具有良好防效的拮抗放線菌，為該病害的生物防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

胡蘿卜黑腐交鏈孢(Alternariaradicina)由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所采后病理室分離，經(jīng)ITS序列鑒定，以斜面保藏法低溫保藏。

1.2 供試培養(yǎng)基

高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、MgSO4·7H2O 1 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、K2Cr2O7750 (μg/mL)0.75 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.5。

改良PDB培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g、葡萄糖10 g、胡蘿卜汁5 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH值。

改良PDA培養(yǎng)基：在改良PDB培養(yǎng)液中加入20 g瓊脂粉。

1.3 胡蘿卜表層土中放線菌分離與純化

1.3.1 胡蘿卜表層土收集 2017年10月7日分別于新絳縣西行莊村、大聶村和襄汾縣義西毛村，將收獲的胡蘿卜用冰袋帶回實驗室，置于無菌不銹鋼托盤中風(fēng)干4 h，隨后使用軟毛刷將其表面攜帶的泥土緩慢刷下、收集，從而獲得胡蘿卜表層土，并置于100 mL無菌藍蓋瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 放線菌分離與純化 稱取胡蘿卜表層風(fēng)干土壤1 g，置于裝有15 mL無菌水的50 mL無菌離心管中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，28 ℃、160 r/min振蕩3 h，稀釋10 000倍后吸取120 μL涂布于高氏1號平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)15 d，每處理重復(fù)3次，每隔24 h觀察1次，有菌落出現(xiàn)時依據(jù)菌落顏色和形態(tài)及時進行純化。各菌落使用劃線法純化3代后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 胡蘿卜黑腐病拮抗放線菌初篩

采用平板對峙法[16]對胡蘿卜黑腐病拮抗放線菌初篩：使用直徑為5 mm的打孔器，打取活化培養(yǎng)5 d后的胡蘿卜黑腐病病原，接種于改良PDA平板中央；使用接種環(huán)挑取放線菌，于距離病原真菌菌餅中心2 cm處接種供試的放線菌；置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，并采用十字交叉法測量對峙面病原菌落直徑，計算抑菌率，以僅接種病原菌菌落為對照，各處理和試驗均重復(fù)3次。

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)×100/(對照菌落直徑-5 mm)×100%。

1.5 胡蘿卜黑腐病拮抗放線菌復(fù)篩

1.5.1 放線菌無菌發(fā)酵濾液制備 采用接種環(huán)挑取一環(huán)純化后的放線菌菌株，分別接種至裝有300 mL改良PDB無菌發(fā)酵液的500 mL三角瓶中，于28 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d后終止發(fā)酵。隨后將發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，并用0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得無菌發(fā)酵濾液。

1.5.2 無菌發(fā)酵濾液抑菌活性測定 采用宋洪允等[17]的生長速率法，以胡蘿卜黑腐病為靶標(biāo)，對不同放線菌菌株無菌濾液的抑菌活性進行測定。各處理和試驗均重復(fù)3次。

1.6 拮抗放線菌G-1的16S rRNA序列鑒定

參照GAO等[18]的方法提取菌株G-1基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，使用通用引物27F和1492R，參照GAO等[18]的反應(yīng)體系和擴增程序?qū)闓-1的16S rRNA基因序列進行擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，將PCR產(chǎn)物送交北京華大基因科技有限公司進行測序。獲得菌株G-1 16S rRNA基因序列后使用NCBI在線軟件BLAST將獲得序列同模式菌株進行比對分析，選擇不同種同源性較高的模式菌株16S rRNA基因序列，使用MEGA 5.0軟件中的ClustalW(1.6)進行多重比對分析，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定菌株G-1分類地位。

1.7 拮抗放線菌G-1盆栽防效測定

將田間土壤與河沙按照2∶1(體積比)混合，置于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌2 h，60 ℃烘干。隨后將滅菌沙土置于上口徑21 cm和高18 cm的塑料盆中，裝土至盆高的3/4。每盆播種胡蘿卜種子(超級紅冠)6粒，置于人工氣候箱中(相對濕度80%～90%，溫度25～30 ℃，光周期L∶D為16∶8，光照強度24 000 lx)，長出真葉后間苗，每盆留苗3棵。長至5～6葉后，采用針刺噴霧(以表面不形成液滴為宜)和灌根(用量為100 mL)2種方法同時接種胡蘿卜黑腐病病原(濃度為106cfu/mL)。每隔5 d接種1次，連續(xù)接種2次。最后一次接種病原5 d后，采用噴霧和灌根2種方法同時接種放線菌G-1不同稀釋倍數(shù)(0、50、100、200、300倍)無菌發(fā)酵液上清液，以空白無菌發(fā)酵液作為對照，用量為150 mL。每隔5 d接種1次，連續(xù)接種3次。在最后一次接種發(fā)酵液20 d后參照周建波等[4]的方法統(tǒng)計處理組和對照組發(fā)病情況，計算病情指數(shù)和防效。其余盆栽管理措施參照田間管理。每處理4盆，各試驗重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，利用Duncan’s法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜表層土中放線菌的分離、純化

采用平板稀釋涂布法對不同種植區(qū)胡蘿卜表層土壤中的放線菌進行分離、純化，3個胡蘿卜種植區(qū)分離到的放線菌數(shù)量存在明顯差異(表1)。其中，采集地大聶村和義西毛村的差異較小，分別有7、6株放線菌被分離、純化出來，而西行莊村則只有2株放線菌被分離、純化出來，說明放線菌菌群多樣性具有明顯的地域差異。從分離數(shù)量上來看，其明顯少于已報道的細菌和真菌，說明放線菌的分離培養(yǎng)難度較大。另外，在無菌水對照平板中未發(fā)現(xiàn)其他雜菌生長，說明分離到的7株放線菌均來自胡蘿卜表層土壤。

表1 不同采集地胡蘿卜表層土放線菌分離、純化結(jié)果Tab.1 Separation and purification results of actinomycetes from carrot surface soils of different collections

2.2 不同放線菌菌株對胡蘿卜黑腐病病原的抑菌活性

采用平板對峙法對上述15株不同形態(tài)放線菌對胡蘿卜黑腐病病原的抑菌活性進行測定后發(fā)現(xiàn)，僅有3株放線菌(YHT-2、G-1、G-6)對胡蘿卜黑腐病病原具有一定抑菌活性，只占分離總數(shù)的20%(表2)，再次說明抗病放線菌分離較困難。3株有活性的菌株中以菌株G-1抑菌活性最高，抑菌率為77.2%，明顯高于菌株YHT-2(13.2%)和G-6(17.9%)(表2、圖1)，說明菌株G-1對胡蘿卜黑腐病病原具有良好的抑菌效果，且在該病害生物防治中具有較好應(yīng)用潛力。

表2 不同放線菌對胡蘿卜黑腐病病原的抑菌活性Tab.2 Antifungal activity of different actinomycetes against Alternaria radicina

注：“—”表示無抑菌活性；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，表3同。

Note: “—” represent no antifungal activity;Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),Tab. 3 is the same.

圖1 菌株G-1對胡蘿卜黑腐病病原的抑菌活性Fig.1 The antifungal activity of strain G-1 against Alternaria radicina

2.3 不同放線菌菌株發(fā)酵液對胡蘿卜黑腐病病原的抑菌活性

放線菌生長較緩慢，且其活性物質(zhì)產(chǎn)生所需時間較長，因此，為避免活性菌株漏篩，本研究還采用發(fā)酵液對15株放線菌對胡蘿卜黑腐病病原抑菌活性進行了復(fù)篩。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株G-1發(fā)酵液抑菌活性同平板對峙法差異較小，抑菌率為78.5%(表3、圖2)；菌株YHT-2和菌株G-6發(fā)酵液抑菌活性高于平板對峙法測定結(jié)果，其發(fā)酵液抑菌活性分別為34.3%、46.1%；菌株YHT-5和菌株G-3發(fā)酵液同樣表現(xiàn)出微弱抑菌活性，抑菌率分別為12.6%和13.7%，說明部分菌株在固體平板上產(chǎn)活性物質(zhì)速率和產(chǎn)量低于發(fā)酵培養(yǎng)，且單純使用平板對峙法篩選活性菌株存在漏篩可能性，因此，在后續(xù)活性菌株篩選過程中應(yīng)注重發(fā)酵液復(fù)篩過程。

表3 不同放線菌發(fā)酵液對胡蘿卜黑腐病病原的抑菌活性Tab.3 Antifungal activity of fermentation broth of different actinomycetes against Alternaria radicina

圖2 菌株G-1發(fā)酵液對胡蘿卜黑腐病病原的抑菌活性Fig.2 Antifungal activity of fermentation broth of strain G-1 against Alternaria radicina

2.4 基于16S rRNA的菌株G-1分類

將菌株G-1的16S rRNA序列在NCBI網(wǎng)站中同模式菌株進行對比分析，發(fā)現(xiàn)菌株G-1的16S rRNA基因序列同鏈霉菌屬菌株具有較高的相似比。隨后選擇鏈霉菌屬不同種模式菌株16S rRNA序列與菌株G-1的16S rRNA序列使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株G-1同模式菌株StreptomycesalbidoflavusDSM 40455T(NR 116634.1)聚在同一支(圖3)，說明菌株G-1同該菌株具有較高的同源性，因此，將該菌株鑒定為微白黃鏈霉菌(Streptomycesalbidoflavus)。

圖3 菌株G-1基于16S rRNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of strain G-1 based on 16S rRNA sequence

2.5 菌株G-1發(fā)酵液對胡蘿卜黑腐病的盆栽防效

采用盆栽試驗對菌株G-1發(fā)酵液對胡蘿卜黑腐病的盆栽防效進行測定后發(fā)現(xiàn)，菌株G-1發(fā)酵液對該病害具有良好防效，但不同稀釋倍數(shù)之間防效差異顯著，以稀釋50倍和100倍防效較好，其防效分別為73.2%、70.5%(表4)。當(dāng)稀釋倍數(shù)為0時，試驗過程中出現(xiàn)燒苗現(xiàn)象；當(dāng)稀釋倍數(shù)達200倍時，防效出現(xiàn)明顯下降，為54.9%；當(dāng)稀釋倍數(shù)為300倍時，防效出現(xiàn)大幅度下降，防效僅為43.4%。上述結(jié)果表明，在利用菌株G-1發(fā)酵液防治胡蘿卜黑腐病時，稀釋倍數(shù)應(yīng)為100倍左右，既可保持良好防治效果，又不影響胡蘿卜正常生長。

表4 菌株G-1不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液

注：—表示無防效；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: —represent no control effect.Different lower case letters in the same column indicate significant differences(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

生物防治作為一種綠色環(huán)保的病害防治措施，在減少化學(xué)農(nóng)藥使用和緩解化學(xué)農(nóng)藥負面問題方面具有明顯積極意義，因此，近年來備受人們關(guān)注[19]。在眾多生物防治措施中利用微生物或其天然產(chǎn)物防治植物病害的研究較普遍，且已取得一定進展，然而放線菌抗病微生物開發(fā)研究同細菌和真菌相比較薄弱，這可能與放線菌分離較困難有關(guān)。但放線菌作為一類主要抗生素產(chǎn)生菌，應(yīng)用潛力極為明顯[20]，因此，針對胡蘿卜黑腐病病原有良好抑制效果的拮抗放線菌進行了研究，旨在篩選對該病原具有良好抑制作用的拮抗放線菌，為該病害生物防治奠定理論基礎(chǔ)。

本研究通過平板稀釋涂布法，對不同種植區(qū)胡蘿卜表層土中的放線菌進行了分離和純化，發(fā)現(xiàn)不同種植區(qū)放線菌數(shù)量存在一定差異，證明生長環(huán)境對微生物數(shù)量和種類具有重要影響[21-22]。隨后采用平板對峙法，以胡蘿卜黑腐病病原為靶標(biāo)對分離到的15株放線菌抑菌活性進行了測定，發(fā)現(xiàn)15株放線菌中僅有5株表現(xiàn)出抑菌活性，占總數(shù)的1/3，但僅菌株G-1抑菌活性達50%以上，同其他病原拮抗微生物篩選比例相比差異較大，再次表明拮抗放線菌分離難度較大。另外，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所果蔬采后病害生物防治課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，單獨使用平板對峙法篩選會漏篩部分拮抗微生物，這是因為有些微生物在平板上產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的速率較慢，且需要培養(yǎng)一段時間方可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，而此時病原生長較快，拮抗微生物在發(fā)揮作用之前被覆蓋。因此，本研究隨后還采用發(fā)酵培養(yǎng)和生長速率法對15株放線菌的抑菌活性進行了復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)同樣僅有菌株G-1表現(xiàn)出良好的抑菌活性，發(fā)酵液抑菌率為78.5%，而菌株G-6在復(fù)篩過程中發(fā)酵液抑菌率(46.1%)明顯高于平板對峙法(17.9%)。另外，在菌株G-1作用下胡蘿卜黑腐病病原在平板上呈現(xiàn)白色，說明該菌株還對胡蘿卜黑腐病病原孢子的產(chǎn)生具有一定抑制作用，推斷抑制產(chǎn)孢可能是其防病機制之一。

在明確菌株G-1對胡蘿卜黑腐病病原抑菌活性后，采用16S rRNA序列分析對其分類地位進行了研究，發(fā)現(xiàn)菌株G-1同模式菌株StreptomycesalbidoflavusDSM 40455T(NR 116634.1)聚在同一支，將其鑒定為微白黃鏈霉菌(Streptomycesalbidoflavus)。田間試驗或盆栽試驗是評價菌株應(yīng)用潛力的必要手段，為明確菌株G-1的應(yīng)用潛力，隨后采用盆栽試驗對該菌株無菌發(fā)酵液的防病效果進行了測定。結(jié)果表明，菌株G-1無菌發(fā)酵液的最大稀釋倍數(shù)為100倍，在該稀釋倍數(shù)下可保持70.5%的防效。當(dāng)稀釋倍數(shù)為200倍時防效出現(xiàn)明顯下降，防效低于60%。100倍稀釋液防效同已報道的75%百菌清可濕性粉劑600倍液(75.72%)和50%撲海因可濕性粉劑1 500倍稀釋液(73.41%)防效接近[5]，說明S.albidoflavusG-1發(fā)酵液在該病害防治中具有良好應(yīng)用潛力。另外，試驗過程中發(fā)現(xiàn)菌株G-1無菌發(fā)酵液在稀釋倍數(shù)為200倍時防效開始下降，可能與無菌發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)含量較低有關(guān)，而抗菌物質(zhì)含量較低可能與現(xiàn)有發(fā)酵條件有關(guān)，后期還需進一步對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

本研究成功篩選出了對胡蘿卜黑腐病病原具有良好抑制作用的拮抗放線菌G-1，但所有數(shù)據(jù)均來自室內(nèi)平板測定和盆栽試驗，有關(guān)其抗菌物質(zhì)種類、發(fā)酵條件優(yōu)化、生物菌劑研發(fā)和田間應(yīng)用效果等后續(xù)還需進一步研究，從而為該病害的生物防治和該菌株生防制劑的開發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。