基于SDS-PAGE與熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)的黃淮麥區(qū)小麥品種(系)HMW-GS組成分析

賈琳琳，王永霞，靳曉杰

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物設(shè)計(jì)中心，河南 鄭州 450002)

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，人們對(duì)小麥品質(zhì)的要求越來(lái)越高，小麥品質(zhì)改良已成為小麥育種工作的重要研究方向。在影響小麥品質(zhì)的眾多因素中，高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)對(duì)小麥面粉加工品質(zhì)起關(guān)鍵作用[1-2]，其組成已成為品質(zhì)育種中親本選配和雜交后代選擇的重要依據(jù)。HMW-GS由第一部分同源染色體長(zhǎng)臂上的Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位點(diǎn)編碼[3]。每個(gè)位點(diǎn)都含有2個(gè)緊密連鎖基因，分別編碼分子質(zhì)量較大的x型和分子質(zhì)量較小的y型亞基。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名的亞基超過(guò)40種。公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)HMW-GS有1、2*、7+8、14+15、13+16、5+10等，優(yōu)質(zhì)亞基組合有1/14+15(13+16)/5+10、1/7+8/5+10、1/17+18/2+12等[4-8]。研究表明，我國(guó)小麥品種的HMW-GS組成較豐富，但優(yōu)質(zhì)亞基頻率較低，同時(shí)含有多個(gè)優(yōu)質(zhì)亞基組合的品種也較少，品質(zhì)仍較差[9-11]。因此，篩選含有優(yōu)質(zhì)HMW-GS和亞基組合的材料成為提高小麥面粉加工品質(zhì)的關(guān)鍵。

檢測(cè)小麥HMW-GS的方法主要有SDS-PAGE[5]、分子標(biāo)記[12]和高效毛細(xì)管電泳[13]等。其中，SDS-PAGE是最常用的方法，并得到了廣泛應(yīng)用，分子標(biāo)記可輔助SDS-PAGE有效鑒定HMW-GS多樣性。分子標(biāo)記可以直接對(duì)HMW-GS 基因進(jìn)行檢測(cè)，不受植株發(fā)育時(shí)期、取材部位的限制，具有其獨(dú)特的優(yōu)越性。編碼HMW-GS的基因具有高度的同源性，每個(gè)基因位點(diǎn)都存在大量的等位變異，不同等位基因之間的差異由DNA序列的重復(fù)和缺失造成。國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者根據(jù)其特點(diǎn)設(shè)計(jì)出特異性、保守性引物，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)HMW-GS基因[14-17]。LEI等[14]針對(duì)Glu-B1位點(diǎn)編碼區(qū)域DNA序列變異設(shè)計(jì)出特異性引物，可有效鑒定By7、By8、By9基因。LIU等[15]在前人研究的基礎(chǔ)上，在Glu-A1、Glu-D1位點(diǎn)上設(shè)計(jì)出共顯性標(biāo)記UMN19、UMN25、UMN26，可分別鑒定Ax2*、Ax1、null，Dx2、Dx5，Dy10、Dy12基因。此外，已開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的基因還有Bx7*、Bx7OE、By8*、By16等[16]。毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè)法是一種快速、準(zhǔn)確、高效的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，能極大提高工作效率，增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。鄭永勝等[17-18]利用該方法建立了小麥品種DNA指紋鑒定體系，并利用81個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)96份小麥品種進(jìn)行了相似度分析。目前，將凝膠電泳與分子標(biāo)記相結(jié)合進(jìn)行小麥HMW-GS檢測(cè)的研究很少，且分子標(biāo)記檢測(cè)的方法均為瓊脂糖凝膠電泳[19-21]，而同時(shí)使用SDS-PAGE和毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，利用SDS-PAGE和熒光標(biāo)記法同時(shí)對(duì)91份黃淮麥區(qū)小麥品種(系)的HMW-GS組成進(jìn)行分析，以期為黃淮麥區(qū)小麥品質(zhì)改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為91份黃淮麥區(qū)小麥品種(系)，包括68份品種和23份品系(表1)，分別來(lái)自河南省、河北省、山東省等地，以中國(guó)春(Null/7+8/2+12)、師欒02-1(1/7+9/5+10)、石4185(1/14+15/2+12)為對(duì)照材料。其中，師欒02-1和石4185由河北省農(nóng)林科學(xué)院張穎君惠贈(zèng)，其余材料均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物設(shè)計(jì)中心提供。

表1 小麥品種(系)名稱及來(lái)源Tab.1 Wheat varieties(lines) name and source

續(xù)表1 小麥品種(系)名稱及來(lái)源Tab.1(Continued) Wheat varieties(lines)name and source

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HMW-GS 提取 HMW-GS樣品提取參考PENG等[22]的方法。每份樣品取10粒種子磨粉后，稱取20 mg 置于2 mL 離心管中，加入1 mL樣品提取液[62.5 mmol/L Tris-HCl (pH值6.8)、0.002%溴酚藍(lán)、10%甘油、1.5%二硫蘇糖醇、2% SDS]65 ℃水浴浸提30 min，渦旋5 min，取出冷至室溫，9 000×g離心5 min，取上清保存于4 ℃冰箱。

1.2.2 SDS-PAGE電泳 采用10%(pH值 8.8)的分離膠和4%(pH 值6.8)的堆積膠，用甘氨酸溶液為電極緩沖液，單板電流15 mA，電壓100 V，電泳8 h，用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色過(guò)夜，蒸餾水脫色至條帶清晰，拍照保存。參照 PAYNE等[23]的亞基命名及編號(hào)方法對(duì)亞基進(jìn)行記錄。

1.2.3 毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè) 采用CTAB法從幼苗葉片中提取供試材料的基因組DNA。PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL：dNTPs(25 mmol/L)0.15 μL、上游引物(10 μmol/L)0.15 μL、下游引物(10 μmol/L)0.3 μL、M13熒光標(biāo)記引物(10 μmol/L)0.15 μL、Taq酶 0.15 μL、10×Buffer 1 μL、模板60 ng，用去離子水補(bǔ)足至10 μL。本研究涉及的引物為UMN19、UMN25、UMN26，其中上游引物前端加有M13的尾巴序列(5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′)，由生工(上海)生物工程有限公司合成，M13熒光標(biāo)記引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成(表2)。

表2 熒光標(biāo)記引物信息Tab.2 The information of fluorescent labeled primers

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler?pro 384擴(kuò)增儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增程序參照LIU等[15]的方法。PCR結(jié)束后，每孔加7 μL甲酰胺于95 ℃變性5 min，在ABI 3500XL上進(jìn)行熒光檢測(cè)，結(jié)果利用Genograper 2.1軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 品質(zhì)評(píng)分和聚類分析 HMW-GS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照宋建民等[24]的方法，目的條帶存在時(shí)賦值為1，不存在時(shí)賦值為0，根據(jù)1、0數(shù)據(jù)構(gòu)建矩陣，計(jì)算遺傳相似系數(shù)，利用軟件NTSYS 2.1中UPGMA進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于SDS-PAGE檢測(cè)的小麥品種(系)HMW-GS組成分析

SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，供試小麥材料共含有14種HMW-GS類型，表現(xiàn)出豐富的變異(表3—4)。Glu-A1位點(diǎn)上共有1、Null、2*三種亞基類型，出現(xiàn)頻率分別為59.34%、37.36、3.30%。Glu-B1位點(diǎn)上共有5種亞基類型，分別為7、7+8、7+9、13+16、14+15。其中，7+8的頻率最高(52.75%)，其次為7+9(25.27%)，攜帶稀有亞基7、13+16、14+15的材料有19份。Glu-D1位點(diǎn)亞基變異較豐富，共出現(xiàn)6種亞基類型，除所占比例較高的2+12和5+10亞基外，還有10、12、3+12、4+12稀有亞基，特別是3+12和4+12亞基，累計(jì)出現(xiàn)比例高達(dá)21.98%，說(shuō)明近年來(lái)更多的亞基類型被用于小麥品質(zhì)改良育種。

2.2 基于熒光標(biāo)記檢測(cè)的小麥品種(系)HMW-GS組成分析

熒光標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果(部分結(jié)果見(jiàn)圖1)顯示，91份供試小麥材料中含Ax1、Null基因的材料較多，含Ax2*基因的材料有3份；含Dx2、Dx5基因的材料各有42、27份，比例分別為46.15%、29.67%；周麥18等63份材料含有Dy12基因，28份材料含有Dy10基因。綜上，熒光標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果相吻合，說(shuō)明亞基特異性分子標(biāo)記可準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)小麥中HMW-GS基因。

表3 基于SDS-PAGE檢測(cè)的91份小麥品種(系)的HMW-GS組成分析

續(xù)表3 基于SDS-PAGE檢測(cè)的91份小麥品種(系)的HMW-GS組成分析

表4 基于SDS-PAGE檢測(cè)的小麥品種(系)HMW-GS等位變異及頻率分析Tab.4 Allelic variation and frequency analysis of HMW-GS in 91 wheat varieties (lines) based on SDS-PAGE

1—18為品種(系)編號(hào)(同表1)1—18 are varieties(lines)number(the same as Tab.1)

2.3 小麥品種(系)HMW-GS組合及其頻率、品質(zhì)分析

由表5可知，在91份供試小麥材料中，共檢測(cè)出28種HMW-GS組合，表現(xiàn)出豐富的HMW-GS組成多樣性。其中，適合制作面包的優(yōu)質(zhì)亞基組合類型1/7+8/5+10出現(xiàn)頻率最高，為14.29%；其次是適合制作優(yōu)質(zhì)手工饅頭的亞基組合1/7+8/2+12和Null/7+8/2+12，均為12.09%；15個(gè)亞基組合出現(xiàn)頻率較低，均為1.10%。

由表5可知，供試材料得分介于5.5～11.0，平均得分為7.78，由于10、12亞基的品質(zhì)評(píng)分未見(jiàn)報(bào)道，暫不對(duì)含有這些亞基的組合進(jìn)行評(píng)分，且含有這2個(gè)亞基的材料均只有1份，對(duì)總體評(píng)分影響不大。Null/13+16/5+10組合得分最高(11.0分)，分別來(lái)自泉麥28、小偃6號(hào)、龍科1109。品質(zhì)評(píng)分在9分及以上的亞基組合有1/13+16/2+12、1/7+8(7+9)/5+10、Null/13+16/2+12、Null/14+15/5+10。

表5 供試小麥品種(系)HMW-GS組合類型及其頻率、品質(zhì)得分

2.4 基于HMW-GS的小麥品種(系)聚類分析

由圖2可知，在遺傳相似系數(shù)為0.42時(shí)，可以將供試材料分為4大類：第Ⅰ類包括03中42、衡562、滄麥6001、泉麥28，小偃6號(hào)和龍科1109等6份材料，其Glu-B1位點(diǎn)上的亞基類型為13+16，亞基組合所得品質(zhì)評(píng)分相對(duì)較高；第Ⅱ類包括2份材料，分別為良星66和平安11，其Glu-B1位點(diǎn)上的亞基類型為稀有亞基14+15；第Ⅲ類包括22個(gè)材料，其Glu-D1位點(diǎn)上的亞基類型為優(yōu)質(zhì)亞基 5+10，該類集中了大部分強(qiáng)筋小麥材料，如新麥26、鄭麥7698和鄭麥366等；第Ⅳ類可以分為3個(gè)亞類，第一亞類包括28份材料，第二亞類包括7份材料，第三亞類包括23份材料。

圖2 基于HMW-GS的91個(gè)小麥品種(系)的聚類分析

3 結(jié)論與討論

黃淮麥區(qū)是我國(guó)小麥的主產(chǎn)區(qū)，該區(qū)域小麥HMW-GS等位基因和亞基組合的多態(tài)性較豐富，但分布均嚴(yán)重不均。優(yōu)質(zhì)亞基5+10和14+15所占比例有所提高，但優(yōu)質(zhì)亞基組合所占比例仍然很低[25]。麻珊珊等[26]對(duì)參加黃淮麥區(qū)南片冬、春小麥預(yù)備試驗(yàn)的143個(gè)小麥新品種(系)HMW-GS組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了10種等位基因和15種亞基組合，對(duì)加工品質(zhì)具有正效應(yīng)的優(yōu)質(zhì)亞基1出現(xiàn)的頻率為59.44%，14+15出現(xiàn)頻率為13.99%，5+10出現(xiàn)頻率為37.06%，謝科軍等[27]、李立等[28]研究結(jié)果與之相似。本研究也得到相似的結(jié)果，在隨機(jī)選取來(lái)源不同的小麥品種(系)中，優(yōu)質(zhì)亞基1(59.34%)和5+10(29.67%)出現(xiàn)頻率依然較高，14+15出現(xiàn)頻率則沒(méi)有提高。本研究中除檢測(cè)到1、7+8、2+12、5+10等所占比例較高的亞基外，還發(fā)現(xiàn)一些稀有優(yōu)質(zhì)亞基，如2*、13+16、14+15等，極大地豐富了黃淮麥區(qū)小麥的HMW-GS類型，說(shuō)明近年來(lái)人們開(kāi)始注重不同優(yōu)質(zhì)亞基材料的引進(jìn)、篩選和利用。供試材料的平均品質(zhì)得分較張瑞奇等[29]研究結(jié)果有所提高，品質(zhì)評(píng)分在9.0分及以上的亞基組合有1/13+16/2+12、1/7+8(7+9)/5+10、Null/13+16/2+12、Null/14+15/5+10。其中，Null/13+16/5+10亞基組合出現(xiàn)頻率較低(3.30%)，但它們的品質(zhì)評(píng)分最高(11.0分)；優(yōu)質(zhì)亞基組合1/7+8/5+10出現(xiàn)品頻率最高(14.29%)，其品質(zhì)評(píng)分高達(dá)9.5分。小麥的品質(zhì)育種過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)優(yōu)異種質(zhì)的利用，本研究所篩選出來(lái)的含有1、2*、5+10、13+16、14+15等優(yōu)質(zhì)亞基和亞基組合的品種(系)可作為雜交親本和轉(zhuǎn)育材料，用于黃淮麥區(qū)小麥定向品質(zhì)改良育種。

SDS-PAGE是分離檢測(cè)HMW-GS最常用的方法，在國(guó)內(nèi)各育種單位得到了廣泛應(yīng)用，對(duì)加速小麥品質(zhì)育種做出很大的貢獻(xiàn)。SDS-PAGE法具有一定的局限性，如需要用收獲后的籽粒作為材料，且電泳圖譜上亞基的遷移率與分子質(zhì)量并不總是一致，從而混淆分子質(zhì)量不同而遷移率相似的亞基等。利用分子標(biāo)記進(jìn)行HMW-GS鑒定，克服了SDS-PAGE方法的局限性，可在不同的生育時(shí)期進(jìn)行取樣，可以快速大量地檢測(cè)相關(guān)基因，因而受到了廣泛的重視。白升升等[21]利用分子標(biāo)記有效鑒定了遷移率相近的7、7*與7OE,8與8*亞基，準(zhǔn)確分析了小麥HMW-GS類型。本研究中分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果相吻合，說(shuō)明利用分子標(biāo)記技術(shù)可有效鑒定材料中HMW-GS。此外，本研究采用的毛細(xì)管電泳熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，相比之前的瓊脂糖凝膠電泳和普通的SDS-PAGE，具有高通量、高靈敏度、分析過(guò)程自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模材料的分析研究。試驗(yàn)過(guò)程中合理搭配擴(kuò)增片段差異較大的同種熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)多熒光多目的片段PCR產(chǎn)物的同時(shí)檢測(cè)，提高基因型鑒定效率，有效降低了鑒定成本。