王少群,邱丹騰,林春通,張紅,劉樹滔
(1.廈門信道生物技術(shù)有限公司,福建 廈門 361026;2.福州大學(xué)生物工程研究所,福建 福州 350108)
膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)單元是原膠原,由具有3條左手螺旋α肽鏈相互纏繞形成的右手螺旋結(jié)構(gòu)的一類蛋白質(zhì)[1]。因其含量豐富,來源廣泛,水解產(chǎn)物具有多種生物活性功能,廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、生物醫(yī)療等各個領(lǐng)域。
膠原蛋白飲料是通過添加膠原蛋白源(如膠原蛋白、膠原蛋白肽),并對其它各個組分調(diào)配形成的一種功能性飲料。對它的研究很多,主要為保健膠原蛋白飲料,如生姜-膠原蛋白[2]、木瓜-膠原蛋白[3]、枸杞子-膠原蛋白[4]、大棗-膠原蛋白[5]等,但多以配方優(yōu)化為主,鮮有健康功能性研究。通過對京東(https://www.jd.com/)和淘寶(https://www.taobao.com/)的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)膠原蛋白飲料多為果味飲料,產(chǎn)品風(fēng)味欠佳,功能效果有限。
發(fā)酵果汁是由乳酸菌/酵母菌等益生菌對果汁的發(fā)酵而形成的營養(yǎng)食品,風(fēng)味獨(dú)特,且具有新的營養(yǎng)和保健功能[6]。國內(nèi)外對發(fā)酵果汁飲料的研究很多,主要分為:⑴各種果蔬為主的發(fā)酵果汁飲料[7-9];⑵不同菌種形成的單菌種發(fā)酵果汁或多菌種混合發(fā)酵果汁飲料[10,11];⑶搭配藥食同源食材的發(fā)酵果汁飲料[12,13];⑷少數(shù)搭配動物源食材(如:膠原蛋白)的發(fā)酵果汁飲料[14]。然而,通過發(fā)酵果汁與膠原蛋白的組合以改善產(chǎn)品風(fēng)味,提升功能效果的研究較少。
為了使膠原蛋白飲料更容易為市場所接受,本文以膠原蛋白肽為原料,添加發(fā)酵果汁和其它輔料,研制口味良好、功能多樣的發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料。
海嬌-膠原蛋白肽凍干粉:購自上海利統(tǒng)生化制品有限公司;保和堂-膠原蛋白果汁飲料:上海葡萄王企業(yè)有限公司;天然派-膠原蛋白果汁飲品:深圳市天然派生物科技有限公司;依蓮-膠原蛋白液態(tài)飲品:上海中邦斯瑞生物藥業(yè)技術(shù)有限公司;益盛漢參-膠原蛋白肽果汁飲品:時代生物科技(深圳)有限公司;Lumi-膠原蛋白液態(tài)飲品:大江生醫(yī)股份有限公司;日本芳珂-膠原蛋白果汁飲料:日本FANCL株式會社。
表1 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料配方表 單位:g
發(fā)酵紅棗濃縮汁、發(fā)酵復(fù)合莓汁、發(fā)酵木瓜汁、發(fā)酵蘋果汁、發(fā)酵檸檬汁、藍(lán)莓濃縮汁、發(fā)酵西柚汁、發(fā)酵蘋果濃縮果汁等:購自福建綠泉食品有限公司。
阿斯巴甜、檸檬酸、蘋果酸、果膠、黃原膠等食品添加劑:購自廈門榮新盛食品有限公司;T-AOC試劑盒、總蛋白定量測試盒(雙縮脲法):南京建成生物工程有限公司;其余藥品均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
U-1900型紫外-可見分光光度計、CF15RX型高速離心機(jī):日本日立公司;
恒溫水浴鍋:上海精宏實驗設(shè)備有限公司。
詳細(xì)配方見表1。
1.4.1 飲料的口味確定
1.4.1.1 感官評價方法及標(biāo)準(zhǔn)
評價項目及評價標(biāo)準(zhǔn)見表2,等級劃分標(biāo)準(zhǔn)見表3,評價流程如下:
對發(fā)酵果汁飲料作隨機(jī)編號→準(zhǔn)備干燥、潔凈的杯子對應(yīng)發(fā)酵果汁飲料編號→組織10個人感官評價小組,品嘗發(fā)酵果汁飲料并作評價。
1.4.1.2 不同品牌膠原蛋白飲料的感官評價
選擇6款市面上典型的膠原蛋白飲料作感官評價,分別為:
⑴ 保和堂-膠原蛋白果汁飲料;⑵ 天然派-膠原蛋白果汁飲品;⑶ 依蓮-膠原蛋白液態(tài)飲品;⑷ 益盛漢參-膠原蛋白肽果汁飲品;⑸ Lumi-膠原蛋白液態(tài)飲品;⑹ 日本芳珂-膠原蛋白果汁飲料。
1.4.1.3 不同口味發(fā)酵果汁的感官評價
選擇5種不同風(fēng)味的發(fā)酵果汁,包括:
表2 感官評價評分標(biāo)準(zhǔn)
表3 感官評價等級劃分標(biāo)準(zhǔn)
⑴ 發(fā)酵紅棗濃縮汁;⑵ 發(fā)酵復(fù)合莓汁;⑶ 發(fā)酵木瓜汁;⑷ 發(fā)酵蘋果汁;⑸ 發(fā)酵檸檬汁。
分別稀釋5倍后,做感官評價。
1.4.1.4 不同口味發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的感官評價
按照1.3飲料配方分別調(diào)配成發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料,并做感官評價。
1.4.2 飲料的制備
按照常規(guī)的果汁飲料工藝流程制備發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料。
1.4.3 飲料的產(chǎn)品質(zhì)量分析
由福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量分析,檢測項目包括:可溶性固形物(20 ℃ 折光計法);總酸(以檸檬酸計);菌落總數(shù);大腸桿菌;沙門氏菌;金黃色葡萄球菌;霉菌;酵母菌。
1.4.4 飲料的抗氧化能力測試
1.4.4.1 鹽酸羥胺法
采用黃嘌呤氧化酶(羥胺法)測定樣品對·O2-的清除能力,步驟按照論文[15]所述的SOD酶活測定方法。
式中,A2—空白組吸光值;A1—樣品組吸光值。
1.4.4.2 鐵離子還原法
抗氧化物質(zhì)能使反應(yīng)體系的Fe3+還原成Fe2+,可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的有色絡(luò)合物,可根據(jù)比色法測定。步驟參照總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒。
1.4.4.3 DPPH自由基清除法采用DPPH法測定樣品對DPPH·的清除能力[16]。
式中,A2—空白組吸光值;A1—樣品組吸光值。
1.4.5 飲料的體外消化率測試
根據(jù)蛋白質(zhì)/多肽都具有雙縮脲反應(yīng),本文以雙縮脲法測定樣品的膠原蛋白肽含量,以反應(yīng)飲料在體內(nèi)被胃/腸道消化利用的程度。
模擬胃液/腸液配方——參照美國藥典[18]。
模擬胃液:NaCl 2.0 g,胃蛋白酶3.2 g,HCl 7.0 mL,用ddH2O定容至1000 mL。
模擬腸液:
A液:KH2PO4 6.8 g,ddH2O 500 mL,用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8;
B液:胰蛋白酶10 g,加入適量ddH2O使溶解;
A、B液邊攪拌邊混勻,用ddH2O定容至1000 mL。
樣品制備:取樣品(60 mg/mL,50 mL)加入500 mL模擬胃液/腸液,37 ℃水浴,分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h取出2 mL×3組作為待測溶液。
步驟:參照總蛋白定量測試盒(雙縮脲法),蛋白質(zhì)含量用C表示。
式中,C0—未消化時的蛋白質(zhì)濃度;C1—不同消化時間的蛋白質(zhì)濃度。
1.4.6 飲料的抗疲勞能力測試
⑴ 負(fù)重游泳實驗[19]:
對小鼠(約28 g)進(jìn)行樣品灌胃,0.5 h后,4個水桶分別放入6只尾部負(fù)荷5%體質(zhì)量鉛皮的小鼠,使其于水溫為28 ℃、直徑為35 cm、高32 cm的水桶中游泳。小鼠沉入水中連續(xù)3次,每次如果超過10 s無法重新浮出水面稱為力竭。游泳開始至力竭的時間,為負(fù)重游泳時間。
⑵ 文獻(xiàn)表明[20],超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)對機(jī)體具有抗疲勞能力,故作為陽性對照。
⑶ 給藥量:對照組灌胃生理鹽水0.24 mL,SOD組灌胃SOD(400 U/mL)0.24 mL,木瓜飲料組和復(fù)合莓飲料組灌胃每只0.24 mL,見表4。
式中,T0—空白組的負(fù)重游泳時間;T1—不同樣品組的負(fù)重游泳時間。
采用origin 9.0、excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
2.1.1 不同品牌膠原蛋白飲料的感官評價
圖1 不同品牌膠原蛋白飲料感官評價結(jié)果
感官評定總分中(圖1),保和堂和芳珂屬于B級,依蓮、益盛漢參、Lumi屬于C級,天然派屬于D級,沒有一個品牌達(dá)到A級;口感+氣味中,保和堂、益盛漢參屬于C級,天然派、依蓮屬于D級,芳珂屬于B級,沒有一個品牌達(dá)到A級。所以,不同品牌膠原蛋白飲料的感官評價皆未能達(dá)到最佳等級。
2.1.2 不同口味發(fā)酵果汁的感官評價
為研制較佳口味膠原蛋白飲料,需要尋找較佳口味的發(fā)酵果汁作基礎(chǔ)。
圖2 不同口味發(fā)酵果汁感官評價結(jié)果
感官評定總分中(圖2),發(fā)酵紅棗濃縮汁、發(fā)酵蘋果汁、發(fā)酵檸檬汁屬于C級,發(fā)酵復(fù)合莓汁、發(fā)酵木瓜汁都屬于B級;口感+氣味中,發(fā)酵紅棗濃縮汁、發(fā)酵木瓜汁屬于B級,發(fā)酵復(fù)合莓汁屬于A級,發(fā)酵蘋果汁、發(fā)酵檸檬汁都屬于C級。在感官評價總分/口感氣味中,不同口味的發(fā)酵果汁的評分等級主要分布為B、C級水平,但還未達(dá)到最佳A級,而發(fā)酵蘋果汁的評分最差。
綜上,選擇發(fā)酵紅棗濃縮汁、發(fā)酵復(fù)合莓汁、發(fā)酵木瓜汁、發(fā)酵檸檬汁為發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的后續(xù)實驗的果汁基礎(chǔ)。
2.1.3 不同口味發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的感官評價
按照1.3飲料配方調(diào)配成發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料,以膠原蛋白液、芳珂膠原蛋白飲料做對比,通過感官評價選擇最受歡迎的2種果汁飲料。
圖3 不同口味發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料感官評價結(jié)果
由圖3可得,隨著膠原蛋白含量的增加,膠原蛋白飲料的感官評價分?jǐn)?shù)呈降低的趨勢。這是因為加入越多的膠原蛋白肽,果汁的香味越難以掩蓋魚皮膠原蛋白特有的腥臭味,進(jìn)而影響飲料的風(fēng)味;從感官評價總分/口感氣味分?jǐn)?shù)看,發(fā)酵木瓜型和發(fā)酵復(fù)合莓型2種口味的飲料略受歡迎,即便與芳珂膠原蛋白飲料對比,亦相差不大。
因此,選擇發(fā)酵木瓜和發(fā)酵復(fù)合莓膠原蛋白果汁飲料作后續(xù)配方優(yōu)化。
為達(dá)到最佳的口感、色澤以及滿足人體每日對膠原蛋白的需求,經(jīng)糖酸比(酸∶檸檬酸+蘋果酸)、膠原蛋白肽含量優(yōu)化,飲料配方最終確定如表5。
2種飲料的最佳配方為:
⑴ 發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料根據(jù)表1調(diào)配,且糖酸比38∶1(糖∶檸檬酸∶蘋果酸=25∶0.35∶0.3=90∶1.26∶1.08),膠原蛋白肽含量6%;
⑵ 發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料根據(jù)表1調(diào)配,糖酸比18∶1(糖∶檸檬酸∶蘋果酸=25∶0.8∶0.6=90∶2.88∶2.16),膠原蛋白肽含量6%。
表5 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料配方表 單位:g
發(fā)酵木瓜/復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料的pH值分別為4.32和4.14,均小于4.5,屬于酸性飲料。經(jīng)巴氏滅菌法(90 ℃,15 min)滅菌后的產(chǎn)品質(zhì)量分析如表6。參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.2-2016,檢驗結(jié)果顯示各項指標(biāo)均為合格。
表6 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的產(chǎn)品質(zhì)量分析
圖4 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的抗氧化能力
通過3種方法檢測發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的抗氧化能力,一定程度的表明其生物活性,結(jié)果如圖4所示。
由圖4可得:
⑴ 2種發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料和膠原蛋白肽都具有一定程度的抗氧化能力。
⑵ 三種樣品的抗氧化能力(用K表示)順序:K發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料>K發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料>K膠原蛋白肽。
⑶ 膠原蛋白肽的基礎(chǔ)上,添加發(fā)酵木瓜/復(fù)合莓果汁,有助于抗氧化能力的增加。
生物蛋白質(zhì)屬于大分子物質(zhì),在進(jìn)入人體胃/腸道內(nèi),一般被降解消化成小分子物質(zhì),才易被吸收,且分子越小,越容易被吸收。所以,通過檢測發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的體外消化率,一定程度反應(yīng)飲料在胃/腸道內(nèi)的吸收情況。體外消化率如圖5所示。
圖5 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的體外消化率
發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料、發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料、膠原蛋白肽、BSA在模擬胃/腸液體系中的消化結(jié)果,有著大致相同的結(jié)論。
⑴ 隨著消化時間延長,胃/腸道體系對樣品的體外消化率總體上呈現(xiàn)上升趨勢,即蛋白質(zhì)/多肽被降解成更小分子。
⑵ 在胃/腸液體系,發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料和發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料的消化率(用D表示)比膠原蛋白肽的消化率稍高,即D發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料≈D發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料≥D膠原蛋白肽,表明發(fā)酵木瓜/復(fù)合莓果汁的添加,有助于膠原蛋白肽的降解消化,更加有利于人體吸收。
⑶ 各樣品在腸液中的消化率比在胃液中的消化率顯著較高,說明樣品的消化吸收可能主要發(fā)生在腸道環(huán)境。
圖6 發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料的抗疲勞能力
灌胃SOD、發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料、發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料的小鼠抗疲勞能力都有顯著提高(p<0.05),抗疲勞能力排序為:F發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料>FSOD>F發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料>50%。
⑴ 以發(fā)酵木瓜/復(fù)合莓口味作為飲料的果汁基礎(chǔ)口感最好,其中:最適糖酸比分別為38∶1和18∶1;膠原蛋白肽含量皆為6%。
⑵ 飲料的抗氧化實驗:2種果汁飲料皆具有抗氧化活性,其順序為:K發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料>K發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料>K膠原蛋白肽,說明在膠原蛋白肽的基礎(chǔ)上,添加發(fā)酵木瓜/復(fù)合莓果汁有助于抗氧化能力的增加。
⑶ 飲料的體外消化率實驗:飲料的體外消化率D發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料≈D發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料≥D膠原蛋白肽,表明發(fā)酵木瓜/復(fù)合莓果汁的添加,有助于膠原蛋白肽的降解消化,更加有利于人體吸收。
⑷ 飲料的抗疲勞實驗:灌胃2種飲料皆能顯著提高小鼠的抗疲勞能力(p<0.05),抗疲勞能力排序為:F發(fā)酵復(fù)合莓果汁膠原蛋白飲料>F發(fā)酵木瓜果汁膠原蛋白飲料>50%。
所以,在體外消化率相當(dāng)?shù)幕A(chǔ)上,小鼠的抗疲勞能力與飲料的抗氧化能力呈正相關(guān)。
綜上,本文研制的發(fā)酵果汁膠原蛋白飲料具有口感好、生物活性功能多樣的特點(diǎn),可望為市場所接受。