定量PCR檢測(cè)TRAF3通路基因變化在青黃散治療骨髓增生異常綜合征中的機(jī)制*

唐旭東，張 路，楊秀鵬，唐玉鳳，王德秀

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院血液科，北京 100091；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)管理學(xué)院，北京 100029；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100091；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029）

骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組起源于造血干/祖細(xì)胞的惡性克隆性腫瘤性疾病，特點(diǎn)是由于凋亡增加而導(dǎo)致無效造血以及外周血細(xì)胞減少，并具有最終向白血病轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。近年來，MDS的發(fā)病率呈現(xiàn)逐步增高的趨勢(shì)，并成為嚴(yán)重危脅中老年人生命和生活質(zhì)量的主要惡性腫瘤之一。但到目前為止，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)本病尚無特效療法，以化療為中心的治療方式費(fèi)用昂貴，部分患者出現(xiàn)較嚴(yán)重的不良反應(yīng)或生命危險(xiǎn)，生活質(zhì)量低下，且生存期較短。尋找新的治療MDS的途徑和藥物一直是本領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)課題。本科室從事中西醫(yī)結(jié)合治療MDS 20余年，針對(duì)MDS毒瘀內(nèi)阻的病機(jī)本質(zhì)，以青黃散為主，以解毒化瘀為法，明顯提高了生活質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期[1-6]。

MDS患者存在抑癌基因高度甲基化[7]，DNA甲基化與MDS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，是MDS向急性白血病進(jìn)展的主要機(jī)制[8]。前期的研究，青黃散（每粒0.3 g，含青黛0.2 g、雄黃0.1g，西苑醫(yī)院藥廠提供），每日1粒，晚飯后口服。治療后MDS患者DNA甲基化程度顯著減低，提示含砷中藥治療的主要作用機(jī)制是去甲基化，青黃散可能通過調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)生物學(xué)途徑等發(fā)揮作用[9]。目前國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)的研究青黃散等砷劑作用于MDS的過度甲基化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TRAF3）基因機(jī)制研究，本研究以明雄黃和靛玉紅（青黛提取物）模擬青黃散，通過Q-PCR探討人骨髓增生異常綜合征細(xì)胞（MUTZ-1）在明雄黃和靛玉紅（青黛提取物）組合干預(yù)后TRAF3通路基因基因的變化，從而揭示青黃散治療MDS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 試劑 GoScriptReverse Transcription System A5001（Promega公司）；GoTaq qPCR Master Mix A6001（Promega公司）；RQ1Rnase-FreeDnaseM610A（Promega公司）

1.1.2 儀器 Millipore超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司），CFX96 Q-PCR儀（BIO-RAD公司），-80℃冰箱（Thermo公司）。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) GAPDH的上游引物：5’TCATTGACCTCAACTACATGG3’，下游引物：TCGCTCCTGGAAGATGGTG；TRAF3的上游引物：5’CAAGTGGCTCGGAACACAG3’，下游引物：5’CACTCAGCATCTGGTCATGC3’；RIP 的上游引物：5’GTGTACAAGGGGCCCAACT3’，下游引物：5’CGGCTGTGTCTCAGTCTGTT3’；IRF3 的上游引物：5’CCTCTCCGGACACCAATG3’，5’CCCAGTAACTCC AGAATGTC3’；IFN-γ 的上游引物：5’GGCATTTT GAAGAATTG GAAAG3’，5’TTTGGATGCTCTGGTCATCTT3’；IL-10的上游引物：5’GATGCCTTCAGCAGAGTGAA3’，下游引物：5’GCAACCCAGGTAACCCTTAAA3’。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

1.2.1 MUTZ-1細(xì)胞復(fù)蘇 MUTZ-1細(xì)胞株的培養(yǎng)基為RPMI1640液，其含10%的滅活胎牛血清。培養(yǎng)條件為5%二氧化碳（CO2），溫度為37℃。從液氮罐中取出冷凍管；迅速放入37℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，在2 min內(nèi)使其完全融化，然后在無菌下取出細(xì)胞；在1 000 r/min速度下離心5 min，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度2×105/L，體積為5 mL，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)。

1.2.2 MUTZ-1細(xì)胞換液、傳代與細(xì)胞凍存 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)瓶，放在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；用吸管吸取細(xì)胞及培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，輕輕吹打混勻細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞密度為7×105/mL；離心，1 000 r/min，5 min；棄掉原培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液5 mL，并輕輕吹打細(xì)胞，使之均勻懸??；吸取1．4 mL細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶中，加入3．6 mL新鮮培養(yǎng)液，吹打數(shù)次；放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；剩余細(xì)胞懸液置于離心管中離心（1 000 r/min，5 min）；去上清液，加入與1 mL的凍存液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，并轉(zhuǎn)移至凍存管中；冷存管置于4℃10 min、-20℃30 min、-80℃隔夜后，置于液氮罐中長(zhǎng)期儲(chǔ)存；記錄每一個(gè)冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時(shí)能夠找到每一個(gè)冷凍管。

1.2.3 細(xì)胞的藥物處理

1.2.3.1 藥物配置 AS2S2母液配置：取適量AS2S2溶解于1 mol/L的氫氧化鈉（NaOH）溶液中，然后用鹽酸（HCL）調(diào)節(jié)使溶液的 pH 計(jì)達(dá) 7．35～7．45，最終儲(chǔ)存液濃度達(dá)0．5 mmol/L。使用時(shí)用蒸餾水稀釋至工作濃度。

靛玉紅母液配置：取適量靛玉紅溶解于1 mol/L的二甲基亞砜（DMSO）溶液中，制成儲(chǔ)存液濃度達(dá)5 mmol/L。使用時(shí)用DMSO稀釋至工作濃度。

1.2.3.2 藥物處理 調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/mL，10 mL，輕輕吹打100次左右，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，按照20萬(wàn)/mL的接種密度，充分混勻后，用排槍吸取96 μL懸液至孔中，每孔2 mL。邊緣孔用無菌水填充100 μL。準(zhǔn)備將96孔板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。3 d后從CO2培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔加入10 μL的WST-8，放回培養(yǎng)箱并培養(yǎng)2 h。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在460 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)做3次。

進(jìn)行分組及加藥處理：A組為空白對(duì)照，B組為雄黃組（濃度1μmol/L），C組為雄黃（濃度 1 μmol/L）+低劑量靛玉紅（濃度0．05 μmol/L）組，D組為雄黃（濃度 1 μmol/L）+高劑量靛玉紅（濃度 50 μmol/L）組。見表1。

表1 分組及具體加藥情況Tab.1 Grouping and specific dosing situation

1.3 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

1.3.1 RNA抽提

1.3.1.1 RNA沉淀 從-80℃冰箱中取出樣品，每個(gè)樣品加入750 μL TrIzol Reagent，用槍吹打數(shù)次，室溫放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；每1 000 μL Trizol加 200 μl氯仿，蓋好管蓋，用手快速震蕩15 s，室溫放置3 min；4℃12 000 rpm離心15 min，樣品會(huì)分成3層。將上清液移入一個(gè)新的離心管中，在上清液中加入10 μg的糖原，混勻，在上清液中加入上清等體積異丙醇，-20℃孵育10 min，4℃12 000 rpm離心10 min。

1.3.1.2 RNA洗滌 離心后棄上清，留RNA沉淀，向沉淀中加入1 000 μL 75%乙醇。4℃7 500 rpm離心2 min，棄上清，放置晾干RNA沉淀。

1.3.1.3 RNA再懸浮 加入25μLH2O（Rnasefree）；55℃孵育10 min使RNA完全溶解；取少量RNA進(jìn)行0.8%瓊脂糖膠電泳，270 V 5 min。拍照，檢測(cè)RNA完整性；測(cè)定各組RNA濃度分別為：A 組 ：249.640 ng/μL，B 組 ：283.720 ng/μL，C 組 ：193.640 ng/μL，D 組：193.640 ng/μL；進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，剩余mRNA樣品放-80℃保存。

1.3.2 Dnase消化基因組DNA 取9 μL mRNA進(jìn)行Dnase消化，37℃孵育30 min，加入1 μL of RQ1 DNase Stop Solution停止酶反應(yīng)。65℃孵育10 min滅活DNase活性。反應(yīng)體系終體積10 μL，包括：RNA 8 μL，RNase-Free DNase 10X Reaction Buffer 1 μL，RQ1 RNase-Free DNase 1 μL。

1.3.3 cDNA合成 將上面經(jīng)DNase消化的mRNA用于下面的cDNA合成。

1.3.3.1 引物模板退火 混合RNA 5 μl，Oligo（dT）1 μL，Rnase free H2O 4 μL 配成終體積 10 μL。在70℃5 min。立即放入冰水混合物中冷卻5 min。在微型離心機(jī)離心10 s。放置在冰上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄混合物配制。

1.3.3.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按順序在冰上準(zhǔn)備反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物，每一個(gè)cDNA反應(yīng)體系10 μL，包括GoScriptTM5X 反應(yīng)緩沖液 4.0 μL，氯化鎂（MgCl2）3.0 μL，PCR 混合核苷酸 1.0 μL，GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶 1.0 μL，無核酸酶的水 1.0 μL。

10 μL逆轉(zhuǎn)錄混合物（第 3步制得）+10 μL RNA和引物（第1步制得）；25℃退火5 min；42℃延伸1 h；70℃5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

1.3.4 Q-PCR過程 用CFX96 Q-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min，（95 ℃10 s，60 ℃ 50s）×34個(gè)循環(huán)。RealTime反應(yīng)體系為：2×GoTaq?qPCR Master Mix：5 μL，上游引物（10 μmol/L）：0.25 μL，下游引物（10 μmol/L）：0.25 μL。cDNA 模板：2 μL，加入滅菌蒸餾水至120 μL。樣品 Real-Time PCR檢測(cè)，將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每個(gè)樣本均重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，并根據(jù)同組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算平均值。結(jié)果經(jīng)內(nèi)參均一化處理后，以空白對(duì)照組目的基因表達(dá)量為參照因子，采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，結(jié)果計(jì)算公式為：相對(duì)表達(dá)量=2-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。表達(dá)水平比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組基因的相對(duì)表達(dá)量變化，見表2。

表2 各組基因的相對(duì)表達(dá)量變化Tab.2 Changes in the relative expression of genes in each group

由表2結(jié)果可知，TRAF3基因在B組表達(dá)較低，在C和D組表達(dá)較高，B、C和D組皆低于A組（P<0.05）。RIP基因在B組表達(dá)較高，在C和D組表達(dá)較低，B、C和D組皆高于A組（P<0.05）。IRF3基因在B和C組表達(dá)較低，在D組表達(dá)較高，B、C和D組皆低于A組（P<0.05）。IL-10基因在C組表達(dá)較高，在B組次之，在D組表達(dá)較低，B、C和D組皆低于A組（P<0.05）。IFN-γ在D組表達(dá)較高，在C組次之，在B組較低，D組高于A組（P<0.05）。

3 討論

MDS的治療一直是本領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，因?yàn)镸DS兼具病態(tài)造血和原始細(xì)胞高兩大特點(diǎn)，化療目前有效率相對(duì)較低，主要也是因?yàn)橹荒芙鉀Q原始細(xì)胞高的問題，而對(duì)病態(tài)造血束手無策。因此，研究治療骨髓增生異常綜合征具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

中醫(yī)古典記載并無MDS病名，因其臨床表現(xiàn)為神疲乏力、少氣懶言、頭暈?zāi)垦?、心悸氣短、嗜睡納差、面色蒼白等氣血兩虛證，兼有午后低熱或五心煩熱、齒衄鼻衄、肌膚瘀斑瘀點(diǎn)、脅下積塊、舌淡苔薄白，脈細(xì)弱或細(xì)數(shù)等，多歸屬于“虛勞”、“血證”、“癥積”、“熱勞”、“內(nèi)傷發(fā)熱”等范疇。中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)血液學(xué)專業(yè)委員會(huì)于2008年召開專門“常見血液病中醫(yī)命名規(guī)范化研討會(huì)”，提出MDS中醫(yī)病名為“髓毒勞”，其中“髓”代表病位，“毒勞”代表病情與病性[10]。本MDS雖然臨床表現(xiàn)為血細(xì)胞減少而致的氣血虧虛之象，但其骨髓象多表現(xiàn)為增生活躍，部分患者伴有肝、脾、淋巴結(jié)腫大，應(yīng)辨證為實(shí)證、瘀證，病位在血分、骨髓，是造血器官的病變?；颊咚伢w正氣虛損，復(fù)感邪毒，邪毒內(nèi)蘊(yùn)，深伏于精血骨髓之內(nèi)，因毒致瘀，毒瘀互阻，致使機(jī)體精虧血少，形體失充，日漸羸弱，血液化生不足，故而呈現(xiàn)一派虛損之象。其病機(jī)特點(diǎn)為虛實(shí)夾雜、邪實(shí)正虛、正不勝邪、以實(shí)為主，虛實(shí)夾雜貫穿整個(gè)疾病過程[11]。

青黃散系本科在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出來的有效方藥，由青黛、雄黃組成，青黛性味咸寒，入肝經(jīng)，可消腫散瘀、涼血解毒；雄黃味辛溫，可解百毒，消積聚，化腹中之瘀血。因此青黃散具有祛邪解毒、活血化瘀之功效，適用于骨髓增生異常綜合征的臨床治療，能夠改善患者的臨床癥狀，提高生存質(zhì)量，且價(jià)格低廉。筆者已在2006年（31例）、2008年（55例）、2011（124例），2012年（30例），2014年（107例），2015年（308例）連續(xù)報(bào)道青黃散為主綜合治療MDS的結(jié)果，青黃散為主綜合治療MDS具有確切的臨床療效，總有效率 79．5%～82．3%，緩解率24．3%～26．5%[1-6]。

MDS患者存在抑癌基因高度甲基化，筆者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，青黃散治療前MDS患者的TRAF3基因甲基化程度很高，治療后顯著減低，提示含砷中藥治療的主要作用機(jī)制是去甲基化。TRAF3是腫瘤壞死因子（TNF）超家族和Toll樣/白細(xì)胞介素-1受體（Toll/IL-1 receptor，TIR）超家族重要的接頭分子，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路上的關(guān)鍵接頭分子，一方面接受外來刺激信號(hào)，另一方面又可通過其TRAF同源結(jié)構(gòu)域募集胞漿內(nèi)其它含有TRAF結(jié)構(gòu)域的基因分子來傳遞信號(hào)。而TLRs是天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁。TLRs可以通過TRAF3，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1，活化后的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)前炎性細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-1，6，8，12等）和黏附分子 CD80、CD86等基因轉(zhuǎn)錄，最終產(chǎn)生 IFN（IFN-β、IFN-α、IFN-γ）和 IL-10。干擾素的釋放可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞，IFN-γ對(duì)B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用，而且能增強(qiáng)Th1細(xì)胞的活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。IL-10等細(xì)胞因子可以促進(jìn)Th3的分化，Th3分泌的TGF-β抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，還可下調(diào)Toll樣受體（TLR4）的表達(dá)，從而間接減輕炎癥反應(yīng)，促炎性因子共同對(duì)細(xì)胞免疫進(jìn)行調(diào)控。所以TRAF3可以通過TRIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生的細(xì)胞因子及黏附分子（如：IRF3、RIP）對(duì)獲得性免疫進(jìn)行調(diào)控[12-15]。

研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)以上結(jié)果，可以得出結(jié)論：青黃散（明雄黃和靛玉紅的組合）在青黛濃度較低時(shí)可以引起 RIP 基因表達(dá)增加，TRAF3、IRF3、IL-10、IFN-γ基因表達(dá)減低，在青黛濃度較高時(shí)可以引起RIP、IFN-γ 基因表達(dá)增加，IRF3、TRAF3、IL-10 基因表達(dá)減低，都可以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ，增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，不同在于隨著青黛濃度增加，IFN-γ基因繼續(xù)上調(diào)，IL-10繼續(xù)下調(diào)，NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力繼續(xù)增強(qiáng)。所以，未來可能通過調(diào)整青黛溶液的濃度，影響MUTZ-1人細(xì)胞株的TRAF3及其信號(hào)通路，從而達(dá)到良好的治療目的。

總之，研究從基因基因水平進(jìn)一步證實(shí)了青黃散治療MDS的作用機(jī)制，豐富了青黃散等砷劑治療MDS的理論依據(jù)，將進(jìn)一步推動(dòng)筆者把藥物機(jī)制研究引向深入，促進(jìn)MDS臨床療效的提高。下一步的研究將對(duì)青黃散比例進(jìn)行細(xì)化，進(jìn)一步探討青黛和雄黃的比例與TRAF等基因的關(guān)系，為臨床調(diào)整青黃散劑量，提高療效并降低毒副作用提供客觀依據(jù)。