食用植物油中5種兒茶素類抗氧化劑的檢測(cè)方法研究

韓煥美，張愛霞，閆榮軍，鄭新華，陳 晞，何桂華

(濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局，濟(jì)南 250014)

茶多酚，又名抗氧靈、維多酚、防哈靈，是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，可分為兒茶素類(黃烷醇類)、羥基-[4]-黃烷醇類、花色苷類、黃酮類、黃酮醇類和酚酸類等[1-2]，其中以兒茶素類最為重要，占多酚類物質(zhì)總量的60%～80%。兒茶素類主要包括兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)5種物質(zhì)[3-6]。研究表明，茶多酚具有較強(qiáng)的抗氧化作用，尤其酯型兒茶素EGCG，其還原性甚至可達(dá)L-異抗壞血酸的100倍，4種兒茶素類化合物的抗氧化能力為EGCG>EGC>ECG>EC，且均強(qiáng)于丁基羥基茴香醚(BHA)，5種兒茶素類化合物的抗氧化性能均隨溫度的升高而增強(qiáng)[7-8]。因此，茶多酚提取物作為天然抗氧化劑在食用油脂中的應(yīng)用前景廣闊。GB 2760—2014明確規(guī)定茶多酚的添加量(以兒茶素計(jì))不得超過0.4 g/kg，但是相應(yīng)的檢測(cè)方法還不成熟，建立食用植物油中天然抗氧化劑的檢測(cè)方法，對(duì)于食用植物油的質(zhì)量控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

橄欖油、大豆油、花生油、調(diào)和油，均購于超市。

乙腈、甲醇、正己烷，色譜純，默克化工技術(shù)有限公司；兒茶素(C，CAS 154-23-4，純度98%)、表兒茶素(EC，CAS 490-46-0，純度98%)、表沒食子兒茶素(EGC，CAS 970-74-1，純度98%)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG，CAS 1257-08-5，純度98%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，CAS 989-51-5，純度90%)對(duì)照品，南京春秋生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為純水器制備。

Agilent1260Series液相色譜儀，配有FLD、DAD檢測(cè)器，美國安捷倫公司；分析天平(感量0.1 mg)，梅特勒-托利多公司；Milli-Q純水器，美國Millipore公司；IKA-KS130型振蕩器，德國IK公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取0.010 2 g兒茶素對(duì)照品，加入乙腈約2 mL溶解，加入甲醇-水(體積比1∶1)約1 mL促溶，振蕩使其完全溶解，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻得兒茶素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

稱取表沒食子兒茶素對(duì)照品0.010 2 g、表兒茶素對(duì)照品0.010 2 g、表兒茶素沒食子酸酯對(duì)照品0.010 2 g、表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)照品0.011 1 g，分別置于10 mL容量瓶中，加乙腈適量溶解，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻得4種兒茶素類化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液再配制質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 油脂前處理

精密稱取樣品約2.000 g，加入10 mL正己烷溶解，然后用10 mL溶劑萃取，振蕩約10 s，超聲一定時(shí)間，6 000 r/min離心10 min，取溶劑萃取層，用萃取溶劑定容至10 mL，過0.45 μm濾膜后進(jìn)行HPLC分析。

1.2.3 HPLC分析條件

Waters XTerra RP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A，乙腈；流動(dòng)相B，甲醇-水(體積比1∶9)；梯度洗脫條件見表1；流速1 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 HPLC梯度洗脫條件

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)條件優(yōu)化

GB/T 8313—2008規(guī)定了茶葉中5種兒茶素類化合物的檢測(cè)方法。在本研究過程中，首先借鑒該標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法[9]，但由于該方法是檢測(cè)茶葉中的茶多酚和兒茶素類含量，而本實(shí)驗(yàn)是針對(duì)食用植物油中可能添加的茶多酚或兒茶素類的檢測(cè)，基質(zhì)不同，所以提取方法和具體檢測(cè)條件不盡相同。

參考GB/T 8313—2008和文獻(xiàn)[9]的流動(dòng)相及洗脫梯度，選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)(油脂前處理?xiàng)l件為萃取溶劑乙腈，超聲時(shí)間25 min)對(duì)油脂中的5種兒茶素類化合物進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)基線平穩(wěn)、分離度良好，但是響應(yīng)值偏低。因此，流動(dòng)相及洗脫梯度基本確定。在此基礎(chǔ)上，研究分析了此類化合物的光譜圖。光譜數(shù)據(jù)的采集是HPLC分析過程中同時(shí)采集，波長(zhǎng)采集區(qū)間為210～640 nm。結(jié)果表明，5種兒茶素類化合物光譜圖十分相似，僅在強(qiáng)度上有細(xì)微差別，在280 nm左右有吸收峰，但不是最強(qiáng)的，230 nm左右有吸收肩峰，略強(qiáng)，波長(zhǎng)越小，吸收強(qiáng)度越強(qiáng)，因此選擇216、230、280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，然后擇優(yōu)。圖1為5種兒茶素類化合物在3個(gè)波長(zhǎng)下的液相色譜圖。

圖1 5種兒茶素類化合物對(duì)照品在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的液相色譜圖

由圖1可見，隨著檢測(cè)波長(zhǎng)的藍(lán)移，各吸收峰的強(qiáng)度逐漸變強(qiáng)，分離度不變，基線逐漸復(fù)雜，這也不難理解，很多化合物甚至溶劑在短波長(zhǎng)下有吸收，這是基線起伏不定的重要原因。因此，在做復(fù)雜基質(zhì)樣本的時(shí)候最好選擇230 nm或280 nm以減少干擾，在本研究過程中，樣本選擇的是橄欖油，紫外吸收較小，為了提高檢測(cè)靈敏度，勉強(qiáng)選擇216 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 萃取溶劑的選擇

5種兒茶素類化合物均為極性相對(duì)較強(qiáng)的化合物，具有脂溶性，也微溶于水，因此本實(shí)驗(yàn)在超聲時(shí)間15 min、萃取次數(shù)為2次的條件下，考察了甲醇-水(體積比9∶1)、乙腈-水(體積比9∶1)、乙腈- 體積分?jǐn)?shù)為0.4%的乙酸水(體積比9∶1)、乙腈作為萃取溶劑對(duì)5種兒茶素類化合物回收率的影響。結(jié)果表明：甲醇-水為萃取溶劑，5種化合物的回收率都不高，在60.4%～71.3%之間；乙腈-水為萃取溶劑，回收率在66.7%～75.6%之間；乙腈- 乙酸水為萃取溶劑，回收率在56.1%～68.6%之間；乙腈為萃取溶劑，回收率在71.2%～80.6%之間。可見，萃取溶劑中減少水或乙酸水這類強(qiáng)水溶性成分，有利于提取油脂中的目標(biāo)產(chǎn)物，因此先將正己烷和乙腈按體積比1∶1的比例混溶，待靜置分層后，可得到飽和正己烷的乙腈，然后按照上述方法提取油脂中的目標(biāo)產(chǎn)物，5種兒茶素類化合物回收率在82.4%～93.6%之間，滿足檢測(cè)需求。為了提高提取效率和簡(jiǎn)化提取步驟，采用飽和正己烷的乙腈萃取時(shí)，其他條件不變，適當(dāng)增加振蕩次數(shù)，取乙腈層后定容至10 mL，然后過濾膜上機(jī)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)回收率在79.4%～89.9%之間，并沒有顯著變化，因此不增加振蕩次數(shù)，按1.2.2操作即可。

2.2.2 超聲時(shí)間的選擇

超聲波可產(chǎn)生高速強(qiáng)力的物理作用，提高溶解效率。因此，依據(jù)文獻(xiàn)[5]及化合物本身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，本著簡(jiǎn)單便捷、減少交叉污染的原則，選擇了超聲輔助有機(jī)溶劑萃取方式。將萃取次數(shù)減少為1次，延長(zhǎng)超聲時(shí)間，加標(biāo)回收率并沒有明顯降低。因此，在固定萃取次數(shù)1次的條件下，對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。不同超聲時(shí)間下，5種兒茶素類化合物的回收率見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)5種兒茶素類化合物回收率的影響

由圖2可見，雖然個(gè)別化合物回收率在不同的時(shí)間段有明顯差異，總體而言，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)回收率增大，超聲時(shí)間延長(zhǎng)至25 min以后，加標(biāo)回收率變化不大，因此選擇超聲時(shí)間為25 min。

2.3 5種兒茶素類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照確定的樣品處理方式和檢測(cè)條件，對(duì)5種兒茶素類化合物對(duì)照品進(jìn)行了分析，得到5種兒茶素類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，如表2所示。

表2 5種兒茶素類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

2.4 方法驗(yàn)證

為了證實(shí)方法的有效性，以橄欖油為空白樣本，做了兩個(gè)梯度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，3個(gè)樣品的液相色譜圖如圖3所示。

注：1.加標(biāo)1.0 μg/mL； 2.加標(biāo)2.0 μg/mL。

由圖3可見，5種化合物吸收峰峰型尖銳，分離度良好，除ECG回收率不是特別良好，其他回收率良好，經(jīng)計(jì)算加標(biāo)回收率在80%～101.3%之間。這說明，該方法能有效檢測(cè)橄欖油中5種兒茶素類化合物。為了檢驗(yàn)該方法在食用植物油中的通用性、精密度和重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)室借助雙梯度多基質(zhì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，即每種食用植物油樣品稱取12份樣本，每6個(gè)為一組，添加5種標(biāo)準(zhǔn)使用液，使得質(zhì)量濃度為1.0、2.0 μg/mL，然后按照1.2.2操作，檢測(cè)結(jié)果見表3。由表3可見，在各食用植物油中加標(biāo)回收率均在80%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.86%～6.45%之間，精密度良好，基本滿足檢測(cè)需要。

表3 5種兒茶素類化合物加標(biāo)回收率(n=6)

3 結(jié) 論

GB 2760—2014中規(guī)定茶多酚提取物在食用植物油中添加限量為0.4 g/kg(以兒茶素計(jì))。本文通過優(yōu)化流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、萃取溶劑、超聲時(shí)間等，最終建立了5種兒茶素類化合物的檢測(cè)方法，可有效地檢測(cè)食用植物油中兒茶素類化合物，經(jīng)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)證實(shí)，5種兒茶素類化合物分離度好，吸收峰峰型尖銳，加標(biāo)回收率在80%～101.3%之間，基本滿足檢測(cè)需要。